Badanie zmian strukturalnych w białku CRP za pomocą pomiarów

Badanie zmian strukturalnych w białku CRP za pomocą pomiarów
czasów życia fluorescencji wewnętrznej białka
Spektroskopia fluorescencyjna dostarcza szeregu informacji dotyczących struktury oraz
dynamiki białek. Główną zaletą metod fluorescencyjnych jest ich duża wybiórczość oraz czułość
na wszelkie zmiany zachodzące w otoczeniu sondy fluorescencyjnej. Stąd też często w badaniach
wykorzystuje się zjawisko fluorescencji do monitorowania oddziaływań między cząsteczkami
oraz do badania ich właściwości fizykochemicznych. Inną ważną zaletą metod fluorescencyjnych
jest możliwość przeprowadzania pomiarów w rozcieńczonych roztworach w warunkach
zbliżonych do fizjologicznych. Dzięki tej właściwości możliwe jest wyznaczenie parametrów
oddziaływań białko–ligand, białko–białko czy też białko–DNA/RNA w warunkach rzeczywistej
równowagi.
Spośród technik fluorescencyjnych, mających duże zastosowanie do badania tego typu
oddziaływań, wymienić należy pomiary intensywności fluorescencji, anizotropii fluorescencji lub
też zjawisko bezpromienistego przeniesienia na odległość energii wzbudzenia fluorescencji.
Oprócz pomiarów stacjonarnych bardzo korzystne jest również zastosowanie technik
fluorescencyjnych rozdzielczych w czasie, gdyż pozwalają one śledzić postęp reakcji w czasie, a
tym samym wnioskować o mechanizmie badanego procesu. Niemniej jednak żadna z technik
zastosowana pojedynczo nie dostarcza wyczerpujących informacji o badanej makrocząsteczce.
Pełny obraz badanego procesu uzyskuje się dopiero po zastosowaniu kilku wzajemnie
uzupełniających się metod.
W badaniach fluorescencyjnych białek jako sondy fluorescencyjne wykorzystywane są
często naturalnie występujące w tych cząsteczkach aminokwasy aromatyczne takie jak tryptofan,
fenyloalanina i tyrozyna. Wśród nich w badaniach fluorescencyjnych najczęściej
wykorzystywane są własności emisji reszt tryptofanowych. Wynika to głównie z możliwości
selektywnego wzbudzania tych reszt (w zakresie długości fali od 295 do 303 nm), a ponadto
białka zwykle zawierają niewiele reszt tryptofanowych. Fluorescencja reszt tryptofanowych w
białkach przejawia dużą wrażliwość na wszelkie zmiany zachodzące w jej mikrootoczeniu, stąd
też bardzo dobrze nadaje się do śledzenia zmian konformacyjnych w białku, do których dochodzi
podczas wiązania liganda czy też procesu denaturacji. Procesom tym towarzyszy niejednokrotnie,
oprócz zmian intensywności fluorescencji, również przesunięcie maksimum emisji. Zjawisko to
związane jest ze zmianą charakteru otoczenia reszty tryptofanowej. Oprócz fluoroforów
wewnętrznych w badaniach fluorescencyjnych białek stosowane są również fluorofory
zewnętrzne. Są to często związki drobnocząsteczkowe, które wykazują silną fluorescencję, a
parametry ich emisji są bardzo wrażliwe na zmiany zachodzące w mikrootoczeniu. Znaczniki
fluorescencyjne przyłączają się kowalencyjnie (DNS-Cl, IAEDANS, Alexa, Texas, Oregon) lub
niekowalencyjnie (ANS, TNS, „kropki kwantowe”) do określonych grup funkcyjnych w
makrocząsteczce. Najbardziej podatne na tego typu modyfikacje w białkach są grupy tiolowe,
hydroksylowe oraz aminowe i karboksylowe. Selektywność znakowania jest uzależniona od
struktury znakowanej cząsteczki oraz rodzaju użytego znacznika.
Metodą, szeroko stosowaną do badania struktury i dynamiki biocząsteczek jest zjawisko
bezpromienistego przeniesienia na odległość energii wzbudzenia fluorescencji FRET (ang.
Fluorescence Resonance Energy Transfer lub Förster Resonance Energy Transfer). Transfer
energii wzbudzenia zachodzi w wyniku oddziaływania dipol-dipol pomiędzy wzbudzoną
cząsteczką donora i niewzbudzoną molekułą akceptora. W wyniku indukowania przez pole
elektromagnetyczne wzbudzonego oscylatora
niewzbudzonym następuje przekazanie energii.
s1
drgań
wymuszonych
w
oscylatorze
kT
R = 1 - 10 nm
A1
wzbudzenie
emisja
akceptora
s0
FRET
hν
hν
~ 1/R6
A0
Warunkiem koniecznym do zaistnienia tego procesu jest częściowe nakładanie się widm emisji i
absorpcji odpowiednio donora i akceptora energii. Dodatkowo oscylatory muszą znajdować się w
niezbyt dużej odległości od siebie (do 100 Å), ponieważ energia oddziaływania dipol-dipol
maleje proporcjonalnie do trzeciej potęgi odległości między nimi.
Akceptor Abs
CY5
Abs
Donor Abs
TMR
Abs
Akceptor Em
CY5 Em
Donor Em
TMR Em
J(λ)
Przeniesienie energii wzbudzenia mierzone jest metodami stacjonarnymi oraz
rozdzielczymi w czasie i opiera się zwykle na detekcji emisji fluorescencji. Stąd też wymagane
jest, aby donorem energii była cząsteczka fluoryzująca. W przypadku akceptora nie jest to
konieczne, ponieważ przeważnie monitoruje się spadek emisji fluorescencji donora. W sytuacji
kiedy akceptor również jest fluoroforem, dobiera się odpowiednio zakres pomiarowy tak, aby nie
obserwować emisji fluorescencji pochodzącej od akceptora.
Parametrem opisującym transfer energii jest stała szybkości tego procesu kT zdefiniowana
równaniem Förstera:
6
 1  R0 


kT =   
 τ D  R 
gdzie: τD jest czasem życia stanu wzbudzonego donora energii pod nieobecność akceptora, R jest
odległością pomiędzy donorem i akceptorem, natomiast R0 to tak zwana odległość krytyczna lub
inaczej odległość Förstera. Odległość krytyczna oznacza taką odległość pomiędzy cząsteczkami
donora i akceptora, dla której stała szybkości dezaktywacji stanu wzbudzonego donora równa jest
stałej szybkości bezpromienistego przekazania energii. R0 jest wielkością charakterystyczną dla
danej pary donor-akceptor i oznacza odległość, przy której wydajność transferu wynosi 50 %.
Ważny jest odpowiedni dobór pary donor-akceptor, tak aby pomiędzy donorem i akceptorem
energii nie zachodziły inne oddziaływania aniżeli związane ze zjawiskiem FRET, które mogły by
prowadzić do zmiany czasu życia fluorescencji donora.
R0 zdefiniowana jest równaniem:
[
]
R0 = 8,8 × 10 23 κ 2 n 4Qd J (λ )
1
6
gdzie: κ to czynnik geometryczny orientacji dipoli przejść, Qd wydajność kwantowa
fluorescencji donora pod nieobecność akceptora, n współczynnik załamania światła, J(λ)
znormalizowana całka nakładania się widm:
∞
J = ∫ f D (λ )ε A (λ )λ4 dλ
0
gdzie: λ to długość fali światła, εA(λ) molowy współczynnik absorpcji akceptora, ƒD(λ)
znormalizowane widmo fluorescencji donora:
F (λ )
f D (λ ) = ∞ Dλ
φ
∫ FDλ (λ )dλ
D
θT
0
Czynnik orientacji dipoli zdefiniowany jest równaniem:
θD
κ 2 = (cosθT − 3 cosθ D cosθ A ) 2
R
θA
A
gdzie: θT jest kątem pomiędzy momentami przejść donora i akceptora
cosθT = sin θ D sin θ A cos φ + cosθ D cosθ A
gdzie: θD, θA to kąty pomiędzy wektorem odległości R w parze donor-akceptor, D i A momenty
przejść, odpowiednio donora i akceptora, φ kąt pomiędzy płaszczyznami (D,R) i (A,R)
κ2 zawiera się w przedziale od 0 do 4. Wartość 4 oznacza, że oba momenty przejść znajdują się w
linii wektora R. Wartość 0 można otrzymać dla kilku różnych orientacji wektorów. Jeżeli
cząsteczki donora i akceptora szybko i izotropowo rotują (uśrednienie dynamiczne) wówczas κ2
przyjmuje wartość 2/3. Niestety bardzo rzadko udaje się jednoznacznie określić κ2 w roztworze.
Innym parametrem stosowanym do opisu transferu energii jest wydajność tego procesu E.
Wielkość ta opisuje ilość energii, jaka zostaje przekazana akceptorowi przez donor energii.
Wydajność przeniesienia energii definiuje zależność:
k
E = −1 T
τ D + kT
bądź też jako:
τ
F
E = 1 − DA lub
E = 1 − DA
τD
FD
Dzięki czemu łatwo jest eksperymentalnie wyznaczyć E mierząc czasy życia bądź też
intensywność fluorescencji donora energii pod nieobecność akceptora i w jego obecności.
Z wydajności transferu energii można wyznaczyć odległość pomiędzy donorem i
akceptorem energii:
1
1
 6
R =  − 1 R0
E 
Wydajność transferu energii
1
0.7
0.
0.2
0
0
2
4
6
8
10
Odległość w Å
Wydajność transferu energii zależy od szeregu czynników, takich jak na przykład różnica energii
stanów elektronowych donora i akceptora czy też wzajemna orientacja dipoli przejścia.
Największy wpływ na ten proces ma jednak odległość pomiędzy donorem i akceptorem energii.
Transfer energii jest najbardziej wydajny, gdy odległość ta dla danej pary donor-akceptor zawiera
się w przedziale 0,4 R0 < R < 1,6 R0. Ponadto, wśród czynników mających wpływ na wydajność
procesu transferu energii, wymienić należy również stopień nakładania się widm emisji i
absorpcji odpowiednio donora i akceptora, a także wydajność kwantową fluorescencji donora.
Pomiary transferu energii znajdują największe zastosowanie do wyznaczania odległości
pomiędzy dwoma miejscami w makrocząsteczce. Odległość Förstera stosowanych powszechnie
par donor-akceptor mieści się w przedziale od 20 do 60 Å, a więc jest porównywalna ze średnicą
wielu białek czy też grubością błon lipidowych. Pomiary transferu energii pozwalają śledzić
wszystkie te zjawiska, które wpływają na zmianę odległości pomiędzy donorem a akceptorem
energii, a więc umożliwiają na przykład monitorowanie procesów związanych ze zmianami
konformacyjnymi zachodzącymi wewnątrz makrocząsteczek. Stąd też można badać procesy
fałdowania białek, wiązania przez nie ligandów czy też dynamikę błon biologicznych. Ponadto
pomiary transferu energii stosowane są również do badania procesów takich jak oddziaływania
receptor–ligand, białko–białko, białko–DNA/RNA. W tym przypadku donor i akceptor energii
ulokowane są zwykle w dwóch różnych cząsteczkach.
Cel ćwiczenia: Wyznaczenie odległości pomiędzy resztami Trp85 i Cys178 w białku CRP i
kompleksie białka CRP z cyklicznym AMP stosując rozdzielcze w czasie pomiary FRET
techniką zliczania pojedynczych fotonów.