Badanie przejść fazowych w błonach biologicznych metodą pomiaru

Badanie przejść fazowych w błonach
biologicznych metodą pomiaru anizotropii
fluorescencji
1. Wstęp
Błony biologiczne pełnią kluczową rolę w podstawowych funkcjach i procesach
życiowych komórek, takich jak transport, przemiany energetyczne (oddychanie, fotosynteza), biosynteza i wydzielanie makrocząsteczek, procesy przekazywania informacji, ruchy i podziały komórkowe. Biorą one również udział w zjawiskach związanych z
różnicowaniem komórek i transformacją nowotworową. Tworzenie wewnątrzkomórkowych przedziałów ograniczonych błonami (kompartmentacja) pozwala na równoczesny
przebieg w komórce różnorodnych niezależnych od siebie procesów metabolicznych.
Błony komórkowe stanowiąc barierę odgraniczającą wnętrze komórki od środowiska
zewnętrznego, umożliwiają jednocześnie kontaktowanie się komórki z otoczeniem, poprzez uczestnictwo w oddziaływaniach międzykomórkowych, w zjawiskach kontaktowych, transdukcji sygnału do komórki oraz w rozpoznaniu immunologicznym. Naturalne błony występujące w komórkach, utworzone głównie z cząsteczek lipidów, białek,
steroli i węglowodanów, są układami dynamicznymi, wykazującymi niezwykle złożoną
strukturę o dużej symetrii. Dwuwarstwa lipidowa, w zależności od składu i temperatury,
może się znajdować w stanie ciekłokrystalicznego zolu , o stosunkowo niskim stopniu
uporządkowania łańcuchów węglowodorowych i o dużej swobodzie ruchów, bądź też w
stanie stałokrystalicznego żelu , cechującego się wyższym stopniem uporządkowania
łańcuchów alifatycznych i niższą płynnością. Temperatura, przy której dane fosfolipidy
przechodzą ze stanu stało- do ciekłokrystalicznego nazywa się temperaturą topnienia
lub temperaturą głównego przejścia fazowego (Tt lub Tm ). Utrzymywanie przez komórkę odpowiedniego stanu fizjologicznego domen lipidowych błony ma niezwykle
istotne implikacje funkcjonalne, poprzez wpływ na podstawowe własności fizjologiczne
błon, takie jak: wzajemne oddziaływania pomiędzy składnikami lipidowymi, domenami,
cząsteczkami białek, a także pomiędzy białkami a lipidami.
W badaniach struktury oraz dynamiki molekularnej błon biologicznych niezwykle
przydatne jest użycie uproszczonych układów modelowych o ściśle określonym składzie. Modele błon obejmują najprostsze wodne układy cząsteczek surfaktantów (monowarstwy, micele, mikroemulsje, pęcherzyki detergentowe), mono- i wielowarstwy utworzone z cząsteczek lipidów, a także płaskie i sferyczne dwuwarstwy lipidowe. Te ostatnie, zwane liposomami , posiadają najwięcej analogii do błon plazmatycznych, sposób
ułożenia fosfolipidów w błonie liposomu przypomina budowę błony żywej komórki.
1
Liposomy to pęcherzyki utworzone z
dwuwarstwy lipidowej, ich wnętrze podobnie jak w przypadku błony komórkowej, wypełnia faza wodna. Jedno- lub wieloskładnikowe liposomy tworzone są najczęściej z cząsteczek lipidów powszechnie
występujących w błonach biologicznych,
takich jak: fosfatydylocholina, fosfatydyloetanoloamina, fosfatydyloseryna, fosfatydyloglicerol, sfingomieliny, kardiolipiny,
plazmalogeny, cerebrozydy, gangliozydy,
kwas fosfatydylowy. W skład błon liposomu mogą też wchodzić cząsteczki cholesterolu, kwasów tłuszczowych, glikolipidów, a także peptydy i białka.
Rys.1: Główne typy liposomów i ich własności.
Spośród szeregu metod spektroskopowych, stosowanych w badaniach naturalnych
i modelowych układów błon biologicznych szczególne miejsce zajmują metody fluorescencyjne. Ich zaletą jest między innymi wysoka czułość, wrażliwość na rozmaite właściwości badanego środowiska, możliwość jednoczesnego pomiaru kilku parametrów
obserwowanej emisji fluorescencji, a przede wszystkim możliwość obserwacji różnorodnych procesów dynamicznych. Ponieważ czas życia stanu wzbudzonego fluoroforu
wynosi 10−9 − 10−7 s, to w tym przedziale czasowym można obserwować procesy przebiegające w błonach w nanosekundowej skali czasowej takie jak: dyfuzja rotacyjna i
translacyjna, zderzenia z wygaszaczami fluorescencji, tworzenie kompleksów z rozpuszczalnikami lub ligandami, a także reorientacja środowiska otaczającego fluorofor. Jednym z parametrów fluorescencji, czułych na kinetyczne procesy zachodzące w przedziale
czasu pomiędzy absorpcją a emisją fotonu jest anizotropia fluorescencji. Metody oparte
na pomiarach anizotropii fluorescencji wykorzystywane są do określenia parametrów
płynności błon oraz strukturalnych fluktuacji ich części lipidowej. W tym celu wyznacza się mikrolepkość błony, η. Wielkość ta charakteryzuje średnią lepkość środowiska,
hamującego rotację fluoroforu. Wyznaczenie η w zależności od temperatury umożliwia
określenie stopnia uporządkowania struktury lipidowej oraz ocenę przejść fazowych i
fazowej separacji domen lipidowych.
W pomiarach stacjonarnych anizotropii fluorescencji (ang. steady state) próbkę wzbudza się światłem ciągłym, spolaryzowanym wertykalnie. W izotropowym roztworze fluorofory są zorientowane przypadkowo. Wzbudzeniu ulegają te cząsteczki fluoroforu,
których dipol przejścia absorpcyjnego jest równoległy do wektora pola elektrycznego
światła padającego na próbkę. Zjawisko to nosi nazwę fotoselekcji .
2
Podstawą pomiaru anizotropii fluorescencji jest
fakt, że wzbudzone cząsteczki również emitują światło spolaryzowane. Intensywność światła emitowanego mierzy się prostopadle do kierunku wzbudzenia, przy dwóch ustawieniach polaryzatora obserwacyjnego: wertykalnym (równoległe ustawienie polaryzatora wzbudzającego i
obserwacyjnego, I∥ ) i horyzontalnym (prostopadłe ustawienie, I⊥ ). Anizotropia r i polaryzacja P
są zdefiniowane następująco:
r=
I∥ − I⊥
I∥ + 2I⊥
P =
I∥ − I⊥
I∥ + I⊥
Po przekształceniu otrzymujemy równania opisujące zależności tych dwóch wielkości:
r=
2P
3−P
P =
3r
2+r
Wielkość mierzonej maksymalnej anizotropii fluorescencji (r0 ) zależy od kąta między
dipolami przejścia dla absorpcji i emisji, który jest charakterystyczny dla danego fluoroforu, jak również od długości fali promieniowania wzbudzającego. W rzeczywistości
uzyskiwana w pomiarach wartość jest niższa od maksymalnej, ze wzg1ędu na częściową
depolaryzację światła emitowanego. Główną tego przyczyną jest dyfuzja rotacyjna cząsteczki. Może również dochodzić do przeniesienia energii promieniowania między fluoroforami (przy spełnieniu warunków koniecznych dla zajścia tego procesu). Ruchy rotacyjne występujące w czasie trwania stanu wzbudzonego zależą od 1epkości rozpuszczalnika oraz rozmiaru i kształtu rotujących cząsteczek. Im większa szybkość rotacji, tym
wyższy stopień depolaryzacji i niższa, mierzona anizotropia. Dla cząsteczek w kształcie
kulistym zjawisko depolaryzacji fluorescencji opisuje równanie Perrina :
r0
τ
=1+
r
ϕ
gdzie τ jest czasem życia fluorescencji, zaś ϕ jest czasem rotacyjnej korelacji, opisanym
równaniem:
ηV
ηM
1
ϕ=
=
(ν + h) =
kT
RT
6D
W powyższym wzorze:
η jest lepkością roztworu [P],
T jest temperaturą bezwzględną [K],
R to stała gazowa równa 8, 314 [J K−1 mol−1 ],
k to stała Boltzmana równa 1, 38 · 10−23 [J K−1 ],
M to masa molowa cząsteczki białka,
V jest objętością rotującej cząsteczki,
ν jest objętością właściwą cząsteczki (dla białek z reguły przyjmuje się wartość 0, 73 ml/g),
h to uwodnienie (0, 23 ml H2 O na 1 g białka),
D to współczynnik dyfuzji rotacyjnej.
3
Kiedy ϕ ≫ τ , wówczas ϕτ → 0 i obserwowana anizotropia zmierza do wartości maksymalnej (r → r0 ).
W pomiarach należy wyeliminować czynnik związany z różną przepuszczalnością
monochromatora dla światła wertykalnie i horyzontalnie spolaryzowanego. Dlatego mierzy się również intensywności światła emitowanego wzbudzając próbki światłem polaryzowanym horyzontalnie, przy ustawieniu wertykalnym (IHV ) i horyzontalnym (IHH )
polaryzatora emisyjnego (obserwacyjnego). Skorygowany wzór na anizotropię ma wówczas postać:
IHV
IV V − GIV H
, gdzie G =
r=
IV V + 2GIV H
IHH
Podstawowym elementem prawie wszystkich metod fluorescencyjnych w badaniach
błon jest użycie sond (znaczników) fluorescencyjnych. Są to różnorodne związki chemiczne zdolne do wydajnej fluorescencji oraz do wiązania się w określonych miejscach
błony. Przy wyborze odpowiedniej sondy do badań należy mieć na uwadze jaki jest charakter i miejsce wiązania się znacznika w błonie, jakich informacji o procesach dynamicznych się oczekuje, a także należy uwzględnić właściwości fluorescencyjne sondy
oraz charakter jej oddziaływania z otoczeniem.
2. Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest wyznaczenie temperatury podstawowego przejścia fazowego
dwuwarstwy lipidowej liposomów utworzonych z dimyristoilofosfatydylocholiny (DMPC)
w oparciu o stacjonarne pomiary anizotropii fluorescencji znacznika fluorescencyjnego
1,6-difenyloheksatrienu (DPH).
3. Obowiązujący materiał
1. Budowa i funkcje błon biologicznych, dynamika błon, przejścia fazowe fosfolipidów.
2. Układy modelowe błon biologicznych.
3. Fluorescencja, anizotropia fluorescencji, wykorzystanie anizotropii fluorescencji
w badaniach dynamiki błon biologicznych, znaczniki fluorescencyjne.
4
4. Wykonanie ćwiczenia
Wykonanie liposomów:
1. Odsuszoną mieszaninę DPH i DMPC rozpuścić w etanolu
poprzez intensywne mieszanie: maksymalnie 5% v/v końcowej ilości EtOH w próbce.
2. Roztwór dodać do 1 ml roztworu wodnego w kuwecie w
temperaturze ponad 30 ◦ C (np. w krystalizatorze w kąpieli wodnej). Roztwór należy wstrzyknąć ze strzykawki
Hamiltona, przy czym wylot igły powinien być umieszczony tuż nad mieszadłem magnetycznym mieszającym
energicznie wodę w kuwecie (Rys. 2).
3. Mieszanie kontynuować jeszcze ok. 2 min. (mieszanina
powinna być opalizująca).
Pomiar:
Rys. 2: Schemat wykonywania liposomów.
1. Wykonać widma emisyjne i ekscytacyjne fluorescencji
DPH dla polaryzatorów w ułożeniach VV, wybrać optymalną parę Ex/Em.
2. Zmierzyć intensywność fluorescencji przy czterech ułożeniach polaryzatorów VV, VH, HH, HV w zakresie temperatur 10 − 40 ◦ C co ok. 3 ◦ C.
5. Opracowanie danych
Analizę danych należy przeprowadzić z użyciem:
• arkusza kalkulacyjnego (np. LibreOffice Calc)
• oprogramowania do liniowej i nieliniowej regresji danych (np. Origin 2016, fityk,
gnuplot)
Proszę o przyniesienie własnych laptopów z zainstalowanym wymaganym oprogramowaniem.
5
Przejścia fazowe błon lipidowych & anizotropia fluorescencji
zagadnienia na kolokwium
1. Polaryzacja światła. Zasada działania polaryzatorów.
2. Na czym polega zjawisko anizotropii fluorescencji r (emisja światła spolaryzowanego).
Jakie muszą być spełnionie warunki aby ją zaobserwować (wzbudzenie spolaryzowanym światłem, zasada fotoselekcji, czemu w detekcji używamy polaryzatora emisyjnego).
Fotoselekcja
Wzbudzeniu ulegają preferencyjnie te cząsteczki fluoroforu, których moment dipolowy przejścia
absorpcyjnego jest równoległy do wektora pola elektrycznego światła padającego na próbkę.
r=
I∥ − I⊥
I∥ + 2I⊥
I⊥ = 0 → r = 1
I⊥ = I∥ → r = 0
← depolaryzacja
I∥ = 0 → r = −0.5
• Co oznacza I∥ i I⊥ (jakie ułożenie polaryzatorów)?
• Czemu służy mianownik? I∥ +2I⊥ : całkowita intensywność fluorescencji próbki, normalizacja ⇒ r niezależne
od stężenia
Rysunek 1: Schemat pomiaru.
• Jakie wartości przyjmuje r? r ∈ [−0.2, 0.4] (prawdopodobieństwo w fotoselekcji)
3. Co wpływa na r?
• rotacja fluoroforu: ↓ lepkość ⇒ r → 0; ↑ temperatura ⇒ r → 0; ↓ wielkość ⇒ r → 0; kształt
• transfer energii: FRET, reabsropcja emisji ⇒ r → 0
• Od czego zależy anizotropia maksymalna/fundamentalna r0 ?
Anizotropia maksymalna/fundamentalna r0
Anizotropia fluorescencji mierzona gdy nie dochodzi do zjawisk depolaryzacyjnych: dyfuzji rotacyjnej oraz transferu energii. Jest charakterystyczna dla danego fluoroforu. Zależy
od kąta β między momentami dipolowymi absorpcji i emisji; β zależy długości fali światła
wzbudzającego. β = 0◦ ⇒ r0 = 0.4, β = 90◦ ⇒ r0 = −0.2
Jeżeli fluorofor obraca się, to zgodnie z równaniem Perrina (r =
r0
1+ τθ
) |r| < |r0 |.
4. Ogólna budowa fosfolipidów; oznaczenia kwasów tłuszczowych (np. 14:0 14 atomów C, brak wiązań =).
5. W jaki sposób budowa lipidów wpływa temperaturę głównego przejścia fazowego (topniena) Tm :
•
•
•
•
↑ wielkość głowy polarnej ⇒ ↓ Tm
ładunek głowy polarnej: np. odpychanie elektrostatyczne ⇒ ↓ Tm
↑ długość łańcuchów tłuszczowych ⇒ ↑ Tm
stopień nienasycenia łańcuchów tłuszczowych: obecność wiązań = w konformacji cis ⇒ ↓ Tm
6. Jak zmienia się r(T ) podczas ogrzewania znakowanych fluorescencyjnie liposomów (sigmoida). Jak
interpretować r(T ) (gdzie znajduje się obszar przejścia fazowego, jak odczytać Tm - punkt przegięcia).
7. Do jakich badań można zastosować pomiar r i dlaczego (zmiana prędkości rotacji i czasu rotacyjnej
korelacji θ).