IV. Streptococcus, Enterococcus – ćwiczenia praktyczne

IV. Streptococcus, Enterococcus – ćwiczenia praktyczne
Ćwiczenie 1. Ocena wzrostu szczepów paciorkowców na:
a. agarze z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej (AK)
typ hemolizy………………………………………………………
morfologia kolonii……………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
………………………………...........................................
gatunek drobnoustroju: …………………………………………………………….
typ hemolizy………………………………………………………
morfologia kolonii……………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
………………………………...........................................
gatunek drobnoustroju:………………………………………………………………..
b. podłożu D- coccosel z eskuliną
morfologia kolonii……………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
………………………………..............................................
............................................................................
c.
1.
2.
3.
4.
podłożach płynnych
bulion cukrowy
podłoże bulionowe z 6,5% NaCl
podłoże bulionowe o pH=9,6
podłoże bulionowe z 40% żółcią
Streptococcus pneumoniae
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
1
2
3
4
Streptococcus pyogenes
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
1
2
3
4
Enterococcus faecalis
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
1
2
3
4
Wnioski ......................................................................................................................................
………………………………………………………………………………….………………
………………………………………………………………………………………………….
Ćwiczenie 2. Wykonanie preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama
Wykonanie ćwiczenia:
Opis wykonania ćwiczenia przy temacie V. Budowa komórki bakteryjnej i metody barwienia
preparat bawiony metodą Grama
Opis preparatu:
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
Ćwiczenie 3. Oznaczanie cech biochemicznych paciorkowców
a. wykonanie próby na katalazę
Wykonanie ćwiczenia:
Opis wykonania ćwiczenia przy temacie VII. Fizjologia bakterii
Szczep badany
………………………………..
…………………………………….
obserwowane wyniki
Wnioski ......................................................................................................................................
………………………………………………………………………………….………………
………………………………………………………………………………………………….
b. test wrażliwości na bacytracynę
Test różnicuje paciorkowce β-hemolizujące. Szczególną wrażliwość na bacytracynę
wykazują paciorkowce grupy A (Streptococcus pyogenes)
Wykonanie ćwiczenia:
Na podłoże Muellera-Hintona z dodatkiem 5% krwi baraniej, posiać jałową wymazówką
zawiesinę hodowli płynnej badanego szczepu (0,5 w skali Mc Farlanda). Następnie na
powierzchnię podłoża nałożyć krążek bibułowy nasączony 0,04u bacytracyny. Całość
inkubować w temp. pokojowej 30 minut a następnie w 350 przez 18-24 godziny.
Jako wynik wrażliwości uznaje się strefę zahamowania wzrostu wokół krążka z
bacytracyną ≥15 mm.
bacytracyna 0,04u
Wnioski ......................................................................................................................................
………………………………………………………………………………….………………
………………………………………………………………………………………………….
c. test wrażliwości na optochinę
Optochina w bardzo małych stężeniach (mniej niż 5µg/ml) w sposób wybiórczy ma
zdolność hamowania wzrostu Streptococcus pneumoniae, co różnicuje te dwoinki od
innych paciorkowców α-hemolizujących.
Wykonanie ćwiczenia:
Na podłoże Muellera-Hintona z dodatkiem 5% krwi baraniej, posiać jałową wymazówką
zawiesinę hodowli płynnej badanego szczepu (0,5 w skali McFarlanda). Następnie na
powierzchnię podłoża nałożyć krążek bibułowy nasączony optochiną o stężeniu 5µg.
Całość inkubować w temp. pokojowej 30 minut a następnie w 350 przez 18-24 godziny.
Jako wynik dodatni uznaje się pojawienie się strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z
optochiną bez względu na wielkość strefy. Przy strefie ≤ 14mm, wynik potwierdzić innymi
metodami.
optochina 5µg
Wnioski ......................................................................................................................................
………………………………………………………………………………….………………
………………………………………………………………………………………………….
d. wykrywanie zdolności do redukcji TTC
Zdolność redukowania chlorku 2,3,5-trifenylotetrazoliowego umożliwia zróżnicowanie
szczepów Enterococcus spp. Próbę tę wykonuje się na podłożu stałym lub płynnym z
dodatkiem 0,01% TTC.
Wykonanie ćwiczenia:
Badane bakterie posiać na podłoże z dodatkiem 0,01% TTC i inkubować przez 24-48 godzin.
Bakterie mające zdolność do redukcji TTC rosną na podłożu stałym w postaci kolonii
ciemnoczerwonych, a na podłożu płynnym tworzą strąt zabarwiony na ten kolor.
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
………………………………..............................................
............................................................................
Wnioski ……………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
………………………………..............................................
............................................................................
e. test CAMP
Czynnik CAMP jest białkiem enzymatycznym działającym, jako ko-cytolizyna na
częściowo zhemolizowane przez β-hemolizynę gronkowcową krwinki baranie. Wynikiem
tego działania jest tzw. synergistyczna hemoliza.
Wykonanie ćwiczenia:
1. Na powierzchnię płytki agarowej z 5% krwią baranią posiać liniowo (przez środek
szalki) szczep Staphylococcus aureus ATCC 25923 wytwarzający hemolizę β.
2. Prostopadle do linii posiewu, w bliskiej odległości (ale nie dotykając) posiać badany
szczep.
3. Płytkę inkubować przez 18-24 godzin w temperaturze 350C.
4. Wytwarzanie czynnika CAMP objawia się pojawieniem strefy wzmożonej hemolizy w
postaci przejaśnienia, często o kształcie jasnego grota strzały, w miejscu gdzie linia
posiewu szczepu nachodzi na strefę hemolizy β gronkowca.
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Szczep badany
Wnioski ......................................................................................................................................
………………………………………………………………………………….………………
………………………………………………………………………………………………….
f. Test PYR
Test służy do różnicowania rodzajów Enterococcus i Streptococcus. W teście tym
wykrywa się obecność enzymu L-pyrolidonyloaryloamidazy. Enzym ten odszczepia βnaftylamid z substratu, którym jest L-pyrolidonylo-β-naftyloamid. Uwolniony związek z
barwnikiem diazowym tworzy kompleks o barwie różowoczerwonej.
Wykonanie ćwiczenia:
1. Nasycony substratem krążek bibułowy zwilżyć należy wodą destylowaną i nanieść
badaną hodowlę.
2. Po 2 minutach dodać odczynnik diazowy i po ok. 60 sekundach odczytać wynik.
3. Stwierdzenie zmiany zabarwienia na kolor czerwony świadczy o dodatnim wyniku
testu.
Wnioski
......................................................................................................................................
………………………………………………………………………………….………
g. Identyfikacja grup serologicznych paciorkowców β-hemolizujących
Badanie można wykonać przy użyciu testu Pastorex STREP (BIORAD)
Wykonanie ćwiczenia:
1. Przygotowanie enzymu do ekstrakcji
Do liofilizatu dodać 10 ml wody destylowanej i wymieszać do rozpuszczenia.
Roztwór jest stabilny przez 4 miesiące w temp. + 2 do + 8oC.
2. Wykonanie testu
· 0,3 mln enzymu do ekstrakcji umieścić w probówce i zawiesić w nim 5 do 10 kolonii
świeżej hodowli paciorkowca β-hemolizującego.
· Inkubować 15–45 minut w temp. pokojowej, lub 10 – 30 minut w temp. 37oC
· Wymieszać wszystkie surowice lateksowe (A,B,C,D,F,G) i nanieść po 1 kropli każdej
z nich na oddzielne pola załączonej do testu płytki.
· Używając jałowej pipety dodać po 1 kropli ekstraktu enzymatycznego badanego
szczepu do wszystkich rozpipetowanych surowic na karcie.
· Wymieszać przy pomocy pałeczek (do każdej kropli oddzielna).
· Obracając ruchem kolistym płytkę odczytać wynik: reakcja pozytywna przejawia się
widoczną aglutynacją występującą w czasie do 1 min.
· Badanie przeprowadzać zawsze wykonując kontrolę dodatnią.
Wnioski ......................................................................................................................................
………………………………………………………………………………….………………
………………………………………………………………………………………………….
Ćwiczenie 4. Interpretacja wyniku badania lekowrażliwości szczepów:
szczep …………………………………….
a. Dokonaj pomiaru stref zahamowania wzrostu wokół krążków.
Antybiotyk
symbol/dawka Strefa
na krążku
zahamowania
wzrostu w
mm
Interpretacja wyniku
b. Uzupełnij tabelkę o informacje dotyczące szczepów:
Streptococcus spp.
Antybiogram podstawowy
Enterococcus spp.
Antybiogram rozszerzony
Oznaczane mechanizmy
oporności
Ćwiczenie 5. Uzupełnij tabele o informacje dotyczące paciorkowców
Tab.I. Gatunki paciorkowców najczęściej izolowane od człowieka
grupa
I
II
III
IV
V
VI
VII
gatunki
Tab. II. Grupy serologiczne paciorkowców o znaczeniu klinicznym (podział wg
Lancefield)
Grupa serologiczna wg
Lancefield
A
gatunek
B
C
D
F
G
Tab. III. Podział paciorkowców w zależności o typu wywoływanej hemolizy
Gatunek
S. pyogenes , S. agalactiae, S. equisimilis ,
S. canis, S. equi,
S. bovis, S.equinus
S. mitis, S. oralis, S. sanguis, S. pneumoniae
S. mutans, S. sobrinus
S. salivarius
S. anginosus, S. intermedius, S. constelatus
Enterococcus faecalis, E. faecium
Typ hemolizy