Charakterystyka fenotypowa i molekularna krajowych szczepów

Marta Chrobocińska
CHARAKTERYSTYKA FENOTYPOWA I MOLEKULARNA
KRAJOWYCH SZCZEPÓW WIRUSÓW KRWOTOCZNEJ CHOROBY
ZAJĘCY (EBHSV) I KRWOTOCZNEJ CHOROBY KRÓLIKÓW
(RHDV)
ROZPRAWA HABILITACYJNA.
RECENZENCI:
prof. dr hab. Zdzisław Gliński (emerytowany profesor Wydziału Medycyny
Weterynaryjnej Akademii Rolniczej w Lublinie)
prof. dr hab. Antoni Kopczewski (Zakład Higieny Weterynaryjnej w Gdańsku)
prof. dr hab. Janusz Madej (Wydział Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu
Przyrodniczego we Wrocławiu)
prof. dr hab. Marian Truszczyński (emerytowany profesor PIWet-PIB, Puławy).
STRESZCZENIE
Celem pracy była charakterystyka fenotypowa i genetyczna szczepów krajowych wirusów
krwotocznej choroby zajęcy (EBHSV – European brown hare syndrome virus) i królików
(RHDV – rabbit haemorrhagic disease virus).
Właściwości fenotypowe badano w odczynie hemaglutynacji i teście ELISA (przy
zastosowaniu przeciwciał monoklonalnych: SP - specyficznych dla antygenu RHDV i CR reagujących krzyżowo z antygenami obu wirusów) oraz poprzez analizę białek wirusowych
metodą Western blot. Przeprowadzone badania 143 próbek, zbieranych od padłych królików
w latach 1993-2005, pozwoliły na określenie względnej czułości diagnostycznej odczynu HA
w porównaniu z testem ELISA, która wyniosła 68,91% i 84,87% w zależności od warunków
jego prowadzenia. Spośród 14 szczepów EBHSV jedynie 2 wykazały właściwości
hemaglutynacyjne. Analiza białek wirusowych ujawniła związek pomiędzy uzyskiwaniem
wyników ujemnych w odczynie HA oraz w teście ELISA z pulą SP Mab, a występowaniem
zjawiska degradacji proteolitycznej strukturalnego białka kapsydu o masie cząsteczkowej ok.
60 kD do białek o niższych masach cząsteczkowych. Zjawisko degradacji białka kapsydu
obserwowano również w szczepach EBHSV.
Do wykrywania materiału genetycznego wirusów oraz do ich różnicowania zastosowano
technikę łańcuchowej reakcji polimerazy po wcześniejszej odwrotnej transkrypcji RNA
wirusów do cDNA. W tych badaniach użyto startery wyselekcjonowane z regionu bardziej
konserwatywnego genu kodującego białko kapsydu, przy końcu 5’. Zastosowanie techniki
RT-PCR i nested PCR pozwoliło wykazać obecność EBHSV w 6 z 50 oraz RHDV w 16 z 20
próbek ujemnych w teście ELISA. Metody te w połączeniu z hybrydyzacją techniką
Southerna umożliwiły potwierdzenie specyficzności amplikonów oraz różnicowanie wirusów.
Zastosowana w badaniach metoda IC-RT-PCR wykazała 50-100-krotnie wyższą czułość w
porównaniu z testem ELISA.
Dalszym etapem pracy było zastosowanie analizy sekwencji i restrykcyjnej do badania
zmienności wirusów występujących w kraju. W tym celu amplifikowano, dla obu wirusów,
fragment genu kodującego białko kapsydu (VP60) w regionie o wysokiej zmienności, przy
końcu 3’. Ponadto dla dwóch szczepów EBHSV uzyskano sekwencje dla całego genu VP60.
Zmienność szczepów krajowych wyniosła 5,03% między szczepami izolowanymi w odstępie
6 lat i 7,95% - 9 lat. Przeprowadzona analiza filogenetyczna 3 szczepów krajowych EBHSV
w porównaniu do szczepów zagranicznych wykazała najbliższe pokrewieństwo szczepu z
1992 r. do standardowego szczepu francuskiego (grupa genetyczna G1), zaś 2 szczepów
izolowanych w latach 1998 i 2001 - do szczepów zagranicznych wykrytych również w
ostatnich latach (grupa genetyczna G2). Analiza przewidywanej sekwencji aminokwasów
wykazała występowanie takich samych substytucji aminokwasów w szczepach izolowanych
w ostatnich latach.
Analiza sekwencji nukleotydów 18 krajowych i 25 zagranicznych szczepów RHDV
ujawniła lokalizację szczepów krajowych w 4 z 6 grup genetycznych, zidentyfikowanych dla
RHDV. Szczep z 1993 r. był zgrupowany razem z najstarszymi szczepami europejskimi,
izolowanymi w latach 1987-90 w genogrupie G2. Większość szczepów, z lat 1994-2004,
występowała w genogrupie G5, zaś 2 szczepy (z 1994 i 1996 r.) – w G4. Dwa szczepy,
izolowane w 2004 i 2005 r., były zlokalizowane w genogrupie wariantów antygenowych
(G6). Szczepy te wykazały najwyższą różnicę w sekwencji nukleotydów (10,3%) w
porównaniu do pozostałych szczepów krajowych. Analiza przewidywanej sekwencji
aminokwasów tych szczepów ujawniła najwyższą różnicę (6,6%) w porównaniu do
pozostałych izolatów krajowych oraz obecność takich samych, charakterystycznych dla grupy
wariantów antygenowych, podstawień aminokwasów. Szczepy zlokalizowane w genogrupach
G4 i G5 również wykazały charakterystyczne dla nich zamiany aminokwasów.
Maksymalne różnice w sekwencji nukleotydów, wynoszące: 7,95% między szczepami
EBHSV oraz 10,3% między szczepami RHDV, świadczą o niskiej zmienności genetycznej w
obrębie szczepów w okresie, odpowiednio, 9 i 12 lat. Uzyskane wyniki sugerują, że
zmienność izolatów EBHSV i RHDV jest zależna raczej od czasu niż miejsca izolacji.
Przeprowadzone badania 12 krajowych szczepów wirusa EBHS (izolowanych w
latach 1992-2004) oraz 24 szczepów RHDV (z lat 1988-2005) wykazały różnice w profilach
restrykcyjnych pomiędzy szczepami. Wyniki analizy restrykcyjnej fragmentów genu VP60,
zlokalizowanych w części bardziej konserwatywnej, potwierdzają występowanie zmienności
w szczepach wirusowych.
SUMMARY
The determination of antigenic properties and genetic characteristic of European
brown hare virus (EBHSV) and rabbit haemorrhagic disease virus (RHDV) was the aim of
presented studies.
The phenotype properties were investigated in HA test and ELISA (with the use of
monoclonal antibodies: SP – specific for RHDV antigen and CR – cross reacting with
antigens of both viruses), as well as by protein analysis using Western blot method. The
results of 143 samples, collected from died rabbits, allowed to determine the relative
diagnostic sensibility of HA test to ELISA, as: 68.91% and 84.87%, according to test
conditions. Two out of 14 EBHSV strains demonstrated only the haemagglutination
properties. The analysis of virus proteins revealed the relation between negative results
obtained in HA test and ELISA with SP Mab and the presence of proteolitic degradation of
structural capsid protein with molecular mass of about 60 kD to the proteins with lower
molecular mass. The same relation was observed for EBHSV strains.
The polymerase chain reaction following the reverse transcription (RT-PCR) was used
for detection of genetic material and differentiation of both viruses. The primers selected from
more conservative region - the 5’ end of gene encoding of capsid protein were used in studies.
The presence of EBHSV in 6 out of 50 and RHDV in 16 out of 20 samples negative in ELISA
was detected by RT-PCR and nested PCR. These techniques used in connection with
hybridisation by Southern blot method, allowed to confirm the specificity of amplicons and to
differentiate the viruses. The IC-RT-PCR method used in the studies revealed the 50-100 x
higher sensitivity in comparison with ELISA.
In the next stage the divergence of virus existing in Poland with the use of sequence
and restriction analysis was studied. For these reasons, the fragment at 3’ end of gene
encoding capsid protein (VP60), located in variable region, was amplified. Moreover, for 2
EBHSV strains the sequences of VP60 gene were obtained. The divergence for VP60
nucleotide sequences of 2 Polish strains of EBHSV, isolated during 6 years, was 5.03%, as
well as for strains isolated during 9 years – 7.95%. Phylogenetic analysis of 3 Polish strains of
EBHSV and 47 foreign strains revealed that strain isolated in 1992 was clustered to standard
French strain (genetic group G1), as well as 2 strains from 1998 and 2001 were grouped in G2
together with French and Greek strains isolated during last years. Analysis of deduced amino
acid sequences demonstrated the same amino acid substitutions in EBHSV strains detected
recently.
The nucleotide sequence analysis of 18 Polish and 25 foreign strains of RHDV
revealed the localisation of Polish strains in 4 out of 6 genetic groups, identified for RHDV.
Strain detected in 1993 was clustered to G2 with the oldest European strains, isolated between
1987 and 1990. Most of Polish strains, from 1994-2004 were located in G5 and 2 strains
(from 1994 and 1996) - in G4. Two strains, isolated in 2004 and 2005, were clustered to
genogroup of new antigenic variants (G6). These strains demonstrated the highest divergence
in nucleotide sequences (10.3%) in comparison with other Polish strains. The deduced amino
acid sequence analysis revealed the highest divergence (6.6%) and the presence of the same
amino acids substitutions, characteristic for the group of antigenic variants. Isolates grouped
in G4 and G5 also demonstrated the same amino acids changes, characteristic for these
groups.
The maximum nucleotide divergence between EBHSV strains (7.95%) and RHDV
strains (10.3%) indicated the little genetic variation among strains over 9 and 12 year-period,
respectively. The presented results suggest that variation of EBHSV and RHDV strains is
related rather to time than to place of their isolation.
The studies revealed the differences in restriction profiles between 12 Polish strains of
EBHSV (isolated between 1992 and 2004) and 24 strains of RHDV (from 1988 to 2005). The
results of restriction analysis of the conserved fragment of VP60 gene confirmed the
divergence between strains.