Wrocław, 16.11.16 MIKROFILTRACJA ZAGĘSZCZANIE BIAŁEK

Wrocław, 16.11.16
MIKROFILTRACJA
ZAGĘSZCZANIE BIAŁEK SERWATKOWYCH
1. OPIS PROCESU
Procesy membrany stosowane szeroko w przemyśle mleczarskim są często alternatywą
dla jednostkowych procesów klasycznej inżynierii i technologii chemicznej. W przemyśle
mleczarskim stosowane są wszystkie rodzaje membranowych procesów ciśnieniowych, od
mikrofiltracji po nanofiltrację, sporadycznie stosowane są membrany z zakresu odwróconej
osmozy.
Membrany mikrofiltracyjne posiadają największe rozmiary porów spośród wszystkich
rodzajów membran. Wspomniane rozmiary są większe niż w przypadku membran
ultrafiltracyjnych, mniejsze natomiast niż średnice porów występujących w klasycznej
filtracji. Wynoszą one od 0.1 do 10[µm]. Stosowane ciśnienie transmembranowe powinno
zawierać się w zakresie od 0.1 do 2.0[bar]. Membrany mikrofiltracyjne są narażone na
najintensywniejsze osadzanie się białka na membranie a tym samym na największy spadek
strumienia permeatu oraz wzrost ciśnienia w trakcie procesu, ponieważ pory membran tego
typu są największych rozmiarów.
W przypadku mikrofiltracji produktów przemysłu mleczarskiego stosuje się głównie
membrany ceramiczne, z racji możliwości ich wielokrotnego użycia, sterylizacji oraz łatwości
mycia. Wykazano również, że polimerowe membrany mikrofiltracyjne nie są dobrym
rozwiązaniem w przypadku separacji produktów mlecznych, z racji większej podatności
materiału na adsorpcję białka a także mniejszą stabilność termiczną oraz chemiczną samej
membrany. Stwierdzono również, że membrany polimerowe posiadają większą rozbieżność
wielkości porów membrany.
Jak pokazują badania, wszystkie z białek mleka (w tym serwatkowe) silnie agregują oraz
adsorbują się na powierzchni membrany, jednak udowodniono, że β – laktoglobulina
powoduje najsilniejsze blokowanie membrany. Dzieje się tak najprawdopodobniej z racji
występowania w tym białku bardzo aktywnego wolnego wiązania sulfhydrylowego, które
powoduje powstawanie dimerów a nawet oktamerów tego białka i jako duża cząstka blokuje
pory.
Dodatkowym negatywnym zjawiskiem zachodzącym przy powierzchni membran jest
polaryzacja stężeniowa. Wynika ona z faktu kumulowania się składników separowanego
roztworu wzdłuż membrany, co powoduje powstawanie wstecznego ciśnienia osmotycznego i
tym samym zmniejszenie efektywnego ciśnienia transmembranowego oraz zwiększanie
oporu.
Wszystkie opisane zjawiska powodują, że na membranie powstaje dodatkowa warstwa,
która staje się efektywną warstwą separacyjną – nie jest nią sama membrana. Istotnym
parametrem zapobiegającym osadzaniu się białek na membranie jest dobranie odpowiednio
wysokiego strumienia retentatu podczas separacji, który może wynosić nawet 7 [m s-1].
Ponadto niekorzystne efekty membranowe można zredukować stosując niższe wartości
ciśnienia transmembranowego.
W trakcie separacji zauważalny jest spadek wartości ciśnienia wzdłuż membrany (Rys.
1). Istnieje wiele rozwiązań by zmniejszyć ten spadek ciśnienia wzdłuż membrany,
polegających głównie na recyrkulacji permeatu.
Rys. 1. Profil ciśnienia występujący podczas separacji mikrofiltracyjnej
Dodatkowo niekorzystne efekty membranowe można zredukować stosując back – flushing
lub back – piulsing.
Niemniej podczas separacji ultrafiltracyjnej i mikrofiltracyjnej wyróżnić można wyraźnie
trzy etapy spadku strumienia permeatu (Rys. 1.), będącego skutkiem dwóch zjawisk:
polaryzacji stężeniowej wzdłuż membrany oraz zatykania porów membrany.
Rys. 1. Spadek strumienia permeatu, w separacji mikro- i ultrafiltracyjnej. I – wstępny,
szybki spadek, II – długoterminowy, wolny spadek, III – quasi – statyczny, ustalony strumień
permeatu
Membrany zablokowane w trakcie procesu, poddaje się po jego zakończeniu
oczyszczeniu. Woda do płukania i sporządzania roztworów myjących membrany nie może
zawierać żadnych składników koloidowych ani mikroorganizmów, które mogłyby
powodować zatykanie porów membrany czy ponowne zabrudzenie mytych instalacji. Z tego
powodu woda do czyszczenia instalacji powinna być nie tylko destylowana, ale również
mikrofiltrowana przy pomocy filtru o średnicy porów ok. 0.2 [µm]. Procedura mycia
membran zależy głównie od materiału z jakiego sporządzona została membrana. W
przypadku membran ceramicznych polega ona głównie na przemiennym myciu podgrzanymi
środkami o odczynie zasadowym np. NaOH, obojętnym (woda) i kwasowym np. H3PO4.
Wykazano jednak, że stosowanie kwasu nie wpływa znacząco na odblokowanie porów i
odmycie placka filtracyjnego (dzieje się to głównie w przypadku czyszczenia środkami
zasadowymi) a nawet może powodować pogorszenie stanu membrany w porównaniu do
mycia samymi alkaliami. Natomiast stosowanie podchlorynu sodu (NaClO) poza aspektami
dezynfekującymi powoduje najczęściej całkowite odmycie membrany oraz powrót do
strumienia wyjściowego. Obecność wolnego chloru powoduje utlenianie organicznych
związków osadzających się na membranie, do takich jak, aldehydy, ketony czy kwasy
karboksylowe, które wykazują wyższą hydrofilowość, a więc niższe powinowactwo dla
materiału membrany ceramicznej.
Membrany polimerowe myte są zazwyczaj gotowymi i przeznaczonymi do tego celu
środkami chemicznymi np. P3 Ultrasil 11 (Henkel Ecolab), które są drogie i powodują
jedynie regenerację membrany – powrót do wyjściowego strumienia permeatu a nie
dezynfekcję membrany. Membrany polimerowe mogą być również czyszczone przy pomocy
ultradźwięków, NaOH oraz alkoholu, np. etylowego.
Główne zastosowania mikrofiltracji w przemyśle mleczarskim to:
Sterylizacja mleka i produktów mlecznych
Produkty mleczne są bardzo wrażliwe termicznie i niemożliwa jest klasyczna sterylizacja
z wykorzystaniem wysokiej temperatury. Ekspozycja mleka na wysoką temperaturę (bez
utraty jego cennych właściwości) może mieć miejsce jedynie na kilka sekund. Dodatkowo
wysoka temperatura nie zabija wszystkich mikroorganizmów (ang. thermoduric bacteria –
bakterie, który są odporne na pasteryzację). Powoduje to zmniejszenie okresu trwałości mleka
podczas składowania. W celu pozbycia się mikroorganizmów stosuje się membrany
mikrofiltracyjne, przez które transport składników mleka zachodzi swobodnie, bakterie
natomiast pozostają w strefie retentatu.
Separowanie miceli kazeinowych
Poprzez mikrofiltrację odtłuszczonego mleka, połączoną z diafiltracją, otrzymuje się
stężony roztwór miceli kazeinowych. Technika separacji miceli kazeinowych opiera się
głownie na mikrofiltracji w użyciem membrany o średnicy porów 0.1 do 0.2 [µm]. Uzyskuje
się klarowny permeat składem przypominający serwatkę i zatężony roztwór miceli
kazeinowych o wysokiej jakości.
Odtłuszczanie mleka i serwatki
Istnieje wiele doniesień literaturowych na temat odłuszczania mleka i serwatki przy
pomocy membran. Zoptymalizowana metoda odłuszczania serwatki polega na:
a) Koncentracji przy pomocy membrany ultrafiltracyjnej i zmniejszenie objętości do 25%
początkowej, w temperaturze 50 [˚C],
b) Usunięcia mikroorganizmów przy pomocy membrany mikrofiltracyjnej o średnicy
porów 0.8 [µm],
c) Podniesienia temperatury do 55 [˚C] i pH do wartości 7.5,
d) Separacji kompleksów fosfolipidowych wapnia przy pomocy membrany o średnicy
porów 0.1 [µm].
W efekcie uzyskuje się zupełnie klarowną i całkowicie pozbawioną tłuszczu serwatkę.
2. CEL ĆWICZENIA
Celem ćwiczenia jest opracowanie i monitoring procesu separacji (koncentarcji) białek
zawartych w serwatce przy pomocy mikrofiltracyjnej techniki membranowej.
Uwaga!
Ćwiczeniem wykonywanym przez drugą grupę jest „Perwaporacja”. W czasie tego właśnie ćwiczenia należy
wylać żele elektroforetyczne (SDS-PAGE), by na ćwiczeniu z „Odwróconej osmozy” wykonać elektroforezę w
celu analizy jakościowej separacji, a więc sprawozdanie z tego ćwiczenia należy oddać po tym właśnie
ćwiczeniu (po ok.3 tygodniach).
Wykonanie elektroforezy (znanej Państwu z zajęć prowadzonych w Zakładzie Biochemii PWr) :
1) Wylanie żelu:
Roztwory do wylania żelu:
Żel dolny
Żel górny
MIX: Akrylamid/Bis-akrylamid (1:37.5)
ml
2
Bufor dolny
ml
1.2 -
Bufor górny
ml
H2O
ml
2.74
1.13
10% SDS
μl
60
20
Temed
μl
5
2
10% APS
μl
60
20
-
0.46
0.4
Żele po związaniu należy owinąć w papierowe, mokre ręczniki a następnie folię i schować do lodówki.
3. APARATURA I PRZEBIEG PROCESU
Aparatura przygotowana jest do procesu rozdzielania mieszaniny białek serwatkowych.
Przed przystąpieniem do eksperymentu separacji białek serwatkowych należy zbiornik
zasilający uzupełnić wodą i zmierzyć strumień permeatu (na wodzie).
Separacja białek serwatkowych
Roztwór serwatki o objętości 2 L wlewamy do zbiornika zasilającego (stężenie zostanie
podane przez prowadzącego). Po włączeniu pompy łopatkowej (wirowej), co jest
równoznaczne z rozpoczęciem prowadzenia procesu, uruchamiamy stoper. W trakcie procesu
mierzymy strumień permeatu (co 20 min), stężenie laktozy oraz białek serwatkowych w
permeacie i retentacie, odczytujemy temperaturę i strumień retentatu oraz ciśnienie
transmembranowe.
Układ dodatkowo wyposażony jest w funkcję back – pulsing’u, co zmniejsza niekorzystny
efekt fouling’u, który automatycznie włącza się po uruchomieniu instalacji.
Oznaczanie stężenia białka odbywa się na podstawie analizy Lowry’ego wg krzywej
standardowej (wykonanej na podstawie komercyjnego koncentratu białkowego firmy
„Olimp”): CB (g·L-1) = 0.296 . A750nm. Natomiast stężenia laktozy na podstawie analizy DNS
wg krzywej standardowej CL (g·L-1) = 2.182 . A550nm.
Metoda Lowry’ego:
1.
2.
3.
Do 0,5 ml próbki r-ru białka dodajemy 0,5 ml odczynnika Lowry’ego – czekamy 20 min
Do pkt.1 dodajemy 0,25 ml odczynnika Foilin’a – czekamy 30 min
Pamiętamy o wykonaniu kontroli na wodzie.
Metoda DNS:
1.
2.
3.
Do 0,5 ml próbki r-ru laktozy dodajemy 1,5 ml odczynnika DNS – inkubujemy przez 5 min w 100˚C
Po 5 min chłodzimy próbkę i czekamy kolejne 25 min – przed pomiarem (po 30 min) dodajemy 8 ml
wody
Pamiętamy o wykonaniu kontroli na wodzie.
Po zakończeniu procesu instalację należy usunąć pozostałości serwatki ze zbiornika
zasilającego. Następnie do zbiornika wlać 5% NaClO i myć przez 0,5h, a następnie (po
ponownym usunięciu reszty podchlorynu) przez 0,5h wodą, do momentu uzyskania
wyjściowego natężenia przepływu permeatu.
Uzyskany permeat zamrażamy – posłuży nam do przeprowadzenia odwróconej osmozy!!!
Wykonujemy również posiew na płytce z wylanym podłożem agarowym w celu sprawdzenia
czystości mikrobiologicznej permeatu.
Pobieramy i zamrażamy próbki (nadawy, permeatu oraz retentatu) do wykonania
elektroforezy!!!
4. OBLICZENIA
W ramach sprawozdania należy :
 Przedstawić zależność stężenia białek i laktozy w permeacie i retentacie od czasu;
 Policzyć współczynniki retencji dla białka i laktozy;
 Przedstawić ewentualną zmienność parametrów procesowych (temperatura, ciśnienie,
strumień permeatu oraz retentatu) w czasie;
 Zbilansować układ;
 Policzyć strumień permeatu i przedstawić jego zależność od czasu.
Opracowała: Dr inż. Magdalena Lech