Ćwiczenie 7
Transkrypt
Ćwiczenie 7
Ćwiczenie 7 Sekwencjonowanie zmienionego genu blg b przy użyciu sekwenatora ABI PRISM 310 (Applied Biosystems) A. PCR sekwencyjny a. przygotować mieszaninę reakcyjną do PCR sekwencyjnego: o matrycowe DNA (100 ng/μl) - 4 μl o starter I56F For lub Rev (tylko jeden starter) (25 ng/μl) - 1 μl o mix reagentów do PCR sekwenc. (Terminator Ready Reaction Mix) – 5 μl o woda – 10 μl (końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej - 20 μl). b. warunki PCR sekwencyjnego w termocyklerze TPersonal (Biometra): o denaturacja wstępna: 96°C – 1 min. – 1 cykl o denaturacja: 96°C – 10 s o hybrydyzacja starterów: 45°C – 10 s 25 cykli o elongacja: 60°C – 3 min. o pauza: 4°C B. Oczyszczanie DNA po PCR sekwencyjnym przy użyciu zestawu ExTerminator (A&A Biotechnology) a. mieszaninę po PCR sekwencyjnym przenieść do 1.5 ml probówki; b. dodać 5 μl Mix Blue do PCR sekwencyjnego; c. dodać 100 μl roztworu wiążąco-płuczącego i wymieszać przez pipetowanie; d. całość mieszaniny przenieść na minikolumnę i zwirować 3000-4000 xg przez 30 s (lekko niebieskie zabarwienie minikolumny świadczy o wydajnej precypitacji produktów sekwencjonowania); e. nałożyć na minikolumnę 400 μl roztworu wiążąco-płuczącego i zwirować 12000-14000 xg przez 2 min.; f. przenieść minikolumnę do nowej 1.5 ml probówki i nałożyć dokładnie na środek kolumny 25 μl TSR (Template Suspension Reagent); g. inkubować w temp. pokojowej przez 2 min.; h. zwirować 12000-14000 xg przez 1 min.; i. lekko niebieskie zabarwienie otrzymanej próbki świadczy o jej właściwym oczyszczeniu; j. próbkę zawieszoną w TSR denaturować przez 2 min. w temperaturze 95°C, po denaturacji natychmiast przenieść na lód i trzymać na lodzie do momentu umieszczenia w sekwenatorze. C. Sekwencjonowanie genu blg b pod kątem obecności mutacji A1S2 V92F przy użyciu sekwenatora ABI PRISM 310. 1 W sprawozdaniu (sprawozdanie będzie obejmować materiał z ćwiczeń 6 i 7): o proszę zamieścić wynik sekwencjonowania genu blg b z zaznaczonym miejscem, w którym powinna znajdować się wprowadzana mutacja oraz stwierdzeniem jej obecności lub braku (wynik sekwencjonowania będzie dostępny na stronie www kursu); o W latach 70 ubiegłego wieku opracowano sekwencjonowania DNA dwiema metodami: terminacji łańcucha i degradacji chemicznej. Dlaczego współcześnie praktycznie nie wykorzystuje się metody degradacji chemicznej? o proszę nazwać metodę sekwencjonowania przedstawioną na schemacie poniżej i krótko opisać jej etapy: o poniżej zamieszczono autoradiogram żelu sekwencyjnego otrzymanego w wyniku sekwencjonowania DNA metodą Sangera. Proszę podać fragment sekwencji DNA, który poddano sekwencjonowaniu (strzałka wskazuje kierunek przebiegu elektroforezy). ELEKTROFOREZA 2 Tabela pomocnicza do analizy wyników sekwencjonowania: Sprawozdanie powinno zawierać: krótko sformułowany cel ćwiczenia; właściwie opisane wyniki eksperymentów; odpowiedzi na zagadnienia odnoszące się do danego ćwiczenia. Proszę nie umieszczać w sprawozdaniu: wstępu teoretycznego; opisu wykonania ćwiczenia. Sprawozdanie można oddać w wersji papierowej (pokój C020) lub przesłać w formie elektronicznej na adres: [email protected]. Ostateczny termin oddawania sprawozdania to 7 dni od daty wykonania ćwiczenia nr 7. 3