Wykład 2 cz. 1

Wybrane szczepy drobnoustrojów
przemysłowych
Hodowle komórek ssaków i komórek
roślinnych
Porównanie systemów komórkowych
Metabolity pierwotne i wtórne
Metabolity specyficzne (wtórne, specjalne, idiolity)
charakteryzują się ograniczonym występowaniem w
przyrodzie i brakiem ogólnej, zasadniczej dla wzrostu
wytwarzających je organizmów funkcji biologicznej;
w określonych warunkach mogą one jednak spełniać różne
swoiste funkcje w życiu drobnoustrojów
Około 10 000 opisanych struktur pochodzi z drobnoustrojów , kilkaset z nich
jest produkowane metodami biotechnologicznymi (leki, pestycydy, promotory
wzrostu itd.)
Metabolity specyficzne (wtórne)
hipotezy dotyczące funkcji
- hipoteza „uniwersalna” - następstwo jakościowej
zmiany przemian materii zachodzących w komórce
po zakończeniu wzrostu
- relikt procesu ewolucyjnego
- wyraz „wolnej gry” ewolucyjnej
- rola ekologiczna
Biosynteza metabolitów pierwotnych i
wtórnych - różnice
Opublikował Gabryjela Gołuński http://slideplayer.pl/slide/56299/,
• Liczba metabolitów pierwotnych jest stosunkowo mała a ich
biosynteza jest dobrze poznana.
• Dzięki ich powszechnemu występowaniu można znaleźć prosty i
dobrze zbadany drobnoustrój, nadający się do ich
biotechnologicznej produkcji (Escherichia coli, Corynebacterium
glutamicum,Saccharomyces cerevisiae).
• Większość potrzebnych dziś do różnych celów metabolitów
pierwotnych jest otrzymywanych na skalę techniczną, z
zastosowaniem kombinacji hodowli klasycznej, zmian
dokonanych metodami technologii genetycznej i wielokrotnej
optymalizacji prowadzenia procesu biotechnologicznego ze
szczepami wysokowydajnymi.
Metabolity wtórne
•Nie pełnią podstawowych funkcji biologicznych (???)
•Powstają w metabolizmie ograniczonej liczby gatunków,
a nawet szczepów
S. hygroscopicus
S. erythreus
rapamycin
erythromycin
•Ich biosynteza ściśle zależy od warunków hodowli i zachodzi w
jej określonym etapie
• Liczba substancji naturalnych w tej grupie
jest duża i nieznana
Regulation of fungal secondary metabolism, Axel A. Brakhage, Nature Reviews Microbiology 11, 21-32 (January 2013)
• Wiele substancji naturalnych należących do metabolitów
wtórnych, odpowiednio do ich budowy strukturalnej ma
więcej lub mniej złożony i często rozgałęziony szlak
biosyntezy któremu towarzyszy najczęściej równie
skomplikowana genetyka i regulacja
Pathway for biosynthesis of FK506
(according to Motamedi and Shafiee)
Motamedi H, Shafiee A.. Eu J Biochem 1998; 256:528-534
Grupy specyficznych produktów metabolizmu
drobnoustrojów
alkaloidy
aminocukry
aminoglikozydy
aminokwasy
antocyjaniny
ansamycyny
antrachinony
antracykliny
chinoliny
chinolinony
chinony
depsipeptydy
epoksydy
fenazyny
flawonoidy
fosfoglikolipidy
ftalaldehydy
glikozydy
hydroksyloaminy
laktony
makrolidy
naftochinony
nitryle
nukleozydy
peptydy
piperazyny
pirydyny
pirole
pirony
poliacetyleny
polieny
polietery
polikwasy
polipeptydy
polisacharydy
salicylany
steroidy
tetracykliny
triazyny
Kierunki biologicznego działania specyficznych
metabolitów drobnoustrojowych
alergiczne
anaboliczne
analeptyczne
anorektyczne
antydepresyjne
antyhistaminowe
cytotoksyczne
dermonekrotyczne
estrogenne
halucynogenne
hemolityczne
herbicydowe
hipocholesterolemiczne
hipoglikemiczne
hipolipidemiczne
hipotensyjne
immunostymulacyjne
immunosupresyjne
parasympatomimetyczne
przeciwdrobnoustrojowe
przeciwinsektydowe
przeciwnowotworowe
przeciwpróchnicze
przeciwrobacze
przeciwzakrzepowe
przeciwzapalne
rozluźniające mięśnie gładkie
rumieniotwórcze
rakotwórcze
stymulujące wydzielanie hormonów
uspokajające
znieczulające
• Są zazwyczaj syntetyzowane jako grupy podobnych
struktur chemicznych
Wybrane grupy drobnoustrojów przemysłowych
• Wirusy
• Bakterie gramujemne
• Bakterie gramdodatnie
• Promieniowce
• Grzyby strzępkowe
• Drożdże
• Glony
• Drobnoustroje metylotroficzne
stosowane w biotechnologii
farmaceutycznej
Inne typy komórek
• Grzyby wyższe (kultury mycelialne)
• Komórki zwierzęce - naturalne
• Hybrydy (hybrydomy)
• Komórki roślinne – naturalne
• Mikroorganizmy modyfikowane metodami
transformowanego DNA
Wirusy
Szczepionki wirusowe
Wektory
Technologie
rekombinowanego
DNA
Bakterie gramujemne
Escherichia coli
•acylaza penicylanowa
•asparginaza
•kwas L-asparginowy
•biorca DNA
Acetobacter
Gluconobacter
Pseudomonas
• biotransformacje
Bakterie gramdodatnie
Ważniejsze produkty metabolizmu wytwarzane przez bakterie z
rodzaju Bacillus
Antybiotyki
bacytracyna
przeciwko G+ i G—
butyrozyna
przeciwko G+ i G—
gramicydyny
przeciwko G +
polimyksyny
przeciwko G—
Enzymy
acylaza penicylinowa
a-amylaza
produkcja kwasu 6-AP
hydroliza skrobi
b-amylaza
hydroliza skrobi
izoamyłaza
hydroliza skrobi
b-galaktozydaza
hydroliza laktozy
a-glukanaza
b-glukanaza
izomeraza glukozowa
hydroliza polisacharydów
hydroliza polisacharydów
konwersja glukozy do fruktozy
penicylinaza
inaktywacja penicyliny
proteazy alkaliczne
detergenty i inne zastosowania
proteazy neutralne
w przemyśle fermentacyjnym
pululanaza
hydroliza amylopektyny
termolizyna
produkcja aspartamu
Zastosowanie bakterii kwasu mlekowego
Kwas mlekowy
Lactobacillus:
L.delbrueckii, L.bulgaricus, L.leichmanii
Dekstran
Leuconostoc mesenteroides
Nizyna
Streptococcus lactis
Preparaty lecznicze
Lactobacillus:
L.acidophilus, L.bijidus
Filogenetyczne relacje pomiędzy promieniowcami i bakteriami
pokrewnymi
Podkreślono rodzaje mające znaczenie biotechnologiczne
Gwiazdkami oznaczono rodzaje zaliczane do promieniowców według
tradycyjnych kryteriów morfologicznych
(wg A. Chmiela)
Wybrane produkty metabolizmu promieniowców
Antybiotyki:
Rodzaj Streptomyces
aktynomycyna
nowobiocyna
amfoterycyna B
nystatyna
blastomycyna S
oksytetracyklina
bleomycyna
polifungina
chlorotetracyklina
oleandomycyna
cykloheksimid
spektynomycyna
erytromycyna
streptomycyna
kanamycyna
tetracyklina
kasugamycyna
tobramycyna
linkomycyna
tylozyna
mitomycynam
wankomycyna
monenzyna
wiomycyna
Inne rodzaje:
gentamycyna Micromonospora purpurea
ryfamycyna Nocardia mediterranea
Witaminy:
kobalamina (B12)
Streptomyces
olivaceus
Enzymy:
proteaza
izomeraza glukozowa
Streptomyces sp.
Actinoplanes missouriensis
Inhibitory enzymów (w nawiasie nazwa enzymu):
bestatyna (aminopeptydaza B)
forfenicyna (alkal.fosfataza)
pepstatyna (pepsyna)
reticulol (fosfodiesteraza cAMP)
Streptomyces olworeticuli
Streptomyces flurovirialis
Streptomyces testaceus
Streptomyces moberensis
Substancje powierzchniowo czynne:
kwasy karboksylowe
pochodne trehalozy (dimykolowe, diacylowe)
Nocardia sp.
Nocardia sp.
Wybrane produkty metabolizmu grzybów
strzępkowych
Antybiotyki
cefalosporyna C
cyklosporyna
fumagilina
gryzeofulwina
kwas fusydowy
penicylina G
wariotvna
Cephulosporium acremonium
Tyolypocladium injlatum
Aspergillus fumigatus
Penicillium griseofulvus
Fusidium coccineum
Penicillium chrysogenum
Paecilomyces narioti
Witaminy i inne substancje aktywne biologicznie
ryboflawina (B2)
alkaloidy
gibereliny
Ashbya gossypii, Eromothecium ashbyii
Claviceps purpurea, Claviceps paspali
Giberella fujikuroi (Fusarium moniliforme)
Wybrane produkty metabolizmu grzybów c.d.
Enzymy
acylaza L-aminokwasowa
enzymy amylolityczne
enzymy pektynolityczne
enzvmv celulolityczne
enzymy lipolityczne
dekstranaza
b-glukanaza
glukoamylaza
inwertaza
katalaza
laktaza
oksydaza glukozowa
proteazy
Aspergillus oryzae
Aspergillus oryzae, Aspergillus niger,
Aspergillus niger, Aspergillus wentii.
Aspergillus niger, Trichodermu liride,
Aspergillus spp., Mucor miehei
Penicillium lilacinum, Penicillium funiculosum
Aspergillus oryzae, Aspergillus niger
Aspergillus oryzae, Aspergillus niger
Saccharomyces cerevisiae
Aspergillus niger, Aspergillus oryzae
Aspergillus niger, Aspergillus oryzae
Penicillium notatum, Aspergillus niger,
Aspergillus sp., Mucor sp.
Wybrane produkty metabolizmu grzybów c.d.
Inne produkty:
etanol, napoje alkoholowe
glicerol
kwas cytrynowy
kwas fusarowy
kwas glukonowy
kwas itakonowy
Saccharomyces ceretisiae,
Saccharomyces uvarum i inne
Saccharomyces cerevisiae
Aspergillus niger, Candida lipolytica
Fusarium sp.
Aspergillus niger
Aspergillus terreus, Aspergillus itaconicus
Szacunkowa liczba antybiotyków wytwarzanych
przez ważniejsze grupy drobnoustrojów
Cele procesów biotechnologicznych z wykorzystaniem
kultur mycelialnych grzybów wyższych
izolacja z mycelium lub podłoża pohodowlanego substancji
farmakologicznie czynnych biosyntezowanych przez
komórki grzyba;
?
http://www.anticancer-drug.net/BRM/lentinan.htm
wg Wasser i Weis,mod.
Grzyby lecznicze –
około 700 (?)
gatunków grzybów
klasy Basidiomycetes
>30 wykorzystywane
w lecznictwie (leki,
suplementy diety)
Hodowle komórek ssaków
Cele stosowania (komórki pierwotne i hybrydy)
•Otrzymywanie czynników wzrostu i hormonów
•Otrzymywanie czynników trombolitycznych i
angiogennych
•Produkcja szczepionek
•Testy cytotoksyczności
•Testy farmakologiczne
•Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych
Hodowle pierwotnych komórek ssaków problemy:
•Duże rozmiary komórek
•Brak ściany komórkowej – komórki wrażliwe na
stres fizyczny
•Konieczność stosowania bardzo złożonych
pożywek (dodatki hormonalne, czynniki wzrostu,
insulina)
•Wzrost jest ograniczony (wyjątek – linie komórek
nowotworowych)
Stosowane techniki:
Hodowle okresowe
A suspension culture in
serum-free media, this singleuse bioreactor set-up at
Wyeth (now part of Pfizer)
graced the cover of BPI’s
September 2011 issue.
Hodowle na nośnikach
This scanning electron
micrograph of Vero cells cultured
on microcarrier beads with
Thermo Fisher Scientific media
appeared on BPI’s April 2010
cover.
http://www.whatisthebiotechnology.com/blog/animal-cell-culture-techniques/prmry-2/
Hodowle ciągłych linii komórkowych,
uzyskanych przez fuzję z komórkami
nowotworowymi
•Wykazują te same fazy wzrostu co drobnoustroje
•Mogą być hodowane – podobnie jak drobnoustroje –
miesiącami i latami
Stosowane techniki:
Podobne jak w przypadku
drobnoustrojów
Animal cells cultivation in fermenter
Karel Schmiedberger ml. - vlastní foto / own work
Hodowle komórek ssaków – produkty
stosowane, gdy produktu nie można uzyskać z zastosowaniem drobnoustrojów
(biogenne substancje czynne z z prawidłową strukturą glikozylacji i sfałdowaniem
białek)
Hodowle komórek roślinnych
Cele stosowania:
•Otrzymywanie metabolitów wtórnych
Problemy:
•Wolno przebiegający metabolizm
•Stosuje się hodowle heterogenne (wolno i szybko
rosnące komórki tej samej linii)
•Po przeniesieniu zróżnicowanych komórek do
hodowli następuje ich odróżnicowanie i powstają
komórki omnipotentne wykazujące niewielkie
zdolności biosyntezy metabolitów wtórnych
•Opłacalnośc stosowania takich metod mniejsza niż
uprawy
Hodowle komórek roślinnych
Problemy:
•Podłoża wymagają dodatków czynników wzrostu i
prekursorów
Po naniesieniu na podłoże komórki roślinne wyrastają
do kultur kalusowych z których rozwija się normalna
zdrowa roślina
plant regeneration
from cell suspension
culture
http://images.1233.tw/suspension-cell-culture/
Porównanie systemów komórkowych
wg O. Kayser, Podstawy biotechnologii farmaceutycznej