Sekwencjonowanie z wykorzystaniem BIG-DYE

Sekwencjonowanie z wykorzystaniem BIG-DYE
Wpisany przez Publicysta
1. PCR
W pierwszym kroku należy namnożyć fragment przeznaczony do sekwencjonowania. Następni
e oczyścić produkt z wolnych oligonukleotydów oraz wolnych dNTPs. W tym celu można się
posłużyć dwiema metodami:
- trawienie enzymami - zalecany jest PCR CleanUp Mix firmy GeneSys (www.gene-sys.pl) 1ul MIX'a na 5 ul PCR'a; inkubacja 37
o
C przez 15-30 minut (czas należy dobrać eksperymentalnie), potem 80
o
C przez 15 min.
- metodą kolumienkową - zalecany zestaw PCR Purification Kit firmy GeneSys
(www.gene-sys.pl)
Po oczyszczeniu produktu należy zmierzyć stężenie DNA.
2. Sekwencjonowanie
Należy przygotować mieszaninę reakcyjną zawierającą:
DNA matrycowe (0.1-1.0 ug)
X ul
Primer reakcji (3.2 pmol) X ul
Big Dye 2 ul
2.5X BD buffer
2 ul
H
2
O
uzupełnić do 20 ul
Warunki reakcji:
denaturacja 96
o
C przez 1 min
1/3
Sekwencjonowanie z wykorzystaniem BIG-DYE
Wpisany przez Publicysta
35 cykli
96
50
60
4
o
o
o
o
C przez 10 sek
C przez 5 sek
C przez 4 min
C do czasu wyjęcia próbek z termocyklera
3a. Precypitacja produktu po sekwencjonowaniu
1. Przygotowanie mieszaniny precypitacyjnej (każda w osobnej probówce 1.5 ml):
1.
- 2 ul 3M NaOAC
- 50 ul 95% EtOH
- Do takiej mieszaniny dodać produkt po sekwencjonowaniu.
- Umieścić na lodzie na 10 min (nie dłużej aż zobaczymy wyprecypitowany kolorowy osad).
- Odwirować na maksymalnej prędkości (czyli ok 10 000 - 15 000 g) przez 15-30 min.
- Osad przemyć 70% EtOH.
- Po zlaniu etanolu podsuszyć osad przez 10-15 minut (bez grzania). UWAGA nie wolno
przesuszyć.
- Osad rozpuścić w formamidzie lub przechowywać w postaci nierozpuszczonej w -20 o C.
3b. Oczyszczanie produktu po sekwencjonowaniu.
Jest to metoda alternatywna do precypitacji. Można ją używać dla produktów do 500bp.
2/3
Sekwencjonowanie z wykorzystaniem BIG-DYE
Wpisany przez Publicysta
1. Do 5ul produktu po sekwencjonowaniu dodać 1ul enzymu SAP (alkaliczna fosfataza).
2. Inkubować przez 1h w temperaturze 37 o C, a następnie 20 min w temperaturze 70 o C.
3. Do rozdziału na sekwenator sporządzić mieszaninę: 1-3ul mieszaniny po trawieniu + 9ul
formamidu.
4. Rozdział produktów sekwencjonowania
Zalecany jest rozdział produktów wg dołączonego do zestawu manuala.
UWAGI:
1. Trzeba pamiętać że zarówno etanol jak i wysokie stężenie soli wpływa na wydajność
reakcji sekwencjonowania.
2. Produkt sekwencjonowania nie powinien być przechowywany w formamidzie. Jeśli nie
planujemy rozdziału bezpośrednio po precypitacji bezpieczniej jest przechowywać produkt w
o C.
postaci osadu w -20
Powyższa procedura została wypróbowana przez autora niniejszego opracowania jednak nie
bierze on odpowiedzialności za jej wykorzystanie.
3/3