POZYSKIWANIE PRZECIWCIAŁ KLASY Y Z JAJ KUR

Acta Sci. Pol., Medicina Veterinaria 12 (1) 2013, 17-28
ISSN 1644–0676 (print) ISSN 2083–8670 (on-line)
POZYSKIWANIE PRZECIWCIAŁ KLASY Y
Z JAJ KUR IMMUNIZOWANYCH
EPITOPEM BIAŁKA EFB
ZE STAPHYLOCOCCUS AUREUS1
Maciej Walczak, Agnieszka Łupicka-Słowik, Daria Nowak,
Marcin Sieńczyk
Politechnika Wrocławska
Streszczenie. Immunoglobuliny Y pozyskiwane z żółtek kurzych jaj, ze względu na nieinwazyjną i wydajną metodę izolacji, stanowią interesującą alternatywę dla powszechnie
stosowanych ssaczych przeciwciał klasy G. Kurze IgY nie wykazują reaktywności wobec
czynnika reumatoidalnego, nie wiążą się z receptorami FC oraz składnikami ludzkiego układu dopełniacza. Dlatego też ich zastosowanie istotnie ogranicza możliwość uzyskiwania
fałszywie pozytywnych wyników w testach serologicznych, które często obserwowane są
w przypadku stosowania ssaczych przeciwciał klasy G.
Celem przedstawionych badań było otrzymanie przeciwciał IgY skierowanych wobec epitopu białka Efb do zastosowań w diagnostyce infekcji Staphylococcus aureus. Immunizację
przeprowadzono przy użyciu koniugatu peptydowego fragmentu białka Efb obejmującego reszty 145–162 z białkiem nośnikowym (KLH), natomiast do określenia reaktywności
otrzymanych przeciwciał zastosowano koniugat Efb(145–162)-BSA.
Izolację przeciwciał IgY z żółtek jaj przeprowadzono, stosując metodę wytrącania glikolem polietylenowym (PEG 6000). Wydajność izolacji wyniosła około 120 mg IgY/żółtko, natomiast czystość otrzymanych przeciwciał mieściła się w zakresie 85–95%. Dalsze
oczyszczanie na drodze filtracji żelowej pozwoliło na istotne zwiększenie ich czystości.
Przeprowadzona analiza wykazała produkcję specyficznych przeciwciał IgY.
Słowa kluczowe: immunoglobuliny Y, immunizacja, ELISA, Staphylococcus aureus,
peptydowy antygen, białko Efb
© Copyright by Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Adres do korespondencji – Corresponding author: Maciej Walczak, Politechnika Wrocławska,
Wydział Chemiczny, Zakład Chemii Medycznej i Mikrobiologii, Wybrzeże Wyspiańskiego 27,
50-370 Wrocław
18
M. Walczak i in.
WSTĘP
Przeciwciała klasy Y (IgY) stanowią główną klasę przeciwciał wytwarzanych przez płazy, gady, ptaki oraz ryby dwudyszne, u których pełnią istotną rolę w humoralnej odpowiedzi układu odpornościowego [Leslie i Clem 1969]. W celu zapewnienia biernej ochrony
immunologicznej pisklętom immunoglobuliny Y transportowane są z krwi do żółtka jaja
[Elazab i in. 2009]. Uzyskana w ten sposób odporność chroni pisklęta przez okres około
2 tygodni od wyklucia, co daje czas na pełne rozwinięcie układu immunologicznego,
zapobiegając m.in. rozwinięciu infekcji bakteryjnych. Pasaż IgY do kul żółtkowych regulowany jest przez nabłonek oocytu, który w trakcie wzrostu kul staje się bardziej płaski
i cieńszy, umożliwiając przejście przeciwciał na 3–4 dni przed owulacją, przy czym późniejszy rozwój błony witelinowej hamuje dalszy transport przeciwciał [Rose i in. 1974].
W żółtku magazynowane są wyłącznie przeciwciała IgY, natomiast w białku jaj obecne
są także immunoglobuliny klasy A oraz M [Mayo i in. 2009].
IgY uznane są za ewolucyjnych przodków ssaczych IgG (podobieństwo funkcjonalne) oraz IgE (podobieństwo strukturalne) [Warr i in. 1995, Taylor i in. 2008]. Masa molekularna cząsteczki IgY składającej się z dwóch łańcuchów ciężkich oraz dwóch łańcuchów lekkich wynosi około 180 kDa. Łańcuch ciężki zbudowany jest z jednej domeny
zmiennej (V, ang. variable) i czterech domen stałych (C, ang. constant). W skład łańcucha lekkiego wchodzi jedna domena zmienna i jedna domena stała. Przeciwciała klasy
Y, w przeciwieństwie do przeciwciał IgG ssaków, nie posiadają regionu zawiasowego
nadającego cząsteczce elastyczność [Michael i in. 2010].
Kurze przeciwciała IgY stanowią alternatywę dla rutynowo wykorzystywanych
w diagnostyce ssaczych przeciwciał IgG [Camenisch i in. 1999]. Zastosowanie immunoglobulin Y w testach serologicznych pozwala na znaczną redukcję fałszywie pozytywnych wyników, których potencjalnym źródłem mogą być oddziaływania ssaczych
immunoglobulin ze składnikami surowicy. Przeciwciała Y pozbawione są reaktywności
z czynnikiem reumatoidalnym, receptorami FC oraz elementami ludzkiego układu dopełniacza [Carlander i in. 2000]. Dodatkową zaletą jest nieinwazyjny sposób ich pozyskiwania z żółtek jaj – nie ma konieczności skrwawiania zwierząt, co ma miejsce w przypadku
izolacji ssaczych immunoglobulin, a także ilość możliwa do uzyskania od jednego zwierzęcia. Przykładowo, w ciągu czterech tygodni można otrzymać około 200 mg króliczych
przeciwciał IgG (spośród których około 5% stanowią antygenowo-specyficzne przeciwciała), natomiast w tym samym okresie z żółtek jaj otrzymać można 1500 mg przeciwciał
IgY o zawartości specyficznych przeciwciał mieszczącej się w przedziale od 2% do 10%
[Schade i in. 1996]. Jednym z ograniczeń związanym z izolacją IgY jest ich brak zdolności wiązania z białkiem G (Streptococcus sp.) oraz białkiem A (Staphylococcus sp.), które
rutynowo używane są do oczyszczania przeciwciał ssaczych [Barkas i Watson 1979].
Z tego też powodu w ostatnich latach opracowano szereg wydajnych metod izolacji IgY
z żółtek jaj.
Do najczęściej stosowanych metod izolacji przeciwciał IgY z żółtek kurzych jaj należą
techniki strąceniowe oraz metody chromatograficzne. Jako czynnik strącający powszechnie używany jest siarczan amonu [Ko i Ahn 2007], czasem w połączeniu z dodatkowymi
składnikami jak kwas kaprylowy [Mc Laren i in. 1994) czy κ-karagenian w obecności
chlorku wapnia [Tan i in. 2012]. W celu usunięcia tłuszczy stosuje się mieszaninę alkoholu izopropylowego oraz acetonu [Bade i Stegemann 1984]. Jedną z częściej stosowanych
Acta Sci. Pol.
Pozyskiwanie przeciwciał klasy Y...
19
metod chromatograficznych jest chromatografia jonowymienna, jednak, w przeciwieństwie do metod strąceniowych, wykorzystywana jest głównie do oczyszczania niewielkich ilości końcowych produktów izolacji [Ko i Ahn 2007].
Przeciwciała IgY znalazły do tej pory liczne zastosowania w diagnostyce infekcji
bakteryjnych zwierząt i ludzi. Meenatchisundaram i in. wykazali, że przeciwciała IgY
specyficzne wobec bakterii Escherichia coli mogą potencjalnie być wykorzystane do detekcji i terapii zapalenia gruczołu mlecznego u bydła [Meenatchisundaram i in. 2011].
Specyficzne IgY mogą służyć w profilaktyce infekcji bydlęcym syncytialnym wirusem
oddechowym (BRSV, ang. bovine respiratory syncytial virus) [Ferella i in. 2012] czy neutralizacji toksyny Stx Escherichia coli [Parma i in. 2011]. Co więcej, pasywna immunizacja myszy przeciwciałami specyficznymi wobec bakterii Helicobacter pylori skutkowała
zahamowaniem infekcji oraz zmniejszeniem stanu zapalnego błony śluzowej żołądka
[Attallach i in. 2009].
Celem przedstawionych badań było otrzymanie przeciwciał IgY specyficznych wobec
peptydowego epitopu białka Efb (Efb, ang. extracellular fibrinogen-binding protein), które należy do zewnątrzkomórkowych czynników wirulencji wydzielanych przez bakterie
Staphylococcus aureus. Efb zdolne jest do wiązania składnika C3 systemu dopełniacza, co
w konsekwencji prowadzi do upośledzenia mechanizmów odpornościowych organizmu.
Z drugiej strony, Efb wiążąc się z fibrynogenem, uławia kolonizację bakterii w tkankach
gospodarza [Lee i in. 2004]. Ponadto Efb wykazuje cechy superantygenu, który w sposób
nieklasyczny stymuluje limfocyty T [Lambris 1988]. Gen efb obecny jest we wszystkich
wyizolowanych do tej pory szczepach Staphylococcus aureus, natomiast nie stwierdzono jego obecności u przedstawicieli innych gatunków z rodzaju Staphylococcus [Boden
i Flock 1995]. Ma to więc istotne znaczenie z punktu widzenia diagnostyki infekcji bakterii Staphylococcus aureus, w której kluczowym elementem może być detekcja konstytutywnego, gatunkowo specyficznego białka w płynach ustrojowych organizmu.
W niniejszej pracy przedstawiono wytwarzanie, izolację oraz analizę specyficzności
kurzych immunoglobulin klasy Y skierowanych wobec epitopu białka Efb obejmującego
reszty 145–162 [Efb(145–162)].
MATERIAŁ I METODY
Przygotowanie antygenu
Docelowy epitop białka Efb, wybrany przy wsparciu metod obliczeniowych, wykazywał
α-helikalną strukturę drugorzędową oraz charakteryzował się potencjalnie wysoką immunogennością i obejmował reszty aminokwasowe od 145 do 162 (zgodnie z numeracją
sekwencji gi: 21282769 zdeponowanej w bazie GenBank). Docelowy polipeptyd otrzymano na drodze syntezy na podłożu stałym, stosując żywicę chlorotrytylową (H2N-Gly-2Cl-Trt, IRIS Biotech, Niemcy) w strategii Fmoc/Boc, a następnie oczyszczono do homogenności przy użyciu chromatografii HPLC (roztwór A 0,05% TFA w wodzie, roztwór
B 0,05% TFA w acetonitrylu; gradient liniowy: 95% A i 5% B do 5% A i 95% B, 30 min;
kolumna Discovery® BIO Wide Pore C8, Supelco) i zanalizowano przy użyciu wysokorozdzielczej spektrometrii masowej (m/z 1115,6342, 744,0920/1115,6200, 744,0493).
Do struktury peptydu wprowadzono N-terminalną resztę cysteiny, umożliwiając jego
późniejszą koniugację do hemocyjaniny (KLH, ang. keyhole limpet hemocyjanin, Merck,
Medicina Veterinaria 12 (1) 2013
20
M. Walczak i in.
Polska) oraz albuminy wołowej (BSA, ang. bovine serum albumin, Sigma, Polska) przy
użyciu GMBS (Pierce, Polska) jako heterodwufunkcyjnego łącznika, uzyskując podstawienie: 690,53 peptyd/KLH (mol/mol) oraz 3,4 peptyd/BSA (mol/mol). Otrzymane
koniugaty eptiop-białko nośnikowe oczyszczono na drodze filtracji żelowej (10DG, Bio-Rad, Polska).
Immunizacja zwierząt
Dwie grupy 22-tygodniowych kur rasy White Leghorn (Fermy Drobiu Woźniak) poddano 2-tygodniowej aklimatyzacji, a następnie immunizowano domięśniowo (musculus
pectoralis). Grupa eksperymentalna (4 zwierzęta) otrzymała iniekcję koniugatu KLHEfb(145–162) w ilości 100 μg na zwierzę (w przeliczeniu na ilość peptydu) w roztworze
soli fizjologicznej oraz pełnego adiuwantu Freunda (MP Biomedicals, USA). Po 4 i 8
tygodniach od momentu pierwszej immunizacji kury otrzymały dawki przypominające
w ilości równej połowie wyjściowej dawki antygenu. Grupa kontrolna (2 zwierzęta) otrzymały iniekcję mieszaniny soli fizjologicznej i pełnego adiuwantu Freunda (także po 4 i 8
tygodniach). Doświadczenie prowadzono za zgodą II Lokalnej Komisji Etyki do Spraw
Doświadczeń na Zwierzętach Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu (52/2010).
Zwierzęta poddane były standardowemu programowi szczepień, ostatnie szczepienie wykonano w 16. tygodniu życia kur (pomór rzekomy drobiu, zakaźne zapalenie oskrzeli,
syndrom spadku nieśności).
Izolacja przeciwciał
Jaja kolekcjonowano codziennie i przechowywano w temperaturze 4°C do momentu
izolacji. W trakcie trwania eksperymentu wyizolowano przeciwciała z 537 (grupa docelowa) oraz 246 jaj (grupa kontrolna). Izolację przeciwciał prowadzono, opierając się
na metodzie strącania glikolem polietylenowym PEG 6000 z drobnymi modyfikacjami
[Polson i in. 1980]. Jaja przemyto 50% roztworem izopropanolu, oddzielono żółtko od
białka, zawartość woreczka żółtkowego przeniesiono do probówki wirówkowej, a następnie rozcieńczono pięciokrotnie buforem PBS (pH 7.4) zawierającym 4.375% (w/v)
PEG 6000 (VWR, Polska). Po dokładnym wymieszaniu zawartość wirowano (4750×g,
15 min, 4°C), a otrzymany supernatant przesączono przez sączek bibułowy (Whatman no.
1, Sigma, Polska). Do przefiltrowanego supernatantu dodano glikol polietylenowy PEG
6000 do końcowego stężenia 8.5% (w/v). Po dokładnym rozpuszczeniu roztwór wirowano (4750×g, 15 min, 4°C), otrzymany osad dokładnie rozpuszczono w 10 ml buforu PBS
(pH 7.4) i dodano PEG 6000 (1,2 g). Roztwór poddano kolejnemu wirowaniu, a otrzymany osad przeciwciał IgY rozpuszczono w 5 ml buforu PBS. W każdym izolacie IgY oznaczono całkowite stężenie białek (A280) i przechowywano w -20°C. Czystość otrzymanych
przeciwciał określono elektroforetycznie w warunkach nieredukujących (SDS-PAGE,
4–12%), stosując następnie barwienie barwnikiem Coomassie R-250 (Merck, Polska).
W celu usunięcia zanieczyszczeń obecnych w izolacie roztwór przeciwciał poddano
filtracji żelowej przy wykorzystaniu złoża Sephadex G-100 (Pharmacia, Szwecja) zgodnie z procedurą opisaną przez producenta. Na złoże naniesiono 500 μg przeciwciał (100
μl), kolumnę przemywano buforem PBS, a obecność przeciwciał w zebranych frakcjach
potwierdzono testem Coomassie Plus (Thermo Scientific, Polska) oraz elektroforetycznie
(SDS PAGE, 4–12%, warunki nieredukujące), stosując barwienie srebrem. Wizualizację
przeprowadzono przy użyciu systemu obrazowania molekularnego GelLogic 1500 (Carestream, USA).
Acta Sci. Pol.
Pozyskiwanie przeciwciał klasy Y...
21
Wykrywanie swoistych IgY przeciwko epitopowi białka Efb(145–162)
Analizę odpowiedzi immunologicznej kurcząt na podany antygen KLH-Efb(145–162)
w trakcie trwania procesu immunizacji wykonano przy użyciu testu ELISA. W tym celu
96-dołkowe płytki mikrotitracyjne (Nunc-Immuno™ MicroWell™, VWR, Polska) pokryto koniugatem BSA-Efb(145–162) (50 ng peptydu/100 μl) w buforze węglanowym
(50 mM, pH 9.6) i inkubowano w 4°C przez 12 godzin. Wolne miejsca zablokowano
przy użyciu 10% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBS (4°C, 12h). Po usunięciu czynnika blokującego naniesiono specyficzne oraz kontrolne IgY (1:100) przygotowane w 0.5% roztworze mleka odtłuszczonego w buforze PBS zawierającym 0.05%
(v/v) Tween-20 (PBST, 10 mM, pH 7.4) i inkubowano w temperaturze 37°C (1h). Detekcję kompleksów Efb(145–162)-IgY wykonano przy użyciu przeciwciał króliczych
anty-IgY sprzężonych z peroksydazą chrzanową (1:5000; Fitzgerald, USA), stosując
O-fenylenodiaminę jako chromogeniczny substrat. Pomiaru absorbancji dokonano przy
długości fali 490 nm (Multiskan FC, Thermo Scientific, Polska). Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach. Wyniki przedstawiono po odjęciu wartości uzyskanych
dla przeciwciał kontrolnych. Wykonano analizę otrzymanych danych za pomocą programu GraphPad Prism v5.0 (GraphPad Sowtware Inc., USA) Wartości statystycznie istotne
(p<0.005, t-test) uzyskano od 5. tygodnia immunizacji.
Mianowanie przeciwciał specyficznych wobec białka Efb(145–162)
Miano wyizolowanych przeciwciał klasy IgY specyficznych wobec Efb(145–162) określono w technice Western blot oraz ELISA. Rozdzielony elektroforetycznie koniugat
BSA-Efb(145–162) (50 ng peptydu/studzienkę, SDS-PAGE, 4–12%, warunki redukujące) przeniesiono na membranę nitrocelulozową, którą inkubowano z roztworem specyficznych lub kontrolnych immunoglobulin Y (1 μg/ml do 100 μg/ml) w 0,5% mleku
odtłuszczonym w PBST. Detekcji kompleksów antygen-przeciwciało dokonano przy
użyciu przeciwciał króliczych anty-IgY-HRP (1:5000, Fitzgerald, USA) i zastosowaniu
chemiluminescencyjnego substratu (SuperSignal West PICO, Thermo, Polska). Detekcję sygnału przeprowadzono przy użyciu systemu obrazowania molekularnego GelLogic
1500 (Carestream, USA).
W celu wyznaczenia miana immunoglobulin Y w teście ELISA 96-dołkową płytkę
mikrotitracyjną opłaszczono BSA-Efb(145–162) w ilości 50 ng peptydu/dołek. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących przeprowadzono inkubację z roztworem specyficznych lub kontrolnych IgY (od 0.1 μg/ml do 250 μg/ml. Detekcję kompleksów antygen-przeciwciało przeprowadzono przy użyciu przeciwciał króliczych anty-IgY-HRP
(1:5000) i zastosowaniu chromogenicznego substratu (O-fenylenodiamina, OPD) jak
opisano powyżej. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach, a wyniki zostały przedstawione jako indeks ELISA (EI, EI=ODpróbka/ODkontrola), gdzie wartości EI>1.2
określono jako pozytywne [Silva i in. 2002].
Medicina Veterinaria 12 (1) 2013
22
M. Walczak i in.
WYNIKI
Średnie stężenie otrzymanych przeciwciał oznaczone spektrofotometrycznie (A280) mieściło się w granicach od 9 do 32 mg/ml, natomiast średnia ilość wyizolowanych przeciwciał wynosiła 120 mg/żółtko. Po pięciu tygodniach od pierwszej iniekcji antygenu
zaobserwowano wzrost produkcji przeciwciał (rys. 1). Czystość otrzymanych przeciwciał w surowym izolacie mieściła się w zakresie 85–95% (rys. 2). W celu usunięcia pozostałych zanieczyszczeń zastosowano filtrację żelową z wykorzystaniem złoża Sephadex
G-100. Na podstawie analizy profilu elucji (rys. 3a) dokonano wyboru frakcji zawierającej największą ilość przeciwciał IgY (frakcja 5), dla której uzyskany obraz elektroforetyczny potwierdził skuteczność zastosowanej strategii oczyszczania (rys. 3b). Wyizolowane przeciwciała przechowywano w -20°C bez zauważalnej utraty aktywności.
W celu wykrycia swoistych immunoglobulin Y oraz określenia odpowiedzi kurcząt
na podany antygen wykonano test ELISA (rys. 4). Obecność antygenowo-specyficznych
przeciwciał odnotowano po piątym tygodniu od momentu pierwszej iniekcji antygenu
(p<0.005), podczas gdy najwyższy ich poziom zaobserwowano w 15. i 16. tygodniu trwania procesu immunizacji. Dalsza analiza wykazała, iż przeciwciała IgY anty-Efb (145–
162) zdolne były do detekcji peptydowego antygenu już w stężeniu 5 μg/ml, zarówno
w teście immunosorpcyjnym (rys. 5a), jak i Western blot (rys. 5b).
Rys. 1. Średnia ilość przeciwciał IgY uzyskana w kolejnych tygodniach immunizacji
Fig. 1. Average IgY antibodies isolation yield in each week of immunization
Acta Sci. Pol.
Pozyskiwanie przeciwciał klasy Y...
23
Rys. 2. Analiza elektroforetyczna (SDS-PAGE, 4–12%, warunki nieredukujące) otrzymanych
przeciwciał IgY (1:100) specyficznych wobec epitopu białka Efb(145–162). Barwienie
wykonano przy użyciu Coomassie R-250
Fig. 2. SDS-PAGE analysis (4–12%, non-reducing) of IgY antibodies (1:100) specific to Efb(145–
162) protein. Stained with Coomassie R-250
Rys. 3a,b. Profil elucji przeciwciał IgY (Sephadex G-100); b. Analiza czystości przeciwciał IgY
(250ng) w surowym izolacie (A) oraz po oczyszczeniu na drodze filtracji żelowej (B)
Fig. 3a,b. IgY antibody elution profile (Sephadex G-100); b Purity analysis of IgY antibodies
(250ng) in crude isolate (A) and after purification by gel filtration (B)
Medicina Veterinaria 12 (1) 2013
24
M. Walczak i in.
Rys. 4. Odpowiedź układu immunologicznego kurcząt w postaci produkcji przeciwciał klasy Y
specyficznych wobec fragmentu epitopowego białka Efb(145–162) (rozcieńczenie IgY
1:100). Wartości statystycznie istotne (p<0.005) otrzymano od 5. tygodnia od momentu
pierwszej immunizacji
Fig. 4. Production of IgY antibodies specific to Efb(145–162) protein during the course of immunization (1:100). Statistically significant values (p <0.005) were obtained after fifth week
of the first immunization
Rys. 5a,b. Miano przeciwciał IgY specyficznych wobec Efb(145–162) w teście ELISA b. Miano
przeciwciał specyficznych wobec Efb(145–162) w teście Western blot.
Fig. 5a,b. The titer of IgYs specific to Efb(145–162) in: A. ELISA, and b. Western blot.
Acta Sci. Pol.
Pozyskiwanie przeciwciał klasy Y...
25
DYSKUSJA
Stosowana obecnie diagnostyka infekcji Staphylococcus aureus opiera się głównie na
technikach posiewów mikrobiologicznych na podłożach różnicujących oraz testach
koagulacyjnych, które wykorzystują obecność produkowanej przez szczepy Staphylococcus aureus koagulazy. Istotnymi ograniczeniami testów mikrobiologicznych są uzyskiwane często nieprawidłowe wyniki u osób po antybiotykoterapii oraz czas wykonania
samej analizy [Colque-Navarro i in. 1998]. Do innych metod stosowanych w diagnostyce
S. aureus należą testy genetyczne, których wadą jest niestety stosunkowo wysoki koszt,
oraz metody serologiczne, wykorzystujące zdolność specyficznych przeciwciał (głównie
ssaczych immunoglobulin G) do rozpoznawania określonych białek bakteryjnych (białka
powierzchniowe, enterotoksyny) [Hussain i in. 2008].
W niniejszej pracy przedstawiamy otrzymywanie immunoglobulin Y specyficznych
wobec białka Efb(145–162), które mogą znaleźć potencjalne zastosowanie w diagnostyce infekcji Staphylococcus aureus. Technologia produkcji przeciwciał IgY i ich izolacji
z żółtek jaj pozwala na uzyskanie znacznie większej, w porównaniu z ssakami, ilości
przeciwciał. Niewątpliwą zaletą produkcji IgY jest niewielki koszt ich otrzymywania.
Ponadto wysoka i długo utrzymująca się odpowiedź organizmu na podany antygen sprawia, iż już trzykrotna immunizacja jest w pełni wystarczająca do wydajnej produkcji IgY.
Niewątpliwym atutem jest także nieinwazyjna metoda izolacji przeciwciał IgY z żółtek
jaj, która nie wymaga skrwawiania zwierząt, w przeciwieństwie do klasycznych metod
pozyskiwania ssaczych immunoglobulin klasy G.
Stosując strąceniową metodę izolacji [Polson i in. 1980], uzyskano przeciwciała
o wysokiej czystości (85–95%), w ilości około 120 mg/żółtko. Zastosowana w kolejnym
kroku metoda chromatografii żelowej pozwoliła na usunięcie zanieczyszczeń obecnych
w surowych izolatach. Reaktywność przeciwciał z docelowym antygenem w kolejnych
tygodniach procesu immunizacji została potwierdzona testem ELISA, w którym obecność specyficznych przeciwciał zaobserwowano w piątym tygodniu po pierwszej iniekcji,
utrzymując się przez cały okres immunizacji (20 tygodni). Przeciwciała charakteryzowały
się także wysokim mianem (5 μg/ml; Western blot oraz ELISA). Zarówno surowe izolaty
przeciwciał klasy Y, jak i przeciwciała oczyszczone przy użyciu chromatografii żelowej,
mogą z powodzeniem być wykorzystane w testach immunosorpcyjnych oraz Western
blot, co podkreśla użyteczność zaprezentowanej strategii do konstrukcji testów do diagnostyki zakażeń Staphylococcus aureus opartych na detekcji białka Efb(145–162).
PODZIĘKOWANIA
Publikacja naukowa współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego. Projekt finansowany przez Narodowe Centrum Badań
i Rozwoju (LIDER/08/90/L-1/NCBiR/2010).
Medicina Veterinaria 12 (1) 2013
26
M. Walczak i in.
PIŚMIENNICTWO
Attallah A.M., Abbas A.T., Ismail H., Abdel-Raoul M., El-Dosoky I., 2009. Efficacy of Passive Immunization with IgY Antibodies to a 58-kDa H. pylori Antigen on Severe Gastritis in BALB/c
Mouse Model. J. of Immunoass. Immunoch., 30(4), 359–377.
Bade H., Stegemann H., 1984. Rapid method of extraction of antibodies from hen egg yolk. J. Immunol. Methods., 72(2), 421–426.
Barkas T., Watson M.J., 1979. Induction of an Fc conformational change by binding of antigen: the
generation of protein A-reactive sites in chicken immunoglobulin. Immunology, 36, 557–561.
Boden W.M.K., Flock J.I., 1995. Incidence of the highly conserved fib gene and expression of
the fibrinogen-binding (Fib) protein among clinical isolates of Staphylococcus aureus. J. Clin.
Microbiol., 33(9), 2347–2352.
Camenisch G., Tini M., Chilov D., Kvietikova I., Srinivas V., Caro J., Spielmann P., Wenger R.H.,
Gassmann M., 1999. General applicability of chicken egg yolk antibodies: the performance of
IgY immunoglobulins raised against the hypoxia-inducible factor 1α. FASEB J., 13, 81–88.
Carlander D., Kollberg H., Wejåker P., Larsson A., 2000. Peroral Immunotheraphy with Yolk Antibodies for the Prevention and Treatement of Enteric Infections. Immunol. Res., 21, 1–6.
Colque-Navarro P., Söderquist B., Holmberg H., Blomqvist L., Olcén P., Möllby R., 1998. Antibody response in Staphylococcus aureus septicaemia – a prospective study. J. Med Microbiol.,
47(3), 217–225.
Elazab M.F.A., Fukushima Y., Horiuchi H., Matsuda H., Furusawa S., 2009. Prolonged Suppression
of Chick Humoral Immune Response by Antigen Specific Maternal Antibody. J. Vet. Med. Sci.,
71, 417–421.
Ferella A., Bellido D., Chacana P., Wigdorovitz A., Dus Santos M.J., Mozgovoj M.V., 2012. Chicken
egg yolk antibodies against bovine respiratory syncytial virus neutralize the virus in vitro. Procedia Vaccinol., 6, 33–38.
Hussain M., von Eiff C., Sinha B., Joost I., Herrmann M., Peters G., Becker K., 2008. eap Gene as
novel target for specific identification of Staphylococcus aureus., 46(2), 470–6.
Ko K.Y., Ahn D.U., 2007. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Polutry Sci., 86(2), 400–407.
Lambris J.D., 1988. The multifunctional role of C3, the third component of complement. Immunol.
Today 9(12), 387–393.
Lee L.Y.L., Liang X.W., Hook M., Brown E.L., 2004. Identification and characterization of the C3
binding domain of the Staphylococcus aureus extracellular fibrinogen-binding protein (Efb).
J. Biol. Chem. 279(49), 50710–50716.
Leslie G.A., Clem L.W., 1969. Phylogeny of immunoglobulin structure and function. III. Immunoglobulins of the chicken. J. Exp. Med., 130, 1337–1352.
McLaren R.D., Prosser C.G., Grieve C.J., Borissenko M., 1994. The use of caprylic acid for the
extraction of the immunoglobulin fraction from egg yolk of chicken immunized with ovine
α-lactalbumin. J. Immunol. Methods, 177, 175–184.
Mayo S., Carlsson H.E., Zagon A., Royo F., Hau J., 2009. Enhancement of anamnestic immunospecific antibody response in orally immunized chickens. J. Immunol. Methods, 342, 58–63.
Meenatchisundaram S., Michael A., Subbraj T., Diraviam T., Shanmugam V., 2011. Isolation, Purification and Neutralizing potential of chicken egg yolk immunoglobulin (IgY) agains mastitis
causin Escherichia coli in dairy cows in Coimbatore District. IJDDR, 3(2), 147–153.
Michael A., Meenatchisundaram S., Parameswari G., Subbraj T., Selvakumaran R., Ramalingam
S., 2010. Chicken egg yolk antibodies (IgY) as an alternative to mammalian antibodies. Indian
J. Sci. Technol., 3(4), 468–474.
Acta Sci. Pol.
Pozyskiwanie przeciwciał klasy Y...
27
Parma Y.R., Chacana P.A., Rogé A., Kahl A., Cangelosi A., Geoghegan P., Lucchesi P.M., Fernández-Miyakawa M.E., 2011. Antibodies anti-Shiga toxin B subunit from chicken egg yolk: isolation, purification and neutralization efficacy. Toxicon, 58(4), 380–388.
Polson A., von Wechmar M.B., van Regenmortel M.H., 1980. Isolation of viral IgY antibodies from
yolks of immunized hens. Immunol. Commun., 9, 475–493.
Rose M.E., Orlans E., Buttress N., 1974. Immunoglobulin classes in the hen’s egg: Their segregation in yolk and white. Eur. J. Immunol., 4, 521–523.
Schade R., Staak C., Hendriksen C., Erhard M., Hugl H., Koch G., Larsson A., Pollmann W., Regenmortel M., Rijke E., Spielmann H., Steinbusch H., Straughan D., 1996. The Production of
Avian (Egg Yolk) Antibodies: IgY. ATLA, 24, 925–934.
Silva D.A., Silva N.M., Mineo T.W., Pajuaba Neto A.A., Ferro E.A., Mineo J.R., 2002. Heterologous antibodies to evaluate the kinetics of the humoral immune response in dogs experimentally infected with Toxoplasma gondii RH strain. Vet. Parasitol., 107(3), 181–195.
Tan S.H., Mohamedali A., Kapur A., Lukjanenko L., Baker M.S., 2012. A novel, cost-effective and
efficient chicken egg IgY purification procedure. J. Immunol. Methods, 380(1–2), 73–76.
Taylor A.I., Gould H.J., Sutton B.J., Calvert R.A., 2008. Avian IgY Binds to a Monocyte Receptor
with IgG-like Kinetics Despite an IgE-like Structure. JBC 283, 16384–16390.
Warr G.W., Magor K.E., Higgins D.A., 1995. IgY: clues to the origins of modern antibodies. Immunol. Today, 16, 392–398.
GENERATION OF IgY ANTIBODIES ISOLATED
FROM EGGS OF HENS IMMUNIZED WITH EPITOPE
OF Efb PROTEIN FROM STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Abstract. Due to noninvasive and inexpensive method of isolation, IgY antibodies extracted from chicken egg yolks represent an attractive alternative to widely used mammalian IgG antibodies. Avian IgYs are considered as valuable diagnostic tools since they lack
reactivity with rheumatoid factor and human complement, which significantly reduces the
number of false positive results often obtained in IgG-based serological assays.
The aim of this study was to generate IgY antibodies that specifically recognize selected
epitope of Efb protein produced exclusively by Staphylococcus aureus species. The selected epitope spanning residues 145–162 conjugated to KLH carrier protein was found
as an efficient antigen allowing to generate peptide-specific IgY antibodies of high titer
(5 μg/ml), high isolation yield (120 mg per egg yolk) and purity (85–95%).
Developed Efb epitope-specific IgYs could potentially serve as an interesting diagnostic
agent for the detection of Staphylococcus aureus infections.
Key words: immunoglobulins Y, immunization, ELISA, Staphylococcus aureus, peptidyl
antigen, Efb protein
Zaakceptowano do druku – Accepted for print: 28.03.2013
For citation – Do cytowania: Walczak M., 2013. Pozyskiwanie przeciwciał klasy Y z jaj
kur immunizowanych epitopem białka Efb ze Staphylococcus aureus, Acta Sci. Pol. Med.
Vet. 12 (1), 17–28.
Medicina Veterinaria 12 (1) 2013