Aktywność transkrypcyjna genów kodujących enzymy

&ARM0RZEGL.AUK†
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
!KTYWNOu¿TRANSKRYPCYJNAGENÌWKODUJ’CYCHENZYMY
ODPOWIEDZIALNEZADETOKSYKACJÃKSENOBIOTYKÌW
UCHORYCHNANOWOTWÌRKRTANI
4RANSCRIPTIONACTIVITYOFGENESENCODEDENZYMESRESPONSIBLE
FORXENOBIOTICSDETOXICATIONATPATIENTSWITHLARYNXCANCER
0IOTR5RBANIEC*OLANTA!DAMSKA'RA˜YNA*ANIKOWSKA
2OBERT+WIATKOWSKI5RSZULA-AZUREK
+ATEDRAI+LINIKA,ARYNGOLOGII+ATEDRAI:AKŒAD"IOLOGII-OLEKULARNEJ:AKŒAD#HEMII!NALITYCZNEJ
gL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
Streszczenie
Summary
Określono aktywność transkrypcyjną genów kodujących
białka z rodziny cytochromu P450 biorące udział w procesach detoksykacji ksenobiotyków, których metabolity
mogą inicjować procesy kancerogenezy w krtani. Materiałem do badań były wycinki z guzów nowotworowych
krtani oraz wycinki z makroskopowo zdrowych tkanek
pobranych po resekcji krtani od 25 chorych na nowotwory
regionu głowy i szyi, w których techniką QRT-PCR wyznaczano liczbę kopii mRNA CYP1A1, 1A2, 1B1 i 19A1
w μg całkowitego RNA. Dodatkowo dla genu CYP1A1
analizowano aktywność transkrypcyjną w grupach homo
i heterozygot. W tkance zdrowej dla typu polimorficznego
homozygotycznego CYP1A1 w porównaniu do typu heterozygotycznego obserwowano zwiększoną aktywność
transkrypcyjną genu (p=0,036). Porównując stosunek liczby kopii mRNA CYP1A2; 1B1 oraz 19A1 do mRNAβaktyny w każdym przypadku tkanki nowotworowej krtani
obserwowano większe wartości w porównaniu do tkanki
zdrowej, przy czym różnice istotne statystycznie (p≤0,05)
obserwowano jedynie dla heterozygot 1A1* i 1A2 co sugeruje ich udział w transformacji nowotworowej krtani.
Transcription activity of genes coding enzymes from family of cytochrome P450 which detoxifing xenobiotics, of
which metabolites can devise cancerogenesis processes
in tissue of larynx were qualified. Material to investigations was the segments of larynx cancer and the segments
from macroscopic healthy tissues received after resection
of larynx at patients with cancer in region of head or neck.
Samples of tissues received from 25 patients. Expression
of genes CYP1A1, 1A2, 1B1 and 19A1were measured by
quantitative estimation on RT-QPCR TaqMan technics. For
type of polimorphic homozygotic CYP1A1 was observed
statistical enlarged characteristic (p=0, 036) of gene expression in healthy tissue, contrary to heterozygotic type.
Relation values mRNA CYP1A2 as 1B1 and 19A1 to values mRNA beta-actine in every chance of larynx cancer tissue was greater than for healthy tissues, at what statistical
essential ( p≤ 0,05) only for heterozygotic 1A1* and 1A2.
Observed effects of fall or of height of CYP1A1 expression dependent on type of polimorphic gene (homozygote
or heterozygote), what can enlarged susceptibility of these
patients on cancerogenesis process in investigated tissue.
Transcription activity of CYP1A2 which taking participation also in metabolism of carcinogenic xenobiotics can
enlarge the risk of falling the patients on cancer of larynx,
similarly as described this fact in brest cancer.
Słowa kluczowe: rak krtani, CYP 1A1, CYP1A2, CYP1B,
CYP19A1
Key words: larynx cancer, CYP 1A1, CYP1A2, CYP1B,
CYP19A1
'‚–|ª-J®RylR
Organizm ludzki poddawany działaniu różnych ksenobiotyków znajdujących się w aerozolu zanieczyszczonego
powietrza, takich jak WWA (wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne) lub inne, wchłania je i poprzez kolejne
reakcje z udziałem enzymów detoksykacyjnych z rodziny
cytochromu P450 (CYP) powstają z nich pochodne o charakterze hydrofilnym, które niejednokrotnie po metabolicznej aktywacji mogą być kancerogenne. Przykładem takim
jest np. benzo(a)piren, który przekształcony z udziałem CYP
do np. 7, 8-dihydrodiolu zapoczątkowuje proces kancerogenezy [1]. Benzo(a)piren (BaP) zaburza również homeostazę steroidową [2]. Indukuje on CYP1A1/2 i 1B1, które
biorą udział nie tylko w jego biotransformacji, ale również
w biosyntezie endogennych hormonów i biotransformacji
egzogennych (estrogeny) [3]. Biotransformacja hormonów
płciowych i ksenobiotyków może mieć taki sam początek,
a mianowicie związki te mogą łączyć się zamiennie z jądrowymi receptorami estrogenowymi (ER) lub progesteronowymi (PR) lub androgenowymi (AR) albo cytoplazmatycznym receptorem węglowodorów aromatycznych (AhR).
&ARM0RZEGL.AUK
Dlatego też nazywane one są estrogenami środowiskowymi
lub ksenoestrogenami [4]. W hormonozależnych tkankach
(piersi, jajniki i macica u kobiet a jądra i gruczoł krokowy
u mężczyzn) procesy nowotworzenia mogą być inicjowane
przez ksenoestrogeny, do których należą m.in. WWA oraz
inne węglowodory znajdujące się w dymie papierosowym
[5]. Zamienność tej drogi objawia się zmniejszeniem aktywności aromatazy (CYP19A1) w tych tkankach [6]. Aromataza jest kluczowym enzymem biosyntezy hormonów steroidowych, bierze udział w konwersji androgenów (testosteronu, androstendionu) w estrogeny (estron, 17β-estradiol) [7].
Niezaprzeczalnym jest, że dym papierosowy i zanieczyszczenia środowiskowe przyczyniają się do powstawania raka
krtani [8], najczęstszego nowotworu głowy i szyi, drugiego
po raku płuca nowotworu dróg oddechowych powiązanego
z paleniem tytoniu [9, 10]. Od aktywności transkrypcyjnej
wielu genów zależy stopień osobniczej wrażliwości na kancerogenne pochodne.
Celem tej pracy była ocena różnic aktywności transkrypcyjnej genów z rodziny cytochromu CYP1A1 (homo
i heterozygot), CYP1A2, CYP1B, CYP19A1 uczestniczące
w procesach kancerogenezy wielu nowotworów poprzez
ich udział w metabolizmie ksenobiotyków, w guzach krtani
i tkance prawidłowej,
Ryc. 1. Obraz elektroforegramu przedstawiający A). polimorfizm genu CYP1A1 homozygota i 1A1* heterozygota B)
wynik oceny jakościowej ekstraktów RNA marker wielkości
DNA pBR322/HaeIII
- R–l-t¬ŸlŸuR |J¬
Profil ekspresji genów kodujących białka cytochromu
P450 i polimorfizm genu CYP1A1 wyznaczano w wycinkach guzów nowotworowych krtani oraz w tkankach ocenionych histopatologicznie jako prawidłowe (kontrola), pobranych od 25 chorych po resekcji krtani, leczonych w II Katedrze i Klinice Laryngologii SAM w Zabrzu (Na pobranie
wycinków otrzymano zgodę komisji biotycznej ŚAM obecnie SUM). Po rozdrobnieniu i mechanicznej homogenizacji
tkanki przy użyciu homogenizatora Polytron® (Kinematyka
AG, Szwajcaria) z homogenatów ekstrahowano genomowy
DNA przy użyciu zestawu Genomic Mini z zastosowaniem
kolumienek (AKOR Laboratories, Polska), zgodnie z protokołem producenta, w celu wyznaczenia polimorforfizmu
genu CYP 1A1 oraz ekstrahowano całkowity RNA z zastosowaniem odczynnika TRIzol® (Invitrogen Life Technologies, Kalifornia, USA) zgodnie z protokołem producenta,
w celu wyznaczenia aktywności transkrypcyjnej badanych
genów. Otrzymany ekstrakt RNA oczyszczano również
zgodnie z protokołem producenta stosując zestaw RNease–
Free Dnase Set (Qiagen) zawierający DNazę I, bufor RDD
i kolumny Rneasy Mini Spin Column. Po zakończeniu ekstrakcji otrzymane kwasy nukleinowe oceniano jakościowo
techniką elektroforezy agarozowej (ryc.1) oraz jakościowo
metodą spektrofotometryczną z zastosowaniem spektrofotometru GeneQuant II (Pharmacia Biotech). Pomiaru dokonano
w kuwetach kwarcowych o drodze optycznej 1 cm. Wynik
pomiaru absorbancji równy 1 (OD) jest charakterystyczny
dla roztworu RNA o stężeniu 40μg/ml lub dla DNA 50 μg/
ml. Oczyszczone ekstrakty były matrycą w ocenie jakościowej i ilościowej profilu stężeń mRNA CYP1A1, 1A2, 1B1
i 19A1 zarówno w guzie, jak i w kontoli. Ilościową ocenę
aktywności transkrypcyjnej genów przeprowadzono techniką RT-QPCR TaqMan z wykorzystaniem starterów i sond
Ryc. 2
A) Wynik QRT-PCR (obraz kinetyki RT-PCR) wykonanej
dla każdej próby w trzech powtórzeniach. 1, 2 i 3 – dla
RNA CYP 1A1*; 4, 5 i 6 – dla mRNA kontroli endogennej
β-aktyny oraz 7, 8 i 9 – dla mRNA CYP1A1
B) Krzywa standardowa wykreślona dla wzorca wtórnego
(standardy β-aktyny)
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
jak i 1B1 oraz 19A1 do do liczby kopii
mRNA β-aktyny w każdym przypadku
tkanki nowotworowej krtani był większy niż dla tkanki zdrowej, przy czym
istotne statystycznie róznice (p≤0,05)
obserwowano jedynie jedynie dla heterozygot 1A1* i 1A2.
|J˜¥u|ª-ylR
Obserwowane efekty spadku lub
wzrostu ekspresji CYP1A1 uzależnione
były od typu polimorficznego genu (homozygota, heterozygota), co może łączyć się ze zwiększoną podatnością tych
pacjentów na proces nowotworzenia
w badanej tkance.
Ryc. 3. Profil ekspresji genów kodujących białka z rodziny cytochromu P450
Wykazano istotną statystyczw wycinkach krtani; ca – rak, control – wycinki krtani oceniane
nie
niską
aktywność transkrypcyjną
na podstawie analizy histopatologicznej jako prawiodłowe
CYP1A2, biorącego udział również
w metabolizmie kancerogennych ksehybrydyzacyjnych wyznakowanych barwnikami fluorescennobiotyków,
w tkankach, w których histopatolocyjnymi FAM i TAMRA zaprojektowane i wykonanne przez
gicznie
nie
stwierdzona
obecności komórek nowoAplera. Otrzymane wyniki amplifikacji β-aktyny (kontroli
tworowych.
endogennej) stanowiły podstawę do włączenia wyznaczone Nie wykazano znaczących zmian ekspresji CYP1B1
go profilu stężeń mRNA dla określonego wycinka do analizy
i CYP19A1 w pobranych tkankach, co może świadporównawczej (ryc 2A). Liczbę kopii mRNA wyznaczano
czyć o braku ich udziału w tym przypadku w procena podstawie wyników wzorca β-aktyny (Applera) wykosie nowotworzenia krtani.
rzystywanego przez detektor sekwencji ABI PRISMTM 7700
do automatycznego wykreślenia krzywej standardowej dla
każdej analizy (ryc. 2B), a następnie wyliczał ilość kopii
cDNA badanego mRNA. Otrzymane fragmenty rozdzielono
elektroforetycznie w 10% żelu poliakrylamidowym i wybarwiono solami srebra. Analizę statystyczną otrzymanych
wyników przeprowadzono w programie Statistica 7.0 przy
p ≤ 0,05.
'¬ylpl
Część eksperymentalną pracy rozpoczęto od wyznaczenia typu polimorficznego genu CYP1A1 w wycinkach
z guzów nowotworowych krtani oraz wycinkach zdrowych
tkanek pobranych po resekcji krtani u chorych na nowotwory regionu głowy i szyi. Otrzymane wyniki wykazały
obecność jednego typu homozygoty CYP1A1 i heterozygoty CYP1A1* (ryc. 1) zarówno w tkankach zdrowych, jak
i nowotworowych. W kolejnym etapie badań dla wszystkich wycinków krtani wyznaczano profil ekspresji genów
CYP1A1, 1A1*, 1A2, 1B1 i 19A1. Miarą aktywności transkrypcyjnej była liczba kopii mRNA danego transkryptu
w 1μg całkowitego RNA. Porównując aktywność transkrypcyjną badanych genów zaobserwowano zwiększoną
statystycznie znamienną (p=0,036) ekspresję genu CYP1A1
w tkance zdrowej dla typu polimorficznego homozygotycznego, odwrotnie niż dla typu heterozygotycznego. W obu
przypadkach nie zaobserwowano statystycznie znamiennej
korelacji (r=0,58 i r=0,11) pomiędzy otrzymanymi wynikami w badanych grupach tkanki zdrowej i nowotworowej.
Takie porównanie charakteryzujące się wysokim stopniem skorelowania danych (r=0,997) otrzymano jedynie dla CYP1A2. Stosunek liczby kopii mRNA CYP1A2,
Piśmiennictwo
1. Tornqvist M., Ehrenberg L. On cancer risk estimation of
urban air polution. Environ. Health Perspect. 1994, 102
(4): 173-182.
2. Chang LW, Chang YC, Ho CC, Tsai MH, Lin P. Increase of carcinogenic risk via enhancement of cyclooxygenase-2 expression and hydroxyestradiol accumulation
in human lung cells as a result of interaction between
BaP and 17-beta estradiol. Carcinogenesis. 2007, 28
(7):1606-12.
3. Patel RD, Hollingshead BD, Omiecinski CJ, Perdew
GH. Aryl-hydrocarbon receptor activation regulates constitutive androstane receptor levels in murine and human
liver. Hepatology. 2007, 46 (1):209-18.
4. Toppari J., Larsen J.C., Christiansen P., Giwercman
A., Grandjean P., Guillette L.J., Jr, B Jégou B., Jensen T.K., Jouannet P., Keiding N., Leffers H., McLachlan J.A., Meyer O., Müller J., Rajpert-De Meyts
E., Scheike T., Sharpe R., Sumpter J., Skakkebaek
N.E. Male reproductive health and environmental
xenoestrogens. Environ. Health Perspect. 1996, 104
(4): 741–803.
5. Liu S., Abdelrahim M., Khan S., Ariazi E., Jordan V.C.,
Safe S. Aryl hydrocarbon receptor agonists directly activate estrogen receptor alpha in MCF-7 breast cancer
cells. Biol Chem. 2006, 387 (9):1209-13.
6. Patel MR, Scheffler BE, Wang L, Willett KL. Effects of
benzo(a)pyrene exposure on klifish (Fundulus heteroclitus) aromatase activities and mRNA. Aquat Toxicol.
2006, 77 (3):267-78.
&ARM0RZEGL.AUK
7. Hayes TB, Stuart AA, Mendoza M, Collins A, Noriega N, Vonk A, Johnston G, Liu R, Kpodzo D. haracterization of atrazine-induced gonadal malformations in African clawed frogs (Xenopus laevis) and
comparisons with effects of an androgen antagonist
(cyproterone acetate) and exogenous estrogen (17beta-estradiol): Support for the demasculinization/feminization hypothesis. Environ Health Perspect. 2006,
114 (1):134-41.
8. Gandini S, Botteri E, Iodice S, Boniol M, Lowenfels AB,
Maisonneuve P, Boyle P. Tobacco smoking and cancer: a
meta-analysis. Int J Cancer. 2008, 122 (1):155-64.
9. Bosetti C, Bertuccio P, Levi F, Lucchini F, Negri E, La Vecchia C. Cancer mortality in the European Union, 1970-2003,
with a joinpoint analysis. Ann Oncol. 2008, 19 (4):631-40.
10. Bartsch H, Nair U, Risch A, Rojas M, Wikman H, Alexandrov K. Genetic polymorphism of CYP genes, alone or in
combination, as a risk modifier of tobacco-related cancers.
Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2000, 9 (1):3-28.
Adres do korespondencji:
Dr hab. Urszula Mazurek
Katedra i Zakład Biologii Molekularnej
Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,
Śląski Uniwersytet Medyczny