pobierz plik - Wydział Biologii UW

 Analiza
dojrzewania końca 3' cząsteczek tRNA u Saccharomyces cerevisiae mgr inż. Ewa Skowronek
Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski
Promotor:
prof. dr hab. Joanna Kufel Recenzenci: prof. dr hab. Teresa Żołądek Zakład Genetyki, Instytut Biochemii i Biofizyki, Polska Akademia Nauk
prof. dr hab. Dariusz Bartosik
Instytut Mikrobiologii, Zakład Genetyki Bakterii, Wydział Biologii, Uniwersytet
Warszawski
Transferowe RNA (tRNA), obecne we wszystkich formach życia, stanowią kluczowy
czynnik wiążący odczytywanie kodu genetycznego i biosyntezę białek przez dostarczanie
aminokwasów
podczas
syntezy
łańcucha
polipeptydowego.
Pomimo
masowego
występowania w komórce oraz roli w podstawowym procesie biologicznym, mechanizm
kształtowania dojrzałych funkcjonalnych tRNA z pierwotnych transkryptów nie został do
końca ustalony.
W komórkach eukariotycznych biogeneza tRNA zachodzi zarówno w jądrze,
jak i w mitochondriach. tRNA kodowane jądrowo są transkrybowane jako pojedyncze
cząsteczki, a te powstające w mitochondriach stanowią część policistronowych transkryptów.
Mimo różnic w syntezie, oba typy tRNA powstają w formie prekursorów (pre-tRNA), które
przechodzą złożoną obróbkę, aby jako dojrzałe cząsteczki pełnić funkcje biologiczne.
Dojrzewanie pre-tRNA obejmuje przede wszystkim usunięcie wydłużeń na końcach 5' i 3'
przez endo- i egzonukleazy, modyfikacje zasad i reszt rybozy oraz przyłączanie tripletu CCA
do końca 3', a w przypadku niektórych jądrowych tRNA również wycięcie intronu z pętli
ramienia antykodonowego.
Enzymem odpowiedzialnym za syntezę kodowanych jądrowo cząsteczek pre-tRNA
jest polimeraza III RNA (Pol III RNA), dla której sygnałem terminacji transkrypcji jest ciąg
przynajmniej czterech tymidyn. W efekcie, wszystkie cząsteczki pre-tRNA posiadają na
końcu 3' ogon oligo(U). Długość tego ogona jest zróżnicowana, podobnie jak długość pełnych
odcinków prekursorowych na obu końcach cząsteczek, charakteryzujących się swoistą
sekwencją, warunkowaną ekspresją poszczególnych genów. W niektórych przypadkach
sekwencja nukleotydowa, w tych rejonach, umożliwia tworzenie struktur drugorzędowych.
Wszystkie powyższe cechy sprawiają, że pula drożdżowych, kodowanych jądrowo
prekursorów tRNA stanowi niezwykle heterogenną grupę cząsteczek, a obróbka końca 3’ jest
najmniej poznanym procesem w obrębie całego mechanizmu dojrzewania pre-tRNA. Dotychczas wiadomo było, że w drożdżach piekarskich Saccharomyces cerevisiae
istnieją dwie ścieżki prowadzące do wykształcenia dojrzałego końca 3' tRNA –
endonukleolityczna, proponowana jako główny mechanizm oraz egzonukleolityczna,
określana również mianem alternatywnej. Dotrawianie końca 3' pre-tRNA przez
egzonukleazy następuje w przypadku niezwiązania ogona 3' pre-tRNA przez białko Lhp1,
które jako pierwsze wiąże ogon oligo(U) nowopowstałych pre-tRNA. Spośród enzymów
aktywnych w tym procesie zidentyfikowano do tej pory dwie egzonukleazy - Rex1 i Rrp6.
Rola drożdżowej RNazy Z (Trz1) wnioskowana była natomiast jedynie na podstawie
doświadczeń in vitro oraz funkcji białek homologicznych. Wyniki zaprezentowane w rozprawie doktorskiej dowodzą in vivo zaangażowania
endonukleazy Trz1 w obróbkę wydłużeń 3' pre-tRNA. Dodatkowo, potwierdzona została
również w szerszym aspekcie rola egzonukleaz Rex1, Rrp6 i Rex2 w ścieżce alternatywnej,
co pozwoliło na stwierdzenie, że istnieje pewna hierarchia ważności pomiędzy wyżej
wymienionymi białkami, a ich funkcje w tym procesie nie w pełni pokrywają się. Wydaje się,
że wbrew wcześniejszym przewidywaniom, większość pre-tRNA ulega dojrzewaniu w obu
ścieżkach w podobnym stopniu. Jedynie cząsteczki charakteryzujące się niestandardowo
długimi sekwencjami prekursorowymi po stronie 3' są ściśle uzależnione od aktywności Trz1. Możliwe, że trawienie egzonukleolityczne, niezależne od Trz1 i wiązania Lhp1, jest
w przypadku tych prekursorów blokowane przez przewidziane in silico struktury typu spinki
do włosów w obrębie tych sekwencji. Na przykładzie jednej z takich cząsteczek zaobserwowano, że zablokowanie
dojrzewania końca 3' prowadzi do degradacji tRNA, zależnej od oligoadenylacji przez
polimerazę poli(A) Trf4, która jest składnikiem kompleksu TRAMP. Zjawisko to stanowi
element kontroli jakości tRNA, który zachodzi w jądrze komórkowym. Istnieją jednak
przesłanki wskazujące, że adenylacja przez Trf4 może być również sygnałem kierującym
niestabilne tRNA do degradacji na drodze RTD (ang. rapid tRNA decay).
W ramach tej pracy pokazano, że kodowana jądrowo endonukleaza Trz1 jest
odpowiedzialna również za dojrzewanie końca 3' mitochondrialnych tRNA (mt-tRNA).
Mutacje
w
genie
TRZ1
przyczyniają
się
do
znacznej
niestabilności
genomu
mitochondrialnego, charakteryzującego się utratą części regionów, szczególnie tych
zawierających wyłącznie geny tRNA. Ponadto, brak Trz1 w mitochondriach skutkuje
zanikiem
dojrzałych
form
transkryptów
mitochondrialnych
ulegających
ekspresji
i akumulacją znacznie większych policistronowych prekursorów. Potwierdzono więc, że
zgodnie z wcześniejszymi przewidywaniami, głównymi enzymami odpowiedzialnymi za
kształtowanie dojrzałych mt-tRNA są endonukleazy – Trz1 oraz wcześniej zdefiniowana
RNaza P. Stanowią one podstawę tzw. punktowego modelu dojrzewania mitochondrialnych
policistronowych transkryptów, gdzie wycięcie cząsteczek tRNA przez te dwa enzymy jest
jednocześnie pierwszym krokiem dojrzewania innych klas RNA kodowanych w tych samych
jednostkach transkrypcyjnych. Przeprowadzone badania ukazały ponadto poboczną rolę innych nukleaz, Nuc1, Rex2
i Pet127, w obróbce mitochondrialnego transkryptu pre-tRNAfMet-RPM1-tRNAPro. Brak tych
enzymów powoduje nasilenie akumulacji form prekursorowych lub występowanie
dodatkowych produktów przejściowych procesu dojrzewania tego transkryptu. Wyniki te
potwierdziły udział nukleazy Pet127 w obróbce końca 5' niektórych mitochondrialnych
cząsteczek RNA, w tym prekursora RPM1, oraz wskazały na możliwy wkład enzymów o
aktywności egzonukleolitycznej 3'-5' w biogenezę dojrzałych mt-tRNA.