przepis do ćwiczenia 7

Ćwiczenie 7
Odporność roślin na odwodnienie
Ilościowe oznaczanie proliny w reakcji z ninhydryną (spektrofotometrycznie)
Odczynniki:
• 3% kwas sulfosalicylowy – 3g kwasu suflosalicylowego w 100 ml wody destylowanej
• kwas octowy lodowaty
• odczynnik ninhydrynowy – 1,25g ninhydryny rozpuścić w 30 ml kwasu octowego
lodowatego i 20 ml kwasu ortofosforowego (2M) = 50 ml
• toluen
• standard proliny w 3% kwasie sulfosalicylowym (160 ug/ml)
• kwas ortofosforowy (2M): 13,56 ml kwasu 85% dopełnić do 100 ml wodą destylowaną
na 1 gr (5 zespołów) potrzeba:
• zhomogenizowany i zliofilizowany proszek z liści roślin poddanych stresowi i kontrolnych:
2x 1500mg
• 3% kwas sulfosalicylowy 60ml ekstrakcja + 25 ml standardy
• kwas octowy lodowaty 55 ml
• odczynnik ninhydrynowy 55 ml
• toluen 110 ml
• standard proliny w 3% kwasie sulfosalicylowym (160 ug/ml) 5 ml
• kwas ortofosforowy (2M): 50 ml do rozpuszczenia ninhydryny
Sprzęt:
• Spektrofotometr
• wirówka
• wytrząsarka
• łaźnia wodna
• łaźnia lodowa
• probówki eppendorfa 1,5ml
• Probówki PP zakręcane (bo do wrzącej łaźni wodnej) (co najmniej 7-15ml)
• Kuwety szklane
• pipety szklane i automatyczne
Materiał roślinny:
• wierzba poddana stresowi
• wierzba – osobniki kontrolne.
Procedura – ekstrakcja proliny
• przygotować 6 probówek
• odważyć po ok 100 mg zhomogenizowanej wcześniej tkanki roślinnej z roślin kontrolnych
(3 probówki) i poddanych stresowi wodnemu (3 probówki)
• zanotować dokładna masę naważek
do każdej probówki:
• dodać 2 ml 3% kwasu sulfosalicylowego
• wytrząsać przez 30 min
• odwirować osad przez 10 min i nadsącz użyć do oznaczenia proliny
19
Procedura – oznaczanie proliny
• pobrać 1 ml nadsączu i dodać 1 ml kwasu octowego lodowatego i 1 ml odczynnika
ninhydrynowego
• ogrzewać mieszaninę we wrzącej łaźni wodnej przez 1 h. Powinien pojawić się ceglasty
kolor.
• Ochłodzić mieszaninę i dodać 2 ml toluenu. Wytrząsnąć i zostawić do rozdzielenia się faz.
• Odpipetować 2ml z fazy toluenu zawierającej prolinę do kuwety pomiarowej
• Odczytać absorbancję przy 520 nm stosując jako referencję czysty toluen
• oznaczyć zawartość wolnej proliny w ug wykorzystując krzywą standardową.
Sporządzenie krzywej standardowej dla proliny
Z gotowego standardu zawierającego 160 ug/ml proliny w 3% kwasie sulfosalicylowym
przygotować rozcieńczenia: 80 ug/ml, 40 ug/ml, 20 ug/ml, 10 ug/ml, 5 ug/ml.
W tym celu przygotować 5 probówek.
• Do każdej z probówek dodać po 1 ml 3% kwasu sulfosalicylowego
• Do probówki nr 1 dodać 1 ml roztworu macierzystego zawierającego 160 ug/ml proliny.
Zamieszać.
• Z probówki nr 1 pobrać 1 ml roztworu i dodać do probówki nr 2. Zamieszać.
• Z probówki nr 2 pobrać 1 ml roztworu i dodać do probówki nr 3. Zamieszać.
• Postępować tak do momentu uzyskania wszystkich 5 standardów
• Z każdej probówki pobrać 1 ml standardu i dodać 1 ml kwasu octowego lodowatego i 1 ml
odczynnika ninhydrynowego
• ogrzewać mieszaninę we wrzącej łaźni wodnej przez 1 h. Powinien pojawić się ceglasty
kolor.
• Ochłodzić mieszaninę i dodać 2 ml toluenu. Wytrząsnąć i zostawić do rozdzielenia się faz.
• Odpipetować 2ml z fazy toluenu zawierającej prolinę do kuwety pomiarowej
• Odczytać absorbancję przy 520 nm stosując jako referencję czysty toluen
• Z odczytanych wyników sporządzić krzywą standardową (oś Y absorbancja os X zawartość
proliny w ug)
20