Lab 2 Izolacja i liczenie

Laboratorium 2.
Kultury bakteryjne oraz grzybowe. Metody izolacji oraz hodowli.
1. CZĘŚĆ TEORETYCZNA
Mikroorganizmy wykazują duże zdolności adaptacyjne do otaczającego środowiska.
Ich typowe miejsca bytowania bardzo często związane są z obecnością wody, dlatego
występują one licznie w zbiornikach wodnych, glebie, na obiektach ożywionych, jak tkanki
roślinne, zwierzęce czy ludzka skóra. Mikroorganizmy występują również na powierzchniach
różnych materiałów i w powietrzu. Nie jest to sprzyjające środowisko do ich rozwoju ale
umożliwia przetrwanie i przenoszenie na cząstkach kurzu, poprzez ruch powietrza, w inne
miejsca zapewniające bardziej dogodne warunki do rozwoju. W zależności od dostępności
wody i substancji odżywczych liczebność poszczególnych grup mikroorganizmów może
różnić się. Bakterie do rozwoju wymagają środowiska wodnego, natomiast bardziej odporne
na brak wody są drożdże i grzyby strzępkowe. Wymagania wilgoci dla poszczególnych grup
mikroorganizmów opisuje się za pomocą aktywności wody (aw). Parametr ten jest miarą
dostępności wody w danym surowcu i wyraża się jako stosunek ciśnienia parcjalnego nad
określonym surowcem do prężności par czystej wody. Przyjmuje on wartości z zakresu od 0
do 1, gdzie wartość 1 odpowiada czystej wodzie, natomiast 0 – środowisku bezwodnemu.
Stąd podłoża, różnego rodzaju surowce zawierające niezwiązaną wodę będą wykazywać
odmienną aktywność wody. Przykładowo różną aktywność wody wykazują świeże owoce, w
porównaniu z wysuszonymi i choć oba typy zawierają składniki odżywcze niezbędne do
rozwoju mikroorganizmów to szybszy ich wzrost jest zauważalny na świeżych, które
zawierają znaczną ilość dostępnej wody. Przyjmuje się, że do rozwoju bakterii, drożdży i
pleśni minimalna wartość aw wynosi odpowiednio: 0,9, 0,8 i 0,7.
Różnorodność mikroorganizmów w danym środowisku wynika z ich zdolności do:
przystosowania do określonym czasami ekstremalnych warunków, wykorzystania różnych
substratów (np. organicznych - węglowych, azotowych lub mineralnych), oddychania
tlenowego/beztlenowego, szybkości namnażania, wykształcania form przetrwalnikowych
(spor). Aby poznać rodzaje mikroorganizmów bytujących w określonym środowisku oraz ich
liczebności stosuje się metody pośrednie lub bezpośrednie. Do metod bezpośrednich zalicza
się liczenie komórek pod mikroskopem w preparatach barwionych lub w komorze Thoma.
Metody pośrednie są jednak bardziej precyzyjne w porównaniu z bezpośrednimi, ponieważ
1
dotyczą wyłącznie komórek żywych (aktywnych metabolicznie), które rosną na podłożach
hodowlanych. Przy czym, nie wszystkie mikroorganizmy są zdolne do rozwoju w sztucznych
(laboratoryjnych) warunkach. Przykładami metod pośrednich jest wykonanie serii
rozcieńczeń (zazwyczaj 10 krotnych) określonej zawiesiny mikroorganizmów i wysianie
każdego rozcieńczenia na podłożu stałym. Na podstawie otrzymanej liczby koloni, można
określić liczbę mikroorganizmów w 1 ml zawiesiny lub przypadającej na 1 g podłoża.
Do typowych oznaczeń liczby i typu mikroorganizmów wykorzystuje się próbki pochodzące
z gleby i wody. Ponadto wykonuje się również oznaczenia czystości powietrza testem
sedymentacyjnym Kocha.
Podstawowe pojęcia w mikrobiologii to hodowla, czysta kultura, kolonia, klon i
szczep.
Hodowla to podłoże z namnożonymi mikroorganizmami. Hodowle można prowadzić na
podłożu płynnym bądź stałym. Hodowle mogą być jednogatunkowe (gdy na podłożu rośnie
jeden gatunek bakterii) lub mieszane (gdy rosną w nich przynajmniej dwa gatunki).
Kolonia to widoczne gołym okiem skupisko drobnoustrojów na podłożu stałym. Na ogół
kolonia powstaje w wyniku podziałów pojedynczej komórki.
Czystą kulturą nazywamy hodowlę, w której bakterie stanowią potomstwo jednej,
pierwotnie wyosobnionej komórki bakteryjnej.
Klon to czysta kultura i pochodzące od niej populacje bakteryjne.
Szczepy to różne klony należące do tego samego gatunku, a wyprowadzone z
poszczególnych czystych kultur, izolowanych niezależnie od siebie.
Zagadnienia do opracowania zgodnie z podaną literaturą:
- metody oznaczania mikroorganizmów;
- gleba jako środowisko życia mikroorganizmów;
- woda jako środowisko życia mikroorganizmów;
- powietrze jako środowisko przenoszenia się mikroorganizmów.
Literatura:
- A. Ziembińska, A. Węgrzyn, Laboratorium mikrobiologiczne. Wybrane ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej i
stosowanej. (2013) Gliwice.
- H.G. Schlegel, Mikrobiologia ogólna. (1996) PWN.
2
2. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
1. Izolacja mikroorganizmów ze środowiska metodą pośrednią
Cel: oszacowanie i porównanie liczby mikroorganizmów występujących w różnych próbkach
gleby, wody, powietrza i innych stałych obiektów.
Każda podgrupa wykonuje oznaczenie z próbki gleby, wody i powietrza. Próbki gleby i wody
studenci przynoszą na zajęcia indywidualnie, przy czy próbki te powinny być dokładnie
opisane – miejsce pochodzenia, czas pobrania
Przygotować płytki z podłożami stałymi (agar odżywczy, czapek-dox agar). Spód płytek
należy odpowiednio oznaczyć – rodzaj podłoża, pochodzenie próbki, typ posiewu, data,
wykonawca (grupa, inicjały).
Gleba
Materiał biologiczny w przypadku gleby, 2-4 g zawiesić w 25-50 ml soli fizjologicznej
(0,9% w/v NaCl). Przygotować zestaw plastikowych probówek z 4,5 ml sterylnej soli
fizjologicznej. Do 1 probówki odpipetować 0,5 ml zawiesiny materiału biologicznego
unikając pobrania stałych części gleby. Próbkę 1 dokładnie wymieszać, pobrać 0,5 ml i
przenieść do 2 probówki z 4,5 ml soli fizjologicznej. Próbkę 2 dokładnie wymieszać,
pobrać 0,5 ml soli fizjologicznej i przenieść do kolejnej probówki. Czynność powtarzać
do uzyskania 106 rozcieńczenia. Następnie z probówki o rozcieńczeniach 104, 105 i 106
pobrać 0,1 ml rozcieńczonej zawiesiny i wykonać posiew dywanowy na podłożu stałym.
Dla próbki 1 wykonać posiew redukcyjny. Płytki inkubować przez 3-7 dni w
temperaturze otoczenia.
Woda
Podobną procedurę wykonać dla próbki wody. Przy czym posiew redukcyjny wykonać
bezpośrednio z wody. Wodę rozcieńczać w soli fizjologicznej analogicznie jak zawiesinę
otrzymaną z gleby. Mikroorganizmy inkubować w temperaturze otoczenia od 3 do 7 dni.
Powietrze
Obecność mikroorganizmów w powietrzu wyznaczyć metodą sedymentacyjną Kocha.
Płytki z dwoma rodzajami podłoża wystawić na ekspozycję powietrza w ściśle
określonym miejscu przez 5. Próbę wykonać w dwukrotnym powtórzeniu. Po 5 minutach
płytki zakryć wieczkiem. Inkubację prowadzić w temperaturze otoczenia od 3 do 7 dni.
2. Opracowanie wyników:
1. Ilościowe określenie mikroorganizmów – mikroorganizmy wyrosłe na płytach
policzyć – należy wybrać te płytki na których liczba zawiera się w zakresie 10-300.
3
Należy policzyć liczbę mikroorganizmów znajdujących się w:
a). 1 g podłoża;
b). 1 ml wody;
c). 10 dm3 powietrza.
Liczbę mikroorganizmów, X, przypadającą na 10 dm3 powietrza:
X =
x ⋅ 100
,
A ⋅α
x – średnia liczba mikroorganizmów zliczona z płytek;
A – powierzchnia płytki cm2;
α – czas ekspozycji podłoża na działanie powietrza, przyjmuje się, że 5 min
odpowiada wartości 1, 10 min – wartości 2, 15 min – wartości 3.
2. Jakościowe określenie mikroorganizmów – na podstawie posiewów
powierzchniowych i redukcyjnych określ obecność bakterii i pleśni w każdym z
badanych środowisk bytowania mikroorganizmów.
4