Irena Kłoczko, Tadeusz Chudoba1) PRO´BA ZASTOSOWANIA

Irena Kłoczko, Tadeusz Chudoba1) PRO´BA ZASTOSOWANIA

BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. – XL, 2007, 2, str. 195 – 203
Irena Kłoczko, Tadeusz Chudoba1)
PRÓBA ZASTOSOWANIA WYSOKICH CIŚNIEŃ
HYDROSTATYCZNYCH (UHP) DO DEKONTAMINACJI MIE˛SA
ZARAŻONEGO LARWAMI WŁOŚNIA (TRICHINELLA SPIRALIS)
Katedra Żywności Funkcjonalnej i Towaroznawstwa SGGW w Warszawie
Kierownik Katedry: prof. dr hab. F. Świderski
1)
Instytut Wysokich Ciśnień Polskiej Akademii Nauk w Warszawie
Kierownik: doc. Witold Łojkowski
Próbki mie˛sa zainfekowanego larwami włośnia poddawano działaniu ciśnienia hydrostatycznego 50 – 300 MPa przez 15 min. w temperaturze pokojowej. Badaniom mikroskopowym poddawano larwy w normalnym otoczeniu tkanki mie˛snej, larwy wyizolowane
z tkanki mie˛snej metoda˛ wytrawienia i preparaty histologiczne larw, barwione hematoksylina˛ i eozyna˛. Pełna˛ dekontaminacje˛ mie˛sa uzyskano przy ciśnieniu 200 i 300 MPa.
Hasła kluczowe: wysokie ciśnienia hydrostatyczne, Trichinella spiralis, dekontaminacja, larwy.
Key words: high hydrostatic pressures, Trichinella spiralis, decontamination,
larvae.
W krajach rozwinie˛tych coraz wie˛ksza˛ uwage˛ poświe˛ca sie˛ zagadnieniu żywności bezpiecznej. Zagrożeniem dla żywności bezpiecznej sa˛ wyste˛puja˛ce w niej
zanieczyszczenia, wśród których szczególne miejsce zajmuja˛ zanieczyszczenia
chemiczne i biologiczne. Te ostatnie sa˛ o tyle groźniejsze, że stopień zagrożenia
wynikaja˛cy ze spożycia danego produktu rośnie wraz z czasem jego przechowywania.
Mówia˛c o czystości biologicznej mamy przeważnie na myśli zanieczyszczenia
mikrobiologiczne – obecność bakterii, pleśni czy grzybów i metody ich zwalczania.
Znacznie mniej miejsca poświe˛ca sie˛ zagadnieniom bezpieczeństwa parazytologicznego.
Jedna˛ z najbardziej znanych chorób pasożytniczych, przenoszonych droga˛
pokarmowa˛, jest włośnica, spowodowana przedostaniem sie˛ do organizmu ludzkiego wie˛kszych ilości żywych larw włośnia kre˛tego Trichinella spiralis. Źródłem
inwazji włośni dla człowieka jest głównie zakażone tym pasożytem mie˛so wieprzowe, znacznie rzadziej mie˛so innych zwierza˛t (1).
Metoda˛ obrony przed zakażeniem włośnica˛ jest kontrola weterynaryjna każ0
dego ubitego zwierze˛cia i eliminacja sztuk zakażonych jako niezdatnych do
spożycia (2).
Włośnica wywoływana jest pojawieniem sie˛ w organizmie człowieka larw
żywych, zdolnych do rozwoju i rozmnażania, sta˛d eliminacja tego zagrożenia może
196
I. Kłoczko, T. Chudoba
Nr 2
być osia˛gnie˛ta poprzez pozbawienie żywych, inwazyjnych form włośni (larw),
obecnych w mie˛sie, ich funkcji życiowych, najlepiej przez zabicie.
Istnieje szereg metod niszczenia larw włośni takich, jak działanie wysokich
(> 70°C) i niskich (– 12°C) temperatur (3, 4), napromieniowanie promieniami
elektromagnetycznymi z zakresu mikrofal, ultrafioletu czy gamma (5, 6, 7),
peklowanie za pomoca˛ mieszanek pekluja˛cych (8), przy czym efekt letalny każdego
z tych czynników zależy także od czasu jego działania.
Na przestrzeni ostatnich kilkunastu lat obserwuje sie˛ szybki rozwój badań nad
możliwościa˛ sterylizacji środków żywnościowych za pomoca˛ wysokich ciśnień
hydrostatycznych (Ultra High Pressures – UHP, High Pressure Processing – HPP),
rze˛du 50 – 1000 MPa (9, 10). Skuteczność tych metod okazała sie˛ na tyle wysoka,
że w chwili obecnej wiele produktów utrwalanych za pomoca˛ wysokich ciśnień
znajduje sie˛ w ofercie rynkowej. Wraz z rozwojem badań podstawowych w tej
dziedzinie rozszerza sie˛ kra˛g produktów żywnościowych, nadaja˛cych sie˛ do
sterylizacji metodami wysokociśnieniowymi, a także baza techniczna metod UHP
(wysokowydajne prasy hydrauliczne).
W badaniach dotycza˛cych skutków działania wysokich ciśnień na organizmy
żywe wykazano, że ich wpływ polega na denaturacji białek wskutek rozrywania
wia˛zań mie˛dzycza˛steczkowych i zmian konformacji samych cza˛steczek. W rezultacie naste˛puje obumieranie tkanek i śmierć organizmu.
Literatura naukowa zawiera co najmniej setki prac, poświe˛conych wyjaławianiu różnych produktów żywnościowych, w tym rożnych rodzajów mie˛sa, metoda˛
UHP. Wykazano, że zastosowanie tej metody nie tylko przedłuża trwałość
przechowalnicza˛ produktów, ale w odróżnieniu od innych metod sterylizacji,
pozwala na zachowanie tak poża˛danych cech świeżości produktu, a nawet poprawia niektóre cenne dla konsumenta cechy sensoryczne (np. kruchość mie˛sa).
Prace te dotycza˛ głównie eliminacji zanieczyszczeń mikrobiologicznych (11, 12,
13), przy prawie całkowitym braku zainteresowania możliwościa˛ eliminacji organizmów pasożytniczych (14). To dało podstawe˛ do przeprowadzenia niżej
opisanych badań.
MATERIAŁ I METODYKA
M a t e r i a ł y d o b a d a ń. Tkanka mie˛śniowa myszy zarażonej larwami inwazyjnymi Trichinella
spiralis z hodowli Instytutu Parazytologii PAN. Mysz, samica szczepu SWISS, w wieku 12 tyg.
została zarażona doprzełykowo dawka˛ 500 larw włośnia celem uzyskania otorbionych larw wewna˛trz
jej tkanki mie˛śniowej. Materiał pasożytniczy stanowiły larwy inwazyjne izolatu ludzkiego T. spiralis,
oznaczonego przez włoski ośrodek referencyjny Instituto Superiore di Sanita w Rzymie jako
MHOH/PO/88/ISS67(TI).
Mie˛so wieprzowe używane do badań pochodziło z zakupów rynkowych.
P r z y g o t o w a n i e p r ó b e k. Z uśpionej eterem myszy usunie˛to narza˛dy wewne˛trzne i skóre˛.
Z otrzymanej tuszki wypreparowano przepone˛, która˛ podzielono na 6 cze˛ści. Sama˛ tuszke˛ również
podzielono na 6 cze˛ści (2 kończyny przednie, 2 kończyny tylne, tułów oraz głowa z szyja˛). Każda˛ cze˛ść
tuszki oraz 1 cze˛ść przepony umieszczano wewna˛trz 150 – 200 g porcjach mie˛sa wieprzowego celem
sprawdzenia, czy zastosowane ciśnienie działa skutecznie w głe˛bi tkanki mie˛śniowej. Tak przygotowane
próbki zamykano próżniowo w dwuwarstwowych opakowaniach z folii poliamidowo-polietylenowej
(PAPE).
Nr 2
Zastosowanie UHP do dekontaminacji mie˛sa zarażonego larwami włośni
197
C i ś n i e n i o w a n i e p r ó b e k i p r z y g o t o w a n i e p r e p a r a t ó w d o b a d a ń. Ciśnieniowanie próbek przeprowadzono w Centrum Badań Wysokociśnieniowych PAN korzystaja˛c z prasy
izostatycznej PI-400-100/300 (Radomski 1996 r.) w temperaturze pokojowej (20°C). Stosowano
ciśnienia 50, 100, 150, 200 i 300 MPa. Próbke˛ kontrolna˛ stanowiła przygotowana w identyczny sposób
próbka nie poddana ciśnieniowaniu.
Po rozpakowaniu próbek z cze˛ści zarażonej tkanki mie˛śniowej uwalniano larwy metoda˛ wytrawienia.
Pozostała˛ cze˛ść przepony umieszczano w buforowanej formalinie. Cze˛ść przepony każdej z próbek
podzielono na dwie cze˛ści, z których jedna˛ użyto do obserwacji mikroskopowych larw in situ, z drugiej
sporza˛dzono preparaty histologiczne.
W y t r a w i a n i e l a r w T . s p i r a l i s. Z próbek poddanych działaniu UHP i z próbki kontrolnej
wyizolowano larwy włośni metoda˛ wytrawienia. Tkanke˛ mie˛śniowa˛ próbki rozpuszczano w wodnym
roztworze trawia˛cym, zawieraja˛cym 10 g pepsyny i 7 cm3 ste˛ż. (36%) kwasu solnego w 1000 cm3.
Trawienie prowadzono przez 2 h w temp. 37°C przy cia˛głym mieszaniu mieszadłem magnetycznym.
Larwy wydzielano przez sedymentacje˛ w cylindrach z woda˛ destylowana˛ i płukano kilkakrotnie
w roztworze soli fizjologicznej.
W y k o n a n i e p r e p a r a t ó w h i s t o l o g i c z n y c h. Wycinki przepony utrwalone w buforowanej formalinie płukano w wodzie bieża˛cej, odwadniano przez 2-krotne 30 min. moczenie w 96% etanolu,
jednokrotne 30 min. moczenie w bezwodnym etanolu oraz 2-krotne 10 min. przetrzymanie w acetonie.
Naste˛pnie poddano wycinki dwukrotnemu moczeniu (15 i 30 min.) w ksylenie i zatapiano, w 3stopniowym procesie, w parafinie. Bloczki parafinowe krojono za pomoca˛ mikrotomu, otrzymane
skrawki odparafinowano przez kilkakrotne spłukiwanie kolejno, ksylenem, 96% etanolem i woda˛
destylowana˛. Naste˛pnie barwiono preparaty hematoksylina˛ i eozyna˛, płukano woda˛ destylowana˛
i odwadniano przez kilkakrotne przemycie alkoholem i acetonem, po czym gotowe preparaty zamykano
w balsamie kanadyjskim. W wyniku takiego procesu uzyskiwano fioletowo-niebieskie zabarwienie ja˛der
komórkowych oraz różowe zabarwienie komórek cytoplazmy i włókien mie˛śniowych.
O b s e r w a c j e m i k r o s k o p o w e. Obserwacje mikroskopowe dla oceny procentu larw żywych
w badanych próbkach prowadzono przy powie˛kszeniu × 40. Procent larw żywych w wytrawionych
próbkach określano przez zliczenie 100 larw w kilkunastu polach widzenia i obliczenie wartości średniej
dla każdej próbki.
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Wyniki badań przedstawione w tab. I oraz przykładowo na fotografiach ryc. 1 – 8 wskazuja˛, że
działanie ciśnień hydrostatycznych do 150 MPa w temperaturze pokojowej w minimalnym stopniu
wpływa na przeżywalność larw włośni znajduja˛cych sie˛ w tkance mie˛snej (tab. I). Cze˛ściowy efekt
letalny UHP zaobserwowali Ohnishi i współpr. (14) przy ciśnieniu 175 MPa. W naszych badaniach nie
stwierdzono żadnych oznak życia wśród larw w próbkach poddanych działaniu ciśnień 200 i 300 MPa.
Tabela I
Wyniki badań przeżywalności larw Trichinella spiralis przy 15 min. działaniu różnych ciśnień w temp. 20°C
Table I
Survival of Trichinella spiralis larvae exposed to various pressures for 15 minutes at 20°C
Ciśnienie (MPa)
Larwy żywe (%)
kontrola
97
Larwy martwe (%)
3
50
93
7
100
90
10
150
91
9
200
0
100
300
0
100
198
I. Kłoczko, T. Chudoba
Nr 2
Ryc. 1. Larwy Trichinella spiralis uzyskane metoda˛ wytrawiania
z tkanki mie˛śniowej nie poddanej działaniu ciśnienia (pow. × 125).
Fig. 1. Trichinella spiralis larvae isolated from non-pressurised
(control) meat tissue (× 125 magnificvation).
Ryc. 2. Larwy Trichinella spiralis uzyskane metoda˛ wytrawiania
z tkanki mie˛śniowej poddanej działaniu ciśnienia 50 MPa (pow. × 125).
Fig. 2. Trichinella spiralis larvae isolated from meat tissue
pressurised at 50 MPa (× 125 magnification).
Larwy wyizolowane z tkanki mie˛śniowej próbki kontrolnej posiadały normalny wygla˛d, były
aktywne i silnie zwinie˛te (ryc. 1). Larwy z próbki poddanej ciśnieniu 50 MPa były wcia˛ż aktywne,
ale mniej zwinie˛te, niż larwy z próbki kontrolnej (ryc. 2). Larwy z próbki ciśnieniowanej przy 100 MPa
(ryc. 3) miały wygla˛d zbliżony do wygla˛du larw z próbki traktowanej ciśnieniem 50 MPa. Były mocniej zwinie˛te, niż te ostatnie, ale mniej zwinie˛te, niż larwy z próbki kontrolnej. Larwy poddane
działaniu ciśnienia 150 MPa wykazywały nienaturalna˛ nadskre˛tność. Ciało wie˛kszości larw miało
Nr 2
Zastosowanie UHP do dekontaminacji mie˛sa zarażonego larwami włośni
199
Ryc. 3. Larwy Trichinella spiralis uzyskane metoda˛ wytrawiania
z tkanki mie˛śniowej poddanej działaniu ciśnienia 100 MPa (pow. × 125).
Fig. 3. Trichinella spiralis larvae isolated from meat tissue
pressurised at 100 MPa (× 125 magnification).
Ryc. 4. Larwy Trichinella spiralis uzyskane metoda˛ wytrawiania
z tkanki mie˛śniowej poddanej działaniu ciśnienia 150 MPa (pow. × 125).
Fig. 4. Trichinella spiralis larvae isolated from meat tissue
pressurised at 150 MPa (× 125 magnification).
kształt spirali złożonej z 4 zwojów (ryc. 4). Zwie˛kszenie ciśnienia do 200 MPa (ryc. 5) spowodowało
wyraźna˛ zmiane˛ kształtu ciała larw. Cze˛ść larw uległa wyprostowaniu do kształtu przypominaja˛cego
cyfre˛ „6”, pozostałe były zwinie˛te, podobnie jak w próbce kontrolnej. Podobne kształty zachowały larwy
z próbki poddanej działaniu ciśnienia 300 MPa (ryc. 6).
Badania mikroskopowe larw in situ w mie˛śniach przepony wykazały, że ich wygla˛d nie zależał od
wysokości zastosowanego ciśnienia. Otorbione larwy zachowały charakterystyczny, spiralny kształt,
podobny do kształtu larw próbki kontrolnej. Dobrze zachowane narza˛dy wewne˛trzne larw stwierdzono
również w próbce tkanki mie˛śniowej poddanej działaniu ciśnienia 50, 100 i 150 Mpa. W tym ostatnim
przypadku wokół larw poddanych ciśnieniowaniu widoczne były nacieki komórek limfocytopodobnych.
200
I. Kłoczko, T. Chudoba
Nr 2
Ryc. 5. Larwy Trichinella spiralis uzyskane metoda˛ wytrawiania
z tkanki mie˛śniowej poddanej działaniu ciśnienia 200 MPa (pow. × 125).
Fig. 5. Trichinella spiralis larvae isolated from meat tissue
pressurised at 200 MPa (× 125 magnification).
Ryc. 6. Larwy Trichinella spiralis uzyskane metoda˛ wytrawiania
z tkanki mie˛śniowej poddanej działaniu ciśnienia 300 MPa (pow. × 125).
Fig. 6. Trichinella spiralis larvae isolated from meat tissue
pressurised at 300 MPa (× 125 magnification).
Zaobserwowano, że stichosom larw poddanych działaniu ciśnienia 150 MPa był mniej wyraźny,
niż w przypadku podobnych obrazów larw poddanych działaniu niższych ciśnień (np. 100 MPa,
ryc. 7).
Słabo zachowane, cze˛ściowo zatarte narza˛dy wewne˛trzne larw włośni obserwowano w próbce tkanki
mie˛śniowej poddanej działaniu ciśnienia 200 i 300 MPa. Wykazano, że w 300 MPa wyste˛puje zatarcie
granic mie˛dzy komórkami mie˛śni somatycznych oraz niefizjologiczne rozde˛cie larwy (ryc. 8).
Wszystkie preparaty otorbionych larw, niezależnie od zastosowanego ciśnienia, wykazywały nacieki
komórek limfocytopodobnych wokół larw w tkance mie˛śniowej.
Nr 2
Zastosowanie UHP do dekontaminacji mie˛sa zarażonego larwami włośni
201
Ryc. 7. Otorbiona lawa Trichinella spiralis w tkance mie˛śniowej
poddanej działaniu ciśnienia 100 MPa. Barwienie H-E, pow. × 500. (S – stichosom).
Fig. 7. Trichinella spiralis larva in a meat tissue
pressurised at 100 MPa. Staining with hematoxylin-eosin, × 500 magnification (S – stichosome).
Ryc. 8. Otorbiona larwa Trichinella spiralis w tkance mie˛śniowej poddanej działaniu ciśnienia 300 MPa.
Barwienie H-E, pow. × 250. (R – niefizjologiczne rozde˛cie larwy).
Fig. 8. Trichinella spiralis larva in a meat tissue pressurised at 300 MPa.
Staining with hematoxylin-eosin, × 250 magnification (R – unnatural blowing of the larva).
202
I. Kłoczko, T. Chudoba
Nr 2
WNIOSKI
1. Działanie ciśnienia hydrostatycznego 50 do 150 MPa przez 15 min. w temperaturze pokojowej (20°C) nie wpływa na przeżywalność larw Trichinella spiralis
znajduja˛cych sie˛ w mie˛sie.
2. Ciśnienia rze˛du 200 MPa i wyższe stosowane przez 15 min. w temperaturze
pokojowej powoduja˛ 100% śmiertelność larw T. spiralis.
3. Larwy T. spiralis poddane działaniu ciśnienia 150 MPa, wyizolowane z tkanki
mie˛śniowej, wykazuja˛ objawy patologicznej nadskre˛tności. Zjawiska tego nie
obserwuje sie˛ w przypadku larw otorbionych pozostaja˛cych wewna˛trz tkanki
mie˛śniowej.
4. Ciśnienia rze˛du 200 – 300 MPa wywołuja˛ zmiany w narza˛dach wewne˛trznych
larw T. spiralis objawiaja˛ce sie˛ mniej wyraźnie dostrzegalnym stichosomem oraz
cze˛ściowym zatarciem granic mie˛dzy komórkami mie˛śni somatycznych larw.
5. Ciśnienie hydrostatyczne rze˛du 200 MPa lub wyższe może być wykorzystane
do dekontaminacji mie˛sa zakażonego larwami Trichinella spiralis.
I. K ł o c z k o, T. C h u d o b a
ULTRAHIGH HYDROSTATIC PRESSURES (UHP) USED TO DECONTAMINATE MEAT
INFECTED WITH TRICHINELLA SPIRALIS LARVAE
Summary
Samples of meat infected with Trichinella spiralis larvae were subjected to hydrostatic pressures of
50, 100, 150, 200 and 300 MPa for 15 min at room temperature. The pressurised samples, control
samples, larvae isolated from the samples by enzymatic etching, and the histological specimens obtained
from the infected meat samples were observed under microscope. The survival rate was determined as
the percentage of larvae capable of moving in the course of microscopic observation of the larvae
isolated from the meat samples. It has been found that pressures 200 MPa or higher are lethal to 100% of
the larvae. At lower pressures, some of the larvae survive, but their bodies undergo some deformations
(partial straightening or excessive twisting).
PIŚMIENNICTWO
1. Gerwel C., Pawłowski Z.: Studies on the epidemiology and biology of Trichinellosis in Poland.
Wiadomości Parazytologiczne, 1975; 4-5: 513-540. – 2. Prost E.: Polskie przepisy sanitarno-weterynaryjne. I. Obrót, ubój i badanie sanitarno-weterynaryjne zwierza˛t rzeźnych i mie˛sa. Wydawnictwo AR,
Lublin 1992. – 3. Kotula A.W., Murelli K.D., Acosta-Stein L., Tennent I.: Influence of rapid cooking
methods on the survival of Trichinella spiralis in pork chops from experimentally infected pigs. J. Food
Sci., 1982; 47(3): 1006-1007. – 4. Zimmermann W.J., Olson D.G., Sandoval R., Rust R.E.: Efficacy of
freezing in eliminating infectivity of Trichinella spiralis in boxed pork products. J. Food Protection,
1985; 48(3): 196-199. – 5. Carlin A.F., Mott C., Cash D., Zimmermann W.J.: Destruction of Trichinella
spiralis larvae in beef-pork loaves cooked in microwave ovens. L. Food Sci., 1982; 47(4): 1096-1099,
1118. – 6. Kasprzak W., Pozio E., Rauhut W., Nowosad P.: Effect of low irradiation on Trichinella
irradiates. Acta Parasitologica, 1994; 39(4): 201-207. – 7. Nakayama H., Inaba T., Ozaki T., Kamiya H.:
Effect of ultraviolet irradiation on the development of Trichinella spiralis. Japan. J. of Parasitology,
1996; 45(3): 181-184. – 8. Zimmermann W.J.: Salt cure and drying – time and temperature effect on
viability of Trichinella spiralis in dry-cured hams. J. Food Sci., 1971; 36(1): 58-62. – 9. Carlez A., Rosec
J. P., Richard N. Cheftel J.C.: Bacterial growth during chilled storage of pressure treated minced meat.
Nr 2
Zastosowanie UHP do dekontaminacji mie˛sa zarażonego larwami włośni
203
Lebensm. Wiss. Technol., 1994; 27(1): 48-54. – 10. MacFarlane J.J.: High pressure technology and
meat quality. (w) Development in Meat Science-3., Ralston L.: Elsevier Applied Publishers. London,
New York, 1985.
11. Hugas M., Garriga M., Monfort J.M.: New mild technologies in meat processing: high pressure as
a model technology. Meat Sci., 2002; 62: 359-371. – 12. Szczawiński J., Szczawińska M.E.: Możliwości
inaktywacji drobnoustrojów w produktach spożywczych przy wykorzystaniu metody HPP. Materiały
seminarium: „Dotychczasowe wyniki oraz perspektywy zastosowania wysokich ciśnień w przetwórstwie
żywności w Polsce i w Europie”, 18 – 19 maja 2004. UNIPRESS, Centrum Badań Wysokociśnieniowych
PAN, Warszawa. – 13. Grochalska D., Gajos K., Windyga B., Fonberg-Broczek M., Ścieżyńska H.,
Mroczek J.: Wpływ wysokich ciśnień na właściwości i trwałość surowej pole˛dwicy we˛dzonej. Mie˛so
i we˛dliny, 2001; (6): 24-26. – 14. Ohnishi Y., Ono T., Shigehisa T., Ohmori T.: Effect of high hydrostatic
pressure on muscle larvae of Trichinella spiralis. Jap. J. of Parasit., 1992; 41(5): 373-377.
Adres: 02-776 Warszawa, ul. Nowoursynowska 159.