Ćwiczenie 3

KATEDRA
INŻYNIERII CHEMICZNEJ I PROCESOWEJ
INSTRUKCJE ĆWICZEŃ LABORATORYJNYCH
Ćwiczenie nr 3
Przedmiot: Techniki Rozdzielania Mieszanin
Kierunek studiów: Biotechnologia, semestr 6, studiów I-go stopnia
Przygotowali:
Zatwierdził:
prof. dr hab. inż. Marian Kamiński
mgr inż. Anita Skrzypczak
prof. dr hab. inż. Marian Kamiński
mgr inż. Joanna Głazowska
Gdańsk, 2014
Spis treści
Spis treści ................................................................................................................................... 2
1.
Wprowadzenie .................................................................................................................... 3
2.
Chromatografia jonowa i jonowymienna (Ion Chromatography - IC, Ion Exchange
Chromatography - IEC) ............................................................................................................. 3
3.
Chromatografia wykluczania jonowego (Ion exclusion Chromatography – IExclC) ........ 8
4.
Chromatografia
oddziaływań
hydrofobowych
(Hydrophobic
Interaction
Chromatography – HIC) .......................................................................................................... 10
5.
Wymagania do sprawdzianu ............................................................................................. 13
6.
Przebieg ćwiczenia............................................................................................................ 14
7.
Wymagania do sprawozdania ........................................................................................... 15
8.
Literatura ........................................................................................................................... 16
1. Wprowadzenie
Chromatografia jest przede wszystkim techniką rozdzielania substancji. Po
zastosowaniu detektora, spełniającego rolę przepływowego instrumentu pomiarowego staje
się techniką analityczną. Oznaczanie zawartości substancji w mieszaninie jest często trudne,
albo niemożliwe, a po ich rozdzieleniu problem analityczny z reguły staje się zasadniczo
prostszy. Szczególna zaletą chromatografii cieczowej jest ogromnie szeroki zakres
uniwersalności tej techniki rozdzielania. Można ją zastosować do analizy mieszanin prawie
wszystkich substancji, zarówno lotnych, jak i nielotnych, trwałych i nietrwałych termicznie
itd., pod warunkiem istnienia jakiegokolwiek ich rozpuszczalnika.
2. Chromatografia jonowa i jonowymienna (Ion Chromatography IC, Ion Exchange Chromatography - IEC)
Chromatografia jonowa i jonowymienna to metoda rozdzielania opierająca się na
sorpcji i desorpcji obdarzonych ładunkiem elektrycznym cząsteczek analitu na przeciwnie
naładowanej fazie stacjonarnej. Znajduje ona zastosowanie w rozdzielaniu i oznaczaniu
nieorganicznych, organicznych kationów i anionów, a także aminokwasów, peptydów, białek,
nukleotydów, sacharydów, amin i innych wysoce polarnych i obdarzonych ładunkiem
jonizowalnych, albo trwale spolaryzowanych oraz silnie polaryzowalnych substancji.
Wymieniacze jonowe (jonity) stosowane w jonowymiennej chromatografii, to ciała
stałe o rozwiniętej powierzchni, nierozpuszczalne w wodzie i w innych rozpuszczalnikach,
posiadające zdolność wymiany jonów z roztworem. W zależności od rodzaju grup
wymiennych dzielimy je na dwie grupy (Tabela 1, Rysunek 1):

kationity - jonity wymieniające kationy z roztworu w eluencie;

anionity - jonity wymieniające aniony z roztworu w eluencie.
Tabela 1. Typy wymieniaczy jonowych stosowanych w IEC.
Faza ruchoma:
H+, Na+, K+, Ca2+, RNH3+
Kationit – wymienia kationy (K+) z fazą ruchomą i składnikami
rozdzielanej mieszaniny – chromatografia kationowymienna
Faza ruchoma:
SO4-2, -R-COO-, OH-, Cl-
Anionit – wymienia aniony (A-) z fazą ruchomą i składnikami
rozdzielanej mieszaniny – chromatografia anionowymienna
Rys. 1. Kationit i anionit oraz przykłady jonów występujących na powierzchni fazy stacjonarnej oraz w fazie
ruchomej
W chromatografii
ografii jonowymiennej zastosowanie znajdują również wymieniacze
amfoteryczne, które w zależno
ności od pH roztworu mają zdolność wymiany anionów lub
kationów, a także wymieniacze
ymieniacze bipolarne, które mogą jednocześnie wymieniać obydwa
rodzaje jonów. Tego typu złoże zbudowane jest zarówno z jonów obdarzonych ładunkiem
negatywnym oraz pozytywnym i posiada zerowy ładunek wypadkowy. Grupy obdarzone
ładunkiem znajdują się blisko siebie na powierzchni złoża, którym może być zarówno
modyfikowany żel krzemionkowy
kowy jak i polimer (rys. 2).
Rys. 2. Struktura wypełnienia typu ZIC-HILIC
ZIC HILIC (Merck), żel krzemionkowy modyfikowany grupami
sulfobetainowymi.
Właściwości
ści wymieniaczy jonowych są różne w zależności
zależności od pochodzenia jonitu.
Według kryterium pochodzenia
chodzenia wymieniacze
wymieniacze jonowe można podzielić na następujące grupy:

Jonity naturalne – Są to głównie kationity pochodzenia mineralnego, czyli
glinokrzemiany. Największe zastosowania znalazły zeolity o składzie Na2O CaO Al2O3
nSiO2 mH2O.

Jonity półsyntetyczne – Najpopularniejsze z nich to tzw. węgle sulfonowane o nazwach
handlowych Permutyt-H, Zeocarb HJ,Wofatit-X .

Jonity syntetyczne – Pierwszymi wymieniaczami z tej grupy były syntetyczne związki
typu glinokrzemianów – żele i permutyty, jednak ze względu na znikomą zdolność
wymiany jonów w środowisku kwaśnym oraz nietrwałość, nie znalazły szerszego
zastosowania.
Rozróżnia się mocne i słabe
abe wymieniacze jonowe.

Mocne kationity w postaci sprotonowanej,
sprotonowanej zakres stosowanego pH to < 22. Grupami
aktywnymi są najczęściej
iej grupy alkilo-,
alk , albo arylosulfonowe zwią
związane wiązaniem
kowalencyjnym z powierzchnią
powierzchni polimerowego, albo krzemionkowego, lub innego typu
nośnika.

Mocne anionity w postaci hydroksylowej,
hydroksylowej zakres stosowanego pH to > 10. G
Grupą aktywną
jest najczęściej grupa tetraalkilo- albo tetraarylo-amoniowa
amoniowa zwi
związana wiązaniem
kowalencyjnym z powierzchnią polimerowego, albo krzemionkowego, lub innego typu
nośnika.

Słabe kationity zawierają na powierzchni sorpcyjnej grupy karboksylowe. Stosowane w
postaci sprotonowanej w zakresie
zak
pH 2-7.

Słabe anionity zawierają aminy, zakres stosowanego pH dla grupy hydr
hydroksylowej to 7 10. Przy czym, słaby
aby kationit jest tym mocniejszym kationitem, im wy
wyżej rzędowa jest
amina związana na powierzchni nośnika.
noś
Należy także pamiętać by dla wymieniaczy jonowych, związanych kowalencyjnie z
żelem krzemionkowym, nie przekraczać pH eluentu poza zakres 1,8 do 8,7, ponieważ może
nastąpić hydroliza wiązania Si-O-C- i trwała utrata właściwości jonowymiennych sorbentu.
Najczęściej wykorzystuje się w tym celu pakowane kolumny, rzadziej cienkowarstwową fazę
stacjonarną (np. w formie celulozowej bibuły, gdzie proces rozdzielania ma często także
jonowymienny charakter, przy słabych oddziaływaniach jonowymiennych).
Mechanizm rozdzielania w chromatografii jonowymiennej, polega na wykorzystaniu
procesów wymiany jonów, lub tylko na wykorzystaniu oddziaływań jon indukowany - jon
indukowany między powierzchnią fazy stacjonarnej, a fazą ruchomą i jonowymi, lub
zjonizowanymi składnikami roztworu substancji rozdzielanych. Praktycznie jest to
równowagowa reakcja chemiczna, prowadzona w warunkach dynamicznych, gdzie jednym
reagentem jest faza stacjonarna. Rodzaj i stężenie jonów danego typu (znaku) w eluencie,
decyduje o sile elucyjnej fazy ruchomej, której jony konkurują z jonami analitu w procesie
wymiany jonowej w kolumnie. Natomiast jony analitu różnią się między sobą czasem
przebywania w kolumnie co uzależnione jest od ich powinowactwa do fazy stacjonarnej.
Skład eluentu dobierany jest, aby zapewnić dostateczne rozdzielenie oznaczanych
jonów. W tym celu określa się rodzaj przeciwjonu, pH i siłę jonową eluentu. Dla mocnych
kationitów i anionitów przyjmuje się, że im wyższa siła jonowa eluentu, tym wyższa jego siła
elucyjna, natomiast pH winno być stałe i tak dobrane, aby zapewniało dysocjację jonów
rozdzielanych substancji i jonów związanych z powierzchnią żywicy (pHeluentu > pKa
(najsłabiej dysocjującego kwaśnego składnika próbki), albo pHeluentu < pKb (najsłabiej
dysocjującego zasadowego składnika próbki)). Rodzaj przeciwjonu powinien być
dostosowany do stopnia powinowactwa jonów rozdzielanych do powierzchni wymieniacza
jonowego. Należy też brać pod uwagę, możliwość istnienia oddziaływań hydrofobowych
z powierzchnią polimerowej fazy stacjonarnej.
Detekcja konduktometryczna (inaczej przewodnictwa jonowego) jest to uniwersalna
i podstawowa metoda detekcji w chromatografii jonowej. Pozwala na wykrycie wyłącznie
związków jonowych obecnych w eluencie, m. in. jonów mocnych kwasów i zasad, a także
chlorków i siarczanów oraz pierwiastków takich jak sód, potas. W przypadku słabych
kwasów i zasad konieczne jest odpowiednie dobranie pH fazy ruchomej, aby stopień
dysocjacji analitów był jak największy. W detektorze konduktometrycznym wykorzystuje się
zdolność roztworów elektrolitów umieszczonych w polu elektrycznym powstającym
pomiędzy dwoma elektrodami przepływowego naczynka konduktometrycznego do prze-
wodzenia prądu na skutek transportu jonów. Zastosowanie prądy szybkozmiennego oraz
elektrody z metali szlachetnych zapobiegają przebiegowi reakcji elektrodowych. Schemat
ideowy naczynka przepływowego detektora konduktometrycznego przedstawia rysunek 3.
Rys.3. Schemat ideowy naczynka przepływowego detektora konduktometrycznego (wg. Pogocki D. 1998).
W wysokosprawnej chromatografii jonowymiennej (jonowej), oprócz detekcji
konduktometrycznej,
znaczenie
mają
następujące
metody
detekcji:
detekcja
potencjometryczna, woltamperometryczna, amperometryczna impulsowa lub integracyjna,
fluoroscencyjna, refraktometryczna, pośrednia i bezpośrednia detekcja spektrofotometryczna
w zakresie UV i VIS, a także spektrometria absorpcji atomowej (AAS), spektrometria
emisyjna z indukcyjnie generowana plazmą (ICP) oraz (ICP-MS).
Ponadto coraz bardziej popularne jest sprzężenie chromatografii jonowymiennej ze
spektrometrem absorpcji atomowej (ASA), albo ze spektrometrem emisji atomowej
z wzbudzeniem plazmowym (ICP-AES). Można w ten sposób oznaczać śladowe ilości
pierwiastków (metali) w ogrodowisku naturalnym. Szczególnie wysokie czułości oznaczania
można osiągnąć w połączeniu HPIC z ICP AES i ze spektrometrią mas (HPIC-ICP/AES-MS).
W ten sposób można oznaczać metale w stężeniu od ok. 1 ppt do 10% zawartości w próbce
dozowanej do kolumny chromatograficznej.
Na rysunku 4 przedstawiono przykładowy chromatogram rozdzielania mieszaniny
nukleotydów w warunkach chromatografii jonowymiennej.
Rys 4.Chromatogram rozdzielania mieszaniny nukleotydów. Kolumna MonoQ HR 5/5, eluent : K2HPO410 mM,
pH 8,0 (A), K2HPO4 50 mM + 0,25 M NaCl, pH 8,0 (B). program elucji: 0-3min
3min 0% B, 33-30min 75% B. Linią
przerywaną zaznaczona jest zmiana składu eluentu rejestrowana przy pomocy detektora konduktywności
konduktywności.
Detektor konduktometryczny, natężenie przepływu 1,5ml/min, obj. doz. 50l
50
3. Chromatografia
wyklucz
wykluczania
Chromatography – IExclC)
jonowego
(Ion
Ion
exclusion
Chromatografia wykluczania jonowego znajduje zastosowanie do rozdzielania
związków jonowych od niejonowych oraz słabych kwasów i zasad. Cechą charakterystyczną
tej techniki jest obecność tego samego ładunku
ład
elektrycznego na zdysocjowanych
ocjowanych grupach
funkcyjnych żywicy jonowymiennej (najczęściej resztach kwasów sulfonowych) oraz
analizowanych związków jonowych. Można powiedzieć, że jest to sytuacja odwrotna do
chromatografii jonowymiennej, gdzie aniony rozdzielane
rozdzielane są na anionicie, a kationy na
kationicie, jednakże nie dochodzi tu do klasycznej wymiany jonowej.
Fazy stacjonarne stosowane w chromatografii wykluczania jonowego to przede
wszystkim makroporowate, złoża o dużej pojemności wymiennej, najczęściej ca
całkowicie
sulfonowane kopolimery styrenu i dwuwinylobenzenu.
Mechanizm retencji opiera się głównie na penetracji porów żywicy oraz nieznacznym
oddziaływaniom z nią neutralnych, nienaładowanych cząsteczek analitów. Są nimi najczęściej
niezdysocjowane kwasy i zasady oraz obojętne cząsteczki jak np. alkohole i cukry. Jony
o tym samym ładunku co faza stacjonarna są odpychane elektrostatycznie. Na powierzchni
żywicy,
dookoła
zdysocjowanych
grup
funkcyjnych
tworzy się
silnie
związana
elektrostatycznie otoczka hydratacyjna,
hydratacyjna, wchodząca przez to w skład fazy stacjonarnej.
Wszystkie te oddziaływania prowadzą do powstania stanu równowagi na powierzchni fazy
stacjonarnej,
którą
można
porównać
do
równowagi
Donnana
na
membranach
półprzepuszczalnych. W tak powstałej warstewce
warstewce wody na fazie stacjonarnej, jony oraz
obojętne cząsteczki mogą swobodnie dyfundować pomiędzy fazą ruchomą oraz
zdysocjowanymi grupami
rupami funkcyjnymi żywicy (rys 5)
Rys. 5.. Schemat przedstawiający mechanizm wykluczania jonowego (Głód B. 1997).
Stałe dysocjacji
cjacji rozdzielanych kwasów i zasad oraz stosunek stężenia form
zdysocjowanych i obojętnych określają efektywny ładunek roztworu oraz wpływają na
retencję analitów. W związku z tym, mocne, całkowicie zdysocjowane kwasy oraz zasady są
elektrostatycznie odpychane
chane od złoża, przez co są wymywane z kolumny nierozdzielone oraz
niewykazujące retencji w czasie martwym kolumny. Anality niewykazujące oddziaływania ze
złożem a wykazujące jedynie mechanizm wykluczania jonowego również są eluowane
w czasie martwym kolumny.
mny. Związki niezdysocjowane, mogące penetrować pory
wypełnienia oraz oddziaływać z żywicą wykazują retencję ma złożu i eluowane są po czasie
martwym kolumny. W związku z tym jedynie kwasy oraz zasady charakteryzujące się
pośrednimi stałymi dysocjacji (10-7 – 10-2) wykazują retencję i mogą być rozdzielane dzięki
tej technice. Podobnie jak w przypadku innych technik chromatograficznych, oprócz
głównego mechanizmu rozdzielania, wpływ retencję analitów mają m. in.:




Adsorpcja na żywicy złoża,
Wykluczanie steryczne,
Wymiana jonowa,
Oddziaływania typu van der Waalsa.
Fazą ruchomą w chromatografii wykluczania jonowego zazwyczaj jest czysta woda
lub wodny roztwór kwasu nieorganicznego o stężeniu rzędu mM. Dodatek ten ma znaczący
wpływ na lepszy kształt (ograniczenie „ogonowania” pików) oraz korzystniejsze rozdzielenie
analitów.
Stężenie jonów w fazie stacjonarnej przeważnie jest większe niż w fazie ruchomej,
prowadzi to do osmotycznego przepływu wody do żywicy, powodując jej pęcznienie. Proces
pęcznienia zmniejsza się wraz ze wzrostem stężenia jonów w fazie ruchomej i wzrostem
stopnia usieciowania żywicy.
4. Chromatografia oddziaływań hydrofobowych
Interaction Chromatography – HIC)
(Hydrophobic
Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC), stosowana obecnie zarówno do
wstępnego monitorowania składu białkowego badanego materiału biologicznego, jak i do
zastosowań
preparatywnych.
Proces
rozdzielania
opiera
się
na
hydrofobowych
oddziaływaniach pomiędzy hydrofobowym ligandem związanym z fazą stacjonarną
a niepolarnym regionem na powierzchni biomolekuły. Te hydrofobowe oddziaływania są
zwiększane przez obecność soli w eluencie, powoduje ona odsłonięcie hydrofobowej części
białka przez zakłócenie ułożenia cząsteczek wody wokół białka.
Fazy stacjonarne stosowane w chromatografii oddziaływań hydrofobowych to sorbenty
typu C3, C4, C5, albo C6 lub „fenyl” wiązane najczęściej z sieciowaną agarozą lub
syntetycznym kopolimerem o odpowiednim zakresie wielkości porów (300 A, albo większe).
Proces rozdzielania wykonuje się przy malejącym gradiencie stężenia soli podczas elucji
(rys. 6). Rodzaj soli i jej stężenie znacząco wpływa na oddziaływania hydrofobowe pomiędzy
białkiem a hydrofobowym adsorbentem.
Jednakże, stężenie soli stosowane podczas rozdzielenia powinno być nieznacznie niższe
od „punktu wysalania” cząsteczki białka. Co więcej szereg Hofmeistera zestawia sole według
zdolności wysalania białka: (NH4)2SO4> KH2PO4> Na2HPO4> Na2SO4> CH3COOK>
CH3COONa> NaCl.
Rys 6. Rozdzielanie 1. Cytochromu c, 2. Mioglobiny, 3. β-Laktoglobuliny, 4. Rybonukleazy A, 5. Lizozymu, 6.
α-Chymotrypsyny, 7. ChymotrypsynogenuA; na kolumnie YMC-Pack HIC 4,6x250 mm; Eluent: A – 2.0 M
(NH4)2SO4 + 0.1 M KH2PO4 pH 6,8; B – 0.1M KH2PO4 pH 6,8; Program elucji: 0-100%B w 30 min.; v=1.0
ml/min. Detekcja UV 254 nm;
Aminokwasy budujące białka wykazują właściwości kwasowo – zasadowe
(amfoteryczne), które w roztworach wodnych tworzą roztwory koloidalne, których faza
rozproszona stanowią cząstki o wymiarach do 100 nm, natomiast masa cząsteczkowa wynosić
może nawet do 106 Da.
Rozpuszczalność białek wodzie jest często niska. Rośnie wraz z niewielkim wzrostem
siły jonowej rozpuszczalnika. Spowodowane jest to tworzeniem „otoczki” złożonej z jonów
obecnych w roztworze. Tym samym zapobiega to agregacji fragmentów białka (wsalanie
białka). Zmniejszenie otoczki hydratacyjnej obecnej na powierzchni białka przez dodatek
znacznej ilości soli nieorganicznej jest nazywane procesem wysalania. Można osiągnąć takie
stężenie soli nieorganicznej w roztworze, że określone białko ulegnie wytrąceniu z roztworu.
Jest to jednak proces odwracalny, którego cofnięcie następuje przez dodatek rozpuszczalnika
(obniżenie stężenia soli). Zdolność kationów i anionów nieorganicznych do wysalania zależy
od ich charakteru fizyko – chemicznego. Ze względu na siłę wysalania jony można
uszeregować tworząc tzw. szereg Hofmeistera. Przykładowo, fibrynogen ulega wysoleniu
przy stężeniu chlorku sodu równym 0.8 M.
Na rysunku 7 przedstawiono schemat procesu wsalania i wysalania.
Rys.7. Wsalanie i wysalanie w warunkach rosnącej siły jonowej roztworu (Koolman i Röhm 2005)
Temperatura i pH buforu również wpływają na oddziaływania białek z fazą
stacjonarną. Ze wzrostem temperatury wzrasta retencja białka, wpływ pH na białko jest
bardziej złożony. Przypuszczalnie oddziaływania hydrofobowe są silniejsze, gdy pH buforu
znajduje się blisko punktu izoelektrycznego białka. Główną zaletą chromatografii
oddziaływań hydrofobowych (HIC) do rozdzielania białek i peptydów jest zachowanie
aktywności biologicznej cząsteczek, przez co rozdzielanie jest mniej destrukcyjne niż
w przypadku układu faz odwróconych (RP-HPLC). Jednakże, nie wszystkie białka obecne
w badanej próbce zawsze zostają rozdzielone, zatem nie można metody HIC traktować, jako
„panaceum separacyjne”. Należy zawsze ją brać pod uwagę, gdy konieczne jest rozdzielanie
białek i peptydów o wysokich masach molekularnych (powyżej 50kDa).
Na efektywność rozdzielania w chromatografii oddziaływań na wpływ szereg
czynników, m.in.: typ liganda i jego gęstość na powierzchni sorbentu, rodzaj nośnika, rodzaj
soli i jej stężenie, skład eluentu, pH i temperatura.
W chromatografii oddziaływań hydrofobowych stosuje się dwa rodzaje ligandów
immobilizowanych do nośnika, grupy alkilowe oddziałują z cząsteczka analitu tylko
wykorzystując
oddziaływania
hydrofobowe,
natomiast
grupy
arylowe
dodatkowo
wykorzystują wiązania π-π. Pojemność złoża oraz siła wiązania z molekułami rośnie wraz
z długością łańcucha alkilowego. Wybór liganda częstokroć opiera się na metodzie prób
i błędów. Pojemność złoża rośnie wraz z gęstością liganda, aż do stanu nasycenia. Jednak
zbyt duża gęstość powierzchniowa liganda nie jest oczekiwana, zwarzywszy na fakt, wzrostu
siły wiązania ligand-analit.
Stosowane nośniki (agarowa, poliakrylamidy i syntetyczne silikony) różnią się
właściwościami hydrofobowymi, co przekłada się na retencję rozdzielanych molekuł, dlatego
wybór rodzaju nośnika, często wpływa na warunki adsorpcji i elucji.
Rodzaj i stężenie soli w zasadniczy sposób wpływa na rozdzielanie molekuł.
W szczególności polipeptydów i białek. Wraz ze wzrostem stężenia soli rośnie udział
oddziaływań hydrofobowych w procesie separacji molekuł, tym samym retencja również
rośnie. W pewnym zakresie stężenia soli wzrost ilości białka sorbowane na powierzchni fazy
stacjonarnej rośnie liniowo. Po uzyskaniu stężenia soli powodującego wysalanie białka
wzrost ilości białka sorbowanego na fazie stacjonarnej rośnie wykładniczo, co ma
niekorzystny wpływ na selektywność rozdzielania. Szereg Hofmeistera przedstawia sole
ułożone wraz z malejącą zdolnością do wysalania białek. Sole silnie wysalające zwiększają
z znaczny sposób silę oddziaływania miedzy analitem, a sorbentem, co jak już było
wspomniane ma niekorzystny wpływ na selektywność rozdzielnia.
Zarówno temperatur, jak i wartość wpływają na siłę oddziaływań hydrofobowych.
Wraz ze wzrostem temperatury siła oddziaływań hydrofobowych fragmentów makromolekuł
i liganda związanego z fazą stacjonarna rosną. Inaczej jest w przypadku stężenia jonów
wodorowych, których wzrost stężenia wpływa na wzrost retencji rozdzielanej molekuły, przez
wzrost siły oddziaływań składników sorbentu, a fragmentami molekuły.
5. Wymagania do sprawdzianu
Na sprawdzianie obowiązuje treść niniejszej instrukcji, jak również odpowiednie, związane
z treścią instrukcji rozdziały książki*. Dodatkowo Student winien być zaznajomiony
materiałem podstawowego kursu Inżynierii Chemicznej i Procesowej oraz Technologii
Chemicznej.
6. Przebieg ćwiczenia
Schemat wykorzystywanej aparatury
Rys. 8. Schemat stosowanej aparatury chromatograficznej. 1 – zbiorniki na fazę ruchomą, 2 – pompa, 3 – zawór
dozujący, 4 – zawór przepływu zwrotnego, 5 – kolumna chromatograficzna, 6 – termostat, 7 – detektor (lub kilka
dat aktorów połączonych szeregowo lub równolegle), 8 – integrator lub komputerowy system rejestracji i
obróbki danych, 9 – kolektor frakcji lub pojemnik na ścieki, 10 –degazer eluentu.
Oznaczenie zawartości -laktoalbuminy w serwatce przy zastosowaniu chromatografii
oddziaływań hydrofobowych (HIC).
Materiały i Sprzęt Laboratoryjny
Wzorzec -laktoalbuminy, roztwór serwatki oraz bufor fosforanowy o pH 5,8 , bufor
fosforanowy o pH5,8 z dodatkiem 0,8M Na2SO4, woda ultraczysta do HPLC (Milipore, USA),
o czystości do HPLC, woda dejonizowana, probówki i fiolki szklane, pipeta automatyczna,
strzykawka do HPLC z płaską igłą, i tłokiem z PTFE, naczynie na ścieki;
Aparatura
Aparaty chromatograficzne typu HPLC: pompa, dozownik zaworowy, kolumna Phenyl,
120 x 4,6 mm, 3m. detektor refraktometryczny RI, detektor UV-VIS lub UV typu DAD,
integrator albo komputerowy system rejestracji i przetwarzania danych.
Warunki rozdzielania i detekcji
W trakcie analiz roztworów wzorcowych -laktoalbuminy (otrzymanych od prowadzącego)
jak i próbki serwatki warunki prowadzenia rozdzieleń powinny być stale i nie zmienne. Skład
eluentu: A- bufor fosforanowy 0,1M, pH 5,8 + 1,5M (NH4)2SO4, B - bufor fosforanowy 0,1M,
pH 5,8; program elucji 0min do 40 min 100% A 0% A, natężenie przepływu fazy ruchomej
powinno wynosić 1ml/min., temperatura pokojowa, objętość próbki dozowanej do kolumny:
50 μl.
Sposób wykonania:
Warunki rozdzielania, i detekcji.
1) Ustawić skład eluentu: A- bufor fosforanowy 0,1M, pH 5,8 + 1,5M (NH4)2SO4, B bufor fosforanowy 0,1M, pH 5,8; natężenie przepływu fazy ruchomej 1 ml/min
2) Ustabilizować warunki rozdzielania (stabilna linia podstawowa detektora RI oraz
detektora UV-VIS typu DAD, powierzchnia sorpcyjna kolumny „zrównoważona” ze
stosowanym eluentem).
3) Po ustabilizowaniu warunków rozdzielania wprowadzić do pętli zaworu dozującego o
pojemności 1200l, co najmniej 50l próbki w położenie ”load” zaworu. Po
stwierdzeniu gotowości systemu rejestracji i przetwarzania danych (komunikat
„waiting for injection” w przypadku stosowania komputerowego systemu rejestracji i
przetwarzania danych), wprowadzić próbkę do kolumny („zadozować – „wstrzyknąć”
próbkę, przekręcić zawór w pozycję „inject”). Obserwować przebieg rozdzielania,
kontrolować prawidłowość pracy aparatu, zanotować warunki rozdzielania i detekcji
oraz naszkicować schemat aparatu, a także wyjaśnić z prowadzącym ewentualne
wątpliwości.
4) Po zarejestrowaniu chromatogramu, odczytać wartość czasu retencji i powierzchnie
poszczególnych pików z detektora UV-VIS (typ DAD).
5) W
wyżej
opisany
sposób
wykonać
analizy
chromatograficzne
wszystkich
sporządzonych roztworów wzbogaconych serwatki -laktoalbuminą Zarejestrować
chromatogramy
i
wyznaczyć
powierzchnie
pików
-laktoalbuminy
dla
poszczególnych roztworów kalibracyjnych.
6) W identycznych jak wcześniej warunkach, które stosowano podczas wzorcowania i w
taki sam sposób, zadozować do kolumny roztwór próbki serwatki o nieznanym
stężeniu -laktoalbuminy
7) Zarejestrować
chromatogram
i
odczytać
powierzchnię
piku
oznaczanej
-laktoalbuminy w analizowanej próbce serwatki
8) Na postawie uzyskanej krzywej kalibracyjnej wyznaczyć zawartość laktozy w próbce
serwatki wyrażonej w mg/L
7. Wymagania do sprawozdania
Sprawozdanie grupy powinno składać się z strony tytułowej, trzech sprawozdań podgrup
wykonanych, oraz wniosków końcowych, sformułowanych po wykonaniu poszczególnych
sprawozdań, podsumowujących całe ćwiczenie. Każde sprawozdanie i jego części powinny
być odręcznie podpisane przez autorów.
Szczegółowe wytyczne i wskazówki dotyczące przygotowania sprawozdania znaleźć można
na
stronie
domowej
Chemiczna/Techniki
Katedry:
zakładka:
Dydaktyka/Przedmioty/Technologia
Rozdzielania/Wytyczne
do
sprawozdań.pdf
(http://www.pg.gda.pl/chem/Katedry/Inzynieria/images/data/tch/tch_tr_spr.pdf).
8. Literatura
*Kamiński M. (ed.) „ Chromatografia Cieczowa”, CEEAM, Gdańsk, 2004;
Koolmann J., Rohm K.-H., Biochemia - ilustrowany przewodnik. Wyd. Lekarskie 2005.
Pogocki D., Wstęp do chromatografii jonowej, Warszawa 1998.
Głód B. Chromatografia jonowo-wykluczająca. Warszawa 1997.