Zarys biologii molekularnej genu

Zarys biologii molekularnej genu
Replikacja i stabilność genomu
1
Podstawowe strategie i narzędzia
genetyki molekularnej
Czym jest inżynieria genetyczna?
Ang. recombinant DNA – manipulacje DNA in vitro
} 
} 
} 
izolacja i amplifikacja DNA i cDNA
mapowanie i sekwencjonowanie DNA
tworzenie nowych cząsteczek DNA
} 
} 
} 
} 
wprowadzanie konstruktów DNA do komórek i organizmów
modyfikacje syntezy białek
} 
} 
3
przez rekombinację cząsteczek naturalnych
przez syntezę de novo
ekspresja heterologiczna
bioinformatyka
A co nie jest inżynierią genetyczną?
} 
Inżynieria embrionalna (np. klonowanie)
} 
Tworzenie nowych form organizmów przez selekcję
4
Zastosowania
} 
} 
Badania podstawowe
Biotechnologia
Granica między badaniami podstawowymi a stosowanymi jest płynna,
stosowane techniki są podobne, różnice dotyczą głównie skali.
5
Podstawowe techniki
} 
Izolacja DNA
} 
} 
} 
} 
} 
PCR
Klonowanie DNA
Mutageneza losowa i ukierunkowana
} 
} 
} 
6
cDNA – izolacja RNA i przepisanie na DNA
Chemiczna synteza DNA de novo
w tym wprowadzanie modyfikacji do genomu
Wykrywanie DNA, RNA i białek
Sekwencjonowanie
Sekwencjonowanie - postęp techniczny
} 
} 
} 
} 
Koszt sekwencjonowania między 1999 a 2009 obniżył sie 14
000 razy
Prędkość odczytu sekwencji między 2000 a 2010 r. wzrosła 50
000 razy
Cel: sekwencja genomu jednej osoby za 1000$ osiągalny w
ciągu kilku lat
Im więcej znamy sekwencji, tym łatwiej poznajemy kolejne
7
Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe
Tzw. deep sequencing
}  Generowanie w jednym przebiegu milionów
niezależnych odczytów
}  Pojedyncze odczyty krótkie (25-400 bp)
}  Zastosowania
} 
} 
} 
sekwencjonowanie nowych genomów
resekwencjonowanie
} 
} 
8
np. analiza zmienności
badanie ekspresji przez sekwencjonowanie cDNA
Solexa
350 =
9
Solexa® Ultrahigh-throughput
DNA Sequencing
Platform
Genomika
Genomika jest dziedziną zajmującą się badaniem
całych genomów (kompletu informacji genetycznej)
różnych organizmów
}  Techniki biologii molekularnej + robotyka +
informatyka
}  Sekwencjonowanie i charakteryzowanie genomów
}  Badanie funkcji zawartych w nich genów
} 
10
Metagenomika
Izolacja DNA ze środowiska i sekwencjonowanie
}  Jedyny sposób badania mikroorganizmów, które nie
dają się hodować
} 
11
Metagenomika
} 
12
Analiza sekwencji całości DNA wyizolowanego ze
zbiorowiska organizmów
RNA-seq
Co to znaczy?
TCACAATTTAGACATCTAGTCTTCCACTTAAGCATATTTAGATTGTTTCCAGTTTTCAGCTTTTATGACTAAATCTTCTAAAATTGTTTTTCCCTAAATGTAT
ATTTTAATTTGTCTCAGGAGTAGAATTTCTGAGTCATAAAGCGGTCATATGTATAAATTTTAGGTGCCTCATAGCTCTTCAAATAGTCATCCCATTTTATACA
TCCAGGCAATATATGAGAGTTCTTGGTGCTCCACATCTTAGCTAGGATTTGATGTCAACCAGTCTCTTTAATTTAGATATTCTAGTACATACAAAATAATACC
TCAGTGTAACCTCTGTTTGTATTTCCCTTGATTAACTGATGCTGAGCACATCTTCATGTGCTTATTGACCATTAATTAGTCTTATTTGTTAAATGTCTCAAAT
ATTTTATACAGTTTTACATTGTGTTATTCATTTTTTAAAAAATTCATTTTAGGTTATATGTATGTGTGTGTCAAAGTGTGTGTACATCTATTTGATATATGTA
TGTCTATATATTCTGGATACCATCTCTGTTTCATGCATTGCATATATATTTGCCTATTTAGTGGTTTATCTTTTCATTTTCTTTTGGTATCTTTTCATTAGAA
ATGTTATTTATTTTGAGTAAGTAACATTTAATATATTCTGTAACATTTAATGAATCATTTTATGTTATGTTTAGTATTAAATTTCTGAAAACATTCTATGTAT
TCTACTAGAATTGTCATAATTTTATCTTTTATATACATTGATATTTTTATGTCAAATATGTAGGTATGTGATATTATGCACATGGTTTTAATTCAGTTAATTG
TTCTTCCAGATGTTTGTACCATTCCAACATCATTTAAATCATTAAATGAAAAGCCTTTCCTTACTAGCTAGCCAGCTTTGAAAATCCATTCATAGGGTTTGTG
TTAATATATTTTTGTTCTTTTTTTTCCTTTCTACTGATCTCTTTATATTAATACCTACTGTGGCTTTATATGAAGTCATGGAATAATACGTAGTAAGCCCTCT
AACACTGTTCTGTTACTGTTGTTATTGTTTTCTCAGGGTACTTTGAAATATTCGAGATTTTATTATTTTTTAGTAGCCTAGATTTCAAGATTGTTTTGACGAT
CAATTTTTGAATCAATTGTCAATATTTTTAGTAATAAAATGATGATTTTTGATTGGAAATACATTAAATCTATAAGCCAAATTGGAGATTATTGATATATTAA
CAAAAATGAGTTTTCCAGTCCATGAATGTATGCACATTATAAAATTCATTCTTAAGTATGTCATTTTTTAAGTTTTAGTTTCAGCAGTATATGTTTGTTACAT
AGGTAAACTCCTGTCATGGGGGTTAGTTGTACAGGTTATTTTATCATCCAGGCATAAAGCCCAGTACCCAGTAGTTATCTTTTCTGCTCCTCTCCCTCCTGTC
ACCCTCCACTCTCAAGTAGACCCCAGTTTCTGTTGTTCTCTTCTTTGCATTAATGACTTCTCATCATTTAGATTGCACTTGTAAGTGAGAACAGGACGTATGT
GGTTTTCTACTCCTGTGTTAGTTTGCTAAGGATAACCACCTCCATCTCCATCCATGTTCCCACAAAAGACATGATCTCCTTTTTTATGGCTGCATATTATTCC
ATGGTATATATGTACCACATTTTCTTTATCCAATCTGTCATTGATGGACATTTAGGTTGTTTCCACATCATTGCCGTTGTAAATACTGCTGCAGTGAATATTC
GTGTGTATGTCTTTATGGTAGAATGATTTATATTCCTCTGGGTATATTTCCAAGTAATGGGATGGTTGGGTCAAATGGTAATTCTGCTTTTAGCTTTTTGAGG
AATTGCCATATTGCCTTTCACAACGGTTGAACTAATTTATACTCCCAAGAGTGTATAAGTTGTTCCTTTTTCTCTGCAACCTCGACATCACCTGTTATTTATG
ACTTTTATATAATAGCCATTCTGCTGGTCTGAGATGGTATCTCATTATGATTTTGATTTGCATTTCTCTAATGCTCAGTGATATTGAGCTTGGCTGCATATAT
GTCTTCTTTTAAAAATATCTGTTCATGTCCTTTGCCTAATTTATAACGGGGTTGTTTGTTTTTCTCTTGTAAATTTGTTTAAGTTCCTTATAGATTCTAGGTA
TTAAACCTTTTTTCAGAGGCGTGGCTTGCAAATATTTTCTCCCATTCTATAGGTTGTCTGTTTATTCTGTTGATAGTTTCCCTTGCTGTGCAGAAGCTCTTAA
CTTTAATTAGATCCGACTTGTCAATTTTTGCTTTGGTCGCAATTGCTTTTGATGTTATTGTCGTGAAATCTTTGCTAGTTCTTAGGTCCAGGATGATATTGCC
CAAGTTGTCTTCCAGGGCTTTTATAATTTTGGATTTTACATTTAAGTCTTAATATATTTATTAAATTTGTTAGGGTTTCAGGATACAAGGACAATATAGCAGC
AAACAATGTAAAAGTAAAATCTGAAAAATAATAGAAAACAGTTTAATTGAACACTTTACCATTATGTAATGCCCTTCTTTGTCTTTCCTGATCTTTGTTGGTT
TGAAGTTCAAAAAAGACAAACTTAATGGTACAATAGGTATTGTAGATTTCAGGACTTTCTGTATAAAATATTTTGTATATATGAATAGATCATTTTTTATTTC
CAGTCTTTAAACATTTTCTTAACATTTTCTTCTATTGCTTCACTTCACTCGCTAGGACCATCAGGACAGTGTTGAACAGAAATTGTCAGACTGATCATCACAA
CTTTTTCTAGATTTTAGAAGGAAATTTTTCTTTATTTCAACATAAAGCAGCATGTTAATGCCAAGTTTTAATATGTGTTATCAGATTGAAATTTTTTTGTATA
TTTCTACATTACCAAGAATTTTTAGCAAGAGTTTTTGTTGAGTTTTAATTTAAAAATCATTTGTTAATTTCATCTGATTTTTTTATTTCTCTTTTTACCTTAA
GAGATTAAACTGACTACAGATTGAATATAAACAAACAAACAAACAAACAAAAACTCTAAAATGCTGTGGATCAACACCACTTAGTAATTTGTATACTTGGATT
CAATTTGCTGAAATTTTGTTAGACATTTTTGCGTCGATATTTATGAGGGATGTTGATCTGTAAAAGTATTAAAATGCCTTTGACAGATAGTGTCACCATATAA
AAAACTTTGAACAAAATCAGATTATATCACTGTGGATATTTCTATTTTGAACTAACTTAGATGATAATTTTAATCTATATCCTAGATGAACT
14
Mały fragment chromosomu 21
Odwrotna genetyka – od genu do funkcji
15
Genetyka tradycyjna
Genetyka „odwrotna”
Funkcja (mutacja, fenotyp)
Gen (z sekwencji całego genomu)
Klonowanie genu
Inaktywacja genu
Analiza sklonowanego genu
Analiza uzyskanego fenotypu
Odwrotna genetyka – inaktywacja przez
rekombinację
16
Myszy transgeniczne
} 
Wprowadzanie nowych sekwencji do genomu
} 
} 
} 
np. geny reporterowe
Delecje genów (knock-out)
Wprowadzanie mutacji punktowych
Myszy knock-out
} 
} 
} 
} 
Izolacja komórek ES (zarodkowe macierzyste) z blastocysty
Dawcą jest mysz szczepu białego
Modyfikacja i selekcja komórek ES z knock-out
Wprowadzenie zmodyfikowanych komórek do blastocysty myszy
szczepu szaregu
Myszy knock-out
} 
Blastocysty zawierające zmodyfikowane komórki ES
wszczepia się myszy – matce zastępczej
Myszy knock-out
} 
Selekcja chimer z transgenem w linii płciowej
Nagroda Nobla 2007
Mario R. Capecchi, Martin J. Evans, Oliver Smithies
}  Za opracowanie zasad wprowadzania specyficznych
modyfikacji genowych u myszy za pomocą zarodkowych
komórek macierzystych
} 
Odwrotna genetyka – interferencja RNA
Odkrycie roku 2002 –
regulacyjna rola małych RNA
22
Nagroda Nobla w dziedzinie
medycyny 2006, za odkrycie
mechanizmu interferencji RNA
A. Fire i C. Mello
Ekspresja heterologiczna
Wektor ekspresyjny
23
Oczyszczanie białka
Fuzje białkowe
} 
Do sekwencji kodującej białko dołącza się inną domenę,
np. ułatwiającą wykrycie i/lub oczyszczanie
} 
} 
24
znaczniki epitopowe
GFP (zielone białko fluorescencyjne)
Ekspresja heterologiczna w biotechnologii
25
Inżynieria przeciwciał
Humanizowane i rekombinowane przeciwciała są stosowane w terapii np.
nowotworów
26
http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/
Terapia genowa
} 
Zastępująca – wprowadzenie genu, którego defekt powoduje
chorobę
} 
} 
} 
Trudności z opracowaniem wektorów i zapewnieniem ekspresji,
zwłaszcza dla komórek nie dzielących się
Stosowana dla chorób związanych z ekspresją genów w komórkach
krwi (np. SCID – gen ADA) i innych, które łatwo wprowadzić do
organizmu (np. makrofagi – choroba Gauchera)
Inaktywująca – zmniejszenie ekspresji genu, którego
ekspresja powoduje chorobę (np. nowotworową)
} 
} 
27
Technicznie łatwiejsze i bezpieczniejsze (siRNA, modyfikowane
oligonukleotydy)
Ograniczone zastosowania, pacjent musi ciągle przyjmować
kosztowne leki
Pionierskie doświadczenia
Griffiths
Bakterie zawerają „czynnik
transformujący, zdolny do
przekazania informacji z
żywych bakterii do martwych
Avery, McLeod, McCarthy
Czynnikiem transformującym
jest DNA
28
Materiał genetyczny
Materiałem genetycznym są kwasy nukleinowe
}  Materiałem genetycznym organizmów komórkowych
jest kwas deoksyrybonukleinowy (DNA)
} 
29
Budowa DNA
DNA zbudowany jest z
nukleotydów
podwójna helisa DNA
30
Zasada komplementarności pozwala na
replikację DNA
Na podstawie sekwencji jednej nici można
jednoznacznie odtworzyć sekwencję nici
komplementarnej
5’GATGTACTGATGACATA3’
3’CTACATGACTACTGTAT5’
5’GATGTACTGATGACATA3’
3’CTACATGACTACTGTAT5’
31
Centralna hipoteza („dogmat”)
DNA
RNA
BIAŁKO
32
Model semikonserwatywny replikacji
33
Inne modele replikacji
Rozproszony
Semikonserwatywny
Konserwatywny
34
Doświadczenie Meselsona i Stahla
35
Doświadczenie Meselsona i Stahla
36
Etapy replikacji
} 
} 
} 
Inicjacja
Elongacja
Terminacja
37
Inicjacja
} 
Rozplecenie (topnienie) podwójnej helisy DNA
Inicjacja replikacji u bakterii
38
Inicjacja u Eukaryota
39
Elongacja
40
Replikacja małego genomu kolistego –
pętla D
41
Replikacja małego genomu kolistego – rolling
circle
42
Problem topologiczny
• Replikacja DNA postępując będzie generować
naprężenia (superskręty)
• W DNA liniowym praktycznie nierozwiązywalne
ze względu na upakowanie w komórce
• W DNA kolistym absolutnie nierozwiązywalne
ze względu na brak wolnych końców
43
Problem topologiczny - topoizomerazy
Topoizomeraza typu I wprowadza nacięcie w jednej z nici, przesuwa
drugą nić przez przerwę i łączy końce
Topoizomerazy typu II nacinają obie nici
44
Synteza DNA - polimeraza
• Synteza DNA (i RNA też) zawsze
zachodzi przez dołączanie nowych
nukleotydów do grupy –OH na końcu
3’ syntetyzowanej cząsteczki
• Substratem są trójfosforany
nukleotydów, enzymem polimeraza
(zależna od DNA polimeraza DNA)
• Polimeraza DNA potrafi dobudowywać
nukleotydy do istniejącego łańcucha,
nie potrafi rozpocząć syntezy
45
Startery
46
Prymaza
U Eukaryota:
kompleks pol α:
podjednostki
prymazy
i polimerazy DNA
Prymaza (polimeraza RNA zależna od DNA) syntetyzuje starter (RNA)
dla polimerazy DNA, która go wydłuża.
47
Aktywności polimeraz DNA
Synteza DNA
Egzonukleaza 3’-5’ –
korekcja błędów
Egzonukleaza 5’-3’ –
naprawa uszkodzeń,
usuwanie starterów
48
Problem nici nieciągłej
Na nici nieciągłej trzeba co
pewien odcinek ponawiać
syntezę startera – fragmenty
Okazaki
49
Maszyneria replikacyjna
50
Maszyneria replikacyjna
• Topoizomeraza - usuwa
naprężenia
• Helikaza (DnaB) - rozdziela nici
• SSB – stabilizuje jednoniciowy
DNA
• Prymaza – syntetyzuje startery
• Polimeraza (-y)
• Ligaza – skleja fragmenty
51
Widełki replikacyjne - topologia
52
PCNA
Proliferating Cell Nuclear Antigen
}  Kompleks białkowy w formie pierścienia
przesuwającego się po nici DNA w czasie replikacji
}  Koordynuje różne etapy replikacji i syntezy DNA
} 
53
Inne kompleksy białkowe
MCM – Mini Chromosome Maintenance – pierścień
przesuwający się razem z widełkami replikacyjnymi
}  GINS – (Go, Ichi, Ni, San; 5,1,2,3) – pierścień
współdziałający z MCM, przejście z fazy inicjacji do
elongacji i utrzymanie elongacji
} 
GINS
54
Polimerazy bakteryjne
PolIII (PolC)– główny enzym
replikacyjny, ma aktywność Exo
3’-5’ (korekta błędów), synteza do
1000 nt/s
PolIII nie ma aktywności Exo5’-3’
PolI (PolA) – ma dodatkowo aktywność
Exo 5’-3’, usuwa startery i dokańcza
syntezę, do 20 nt/s
Ligaza łączy zsyntetyzowane fragmenty
(nie jest polimerazą)
55
Polimerazy bakteryjne c.d.
PolII (PolB)– naprawa uszkodzonego DNA w fazie stacjonarnej
PolIV i polV – synteza DNA w fazie stacjonarnej (polIV) i przy
znacznych uszkodzeniach genomu (polV)
56
Mutacje w polimerazach E. coli
} 
} 
57
PolI i polII – mutacje nie są letalne, zwiększona
wrażliwość na czynniki mutagenne (np. UV)
PolIII (i niektóre polI) – mutacje letalne, badana przez
mutanty warunkowe (np. termowrażliwe)
Polimerazy Eukaryota
Pol α – prymaza, wydłuża startery
Pol β – naprawa DNA
Pol δ – główny enzym replikacyjny
Pol ε – replikacja, kontrola cyklu kom.,
naprawa DNA
Pol γ – replikacja DNA w mitochondriach
Polimerazy eukariotyczne nie mają
aktywności Exo 5’-3’, startery RNA usuwają
nukleazy FEN1, RnazaH i inne białka
58
Mutacje polimeraz eukariotycznych
} 
U drożdży (przykłady)
} 
} 
} 
} 
} 
} 
POL1 (pol α) – letalny, ts
POL2 (pol ε) – letalny, ts
CDC2 (pol δ) – letalny
POL4 (pol β) – zwiększona częstość rekombinacji i wrażliwość na
mutageny
MIP1 (pol γ) – utrata funkcji mitochondrialnej, utrata mtDNA
U człowieka
} 
POLG (pol γ) – mutacje powodują dziedziczoną autosomalnie chorobę
mitochondrialną PEO -postępująca zewnętrzna oftalmoplegia (porażenie
mięśni gałki ocznej) – związana z uszkodzeniami mtDNA
opadanie powiek (ptosis), niezdolność do
poruszania gałkami oczu, ogólne osłabienie
mięśni, zaburzenia neurologiczne,
59
Dwie klasy polimeraz
} 
O dużej wierności – mało błędów, ale wrażliwe na
uszkodzenia w matrycy
} 
} 
} 
zatrzymują się w miejscu uszkodzenia
standardowe enzymy replikacyjne
O niskiej wierności – więcej błędów, ale mniej
wrażliwe na uszkodzenia matrycy
} 
} 
60
są w stanie kontynuować syntezę mimo uszkodzeń matrycy
– TLS (trans-lesion synthesis)
mechanizm umożliwiający dokończenie replikacji
uszkodzonego DNA (zapobiega rearanżacjom genomu)
Rola PCNA
} 
Ubikwitynacja i deubikwitynacja PCNA przełącza między replikacją
TLS i wierną
61
http://www.acsu.buffalo.edu/~kowalsk/dnarepair/