Oglądaj/Otwórz

Autoreferat rozprawy doktorskiej mgr. Tomasza Włodarskiego
Application of computational biophysics and bioinformatics to multiscale biological problems
(Zastosowanie biofizyki obliczeniowej i bioinformatyki w wielkoskalowych problemach biologicznych)
Promotorzy:
prof. dr hab. Paweł Golik (Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski)
prof. dr hab. Marek Niezgódka (Interdyscyplinarne Centrum Modelowania Matematycznego i Komputerowego,
Uniwersytet Warszawski)
Recenzenci:
dr hab. Joanna Trylska (Centrum Nowych Technologii, Uniwersytet Warszawski)
dr hab. Krzysztof Pawłowski (Katedra Doświadczalnictwa i Bioinformatyki, Wydział Rolnictwa i Biologii,
Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego)
Praca wykonana w ramach Międzywydziałowych Interdyscyplinarnych Studiów Doktoranckich w zakresie nauk
Matematyczno-Przyrodniczych (MISDoMP).
Ostatnie dekady rozwoju nauki pokazują, jak kluczowe jest zastosowanie metod teoretycznych
i obliczeniowych w naukach biologicznych, pomimo związanych z nimi przybliżeń i uproszczeń. Szczególnie
jest to wyraźne w przypadku sekwencjonowania genomowego, które dostarcza nam ogromnych ilości danych,
doprowadzając do sytuacji, w której ich analiza, ze względu na swoją złożoność, staje się „wąskim gardłem”
wielu projektów naukowych. Innym przykładem jest biologia strukturalna, w której coraz większe zastosowanie
znajdują metody dynamiki molekularnej, pozwalające badać procesy wciąż niedostępne dla metod
eksperymentalnych.
W ramach mojej pracy doktorskiej wykorzystałem metody bioinformatyki oraz biofizyki obliczeniowej
do badania zagadnień dotyczących podstawowych aspektów funkcjonowania komórki. Pierwszym było
określenie oraz pełne scharakteryzowanie, zarówno pod względem strukturalnym jak i funkcjonalnym, zestawu
metylotransferaz kodowanych w genomie drożdża Saccharomyces cerevisiae. Drugim była weryfikacja
dotychczasowego modelu oddziaływania białko-białko, w kontekście wiązania niekowalencyjnego ubikwityny
do ligandów białkowych, a w konsekwencji zaproponowanie nowego modelu opisującego ten proces.
Metylotransferazy (MTazy) stanowią bardzo liczną, lecz wciąż nie w pełni scharakteryzowaną klasę
enzymów występujących we wszystkich organizmach. Są one odpowiedzialne za przeprowadzanie reakcji
przeniesienia grupy metylowej z jej donora, którym jest najczęściej S-adenozylo-L-metionina (znana jako
AdoMet lub SAM) na nukleofilowy akceptor, którym jest przeważnie atom azotu bądź tlenu w cząsteczce białka
lub kwasu nukleinowego. MTazy biorą udział w wielu kluczowych procesach, takich jak: regulacja ekspresji
genów, naprawa DNA czy biosynteza metabolitów. Ponadto metylacja jest drugą po fosforylacji najczęściej
występującą modyfikacją posttranslacyjną białek, pełniącą funkcję regulatorowe i sygnałowe. Pomimo
ogromnego znaczenia tej reakcji dla funkcjonowania komórki wciąż nie znamy pełnego zestawu
metylotransferaz kodowanych w genomie jednego, dowolnego organizmu. W swojej pracy dokonałem dogłębnej
charakterystyki tej klasy enzymów u eukariotycznego organizmu modelowego jakimi są drożdże Saccharomyces
cerevisiae.
Wykorzystując techniki modelowania homologicznego, ze szczególnym uwzględnieniem wyszukiwania
odległych homologów za pomocą metaprofili sekwencyjnych, wykazałem, iż metylotransferom (zbiór MTaz
kodowanych w genomie danego organizmu) u S. cerevisiae składa się z 86 MTaz. Pośród nich 53 zostały już
zweryfikowane eksperymentalnie, potwierdzono ich funkcję jak i określono specyficzność substratową. Kolejne
32 znamy tylko na podstawie poprzednich badań bioinformatycznych, w których wykazano ich homologię do
znanych metylotransferaz, wymagają one jednakże wciąż potwierdzenia eksperymentalnego i określenia
specyficzności. Ponadto opisałem jedną całkowicie nową metylotransferazę (Yil096cp). Wszystkie te białka, w
oparciu o zbudowane przeze mnie modele struktury przestrzennej, sklasyfikowałem strukturalnie na 9 klas,
odpowiadających innym zwojom, z najliczniej reprezentowanym zwojem Rossmanna.
Dodatkowo przeanalizowałem architekturę domenową dla wszystkich MTaz, znajdując kilka do tej pory nie
opisanych domen, w kontekście badanych białek, które mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia funkcji
tych metylotransferaz i ich powiązania z innymi procesami w komórce.
W oparciu o dane dotyczące ekspresji genów w cyklu metabolicznym (Yeast Metabolic Cycle, YMC)
wskazałem, że większość genów MTaz podlega cyklicznej ekspresji w YMC. Ponadto zaobserwowałem, że
MTazy o identycznej specyficzności charakteryzują się podobnym wzorem ekspresji. W oparciu o podobieństwo
wzoru ekspresji, punkt izoeletryczny, rodzaj zwoju oraz lokalizację białka w komórce opracowałem nową
metodę przewidywania specyficzności substratowej MTaz. Metoda ta wykorzystuje drzewa decyzyjne
wygenerowane w oparciu o powyższe własności 53 metylotransferaz o znanej specyficzności substratowej.
Stosując opracowaną przeze mnie metodę przewidziałem specyficzność dla 24 z 33 niescharakteryzowanych
MTaz, a moje przewidywania zostały potwierdzone dla 8 z 12 zweryfikowanych eksperymentalnie do tej pory
białek, w tym i dla Yil096cp. Ponadto zaproponowany przeze mnie algorytm, wykorzystujący drzewa decyzyjne
i dostępne dane o ekspresji, lokalizacji jak i fizyko-chemii białek, można zastosować w badaniu innych klas
enzymów.
Wynikiem tej części pracy była charakterystyka strukturalna i funkcjonalna zbioru metylotransferaz
kodowanych w genomie S. cerevisiae. Uzupełniona została nowatorską metodą przewidywania specyficzności
substratowej, przy pomocy której oszacowałem, iż metylacja u tego organizmu jest przeprowadzana przez 35
metylotransferaz RNA, 31 metylotransferaz białkowych, 9 MTaz małych cząsteczek oraz 3 MTazy lipidów; dla
pozostałych 8 białek wciąż nie znamy substratu.
W drugiej części mojego pracy doktorskiej zająłem się badaniem oddziaływania białko-białko w
kontekście niekowalencyjnego wiązania ubikwityny.
Istnieją dwa główne modele opisujące oddziaływania białko-białko.
Pierwszym z nich jest wymuszone dopasowanie („induced fit”, IF). W obrębie tego modelu, oddziaływanie
pomiędzy ligandem a białkiem wymusza ich wzajemne dopasowanie konformacyjne. W takim przypadku białko
w kompleksie przyjmuje konformację niedostępną dla niego w stanie niezwiązanym.
Drugim modelem jest selekcja konformacyjna („conformational selection”, CS). Model ten kładzie nacisk na
dynamikę białka, wskazując, iż w stanie niezwiązanym białko nie przyjmuje stale tylko jednej konformacji, ale
fluktuuje pomiędzy różnymi stanami z różnymi prawdopodobieństwami. W trakcie tych fluktuacji czasami może
znaleźć się w stanie, którego konformacja jest bardzo podobna do tej, którą to białko przyjmuje w kompleksie z
innym. Pod wpływem oddziaływania z ligandem zmianie ulega rozkład prawdopodobieństwa z jakim dostępne
są różne stany dla białka, gdyż stabilizuje ono konformację związanego białka, która to staje się tą dominującą.
W tym modelu, w przeciwieństwie do modelu IF, białko w kompleksie przyjmuje konformację, która jest
dostępna dla niego także w stanie niezwiązanym.
Model CS był ostatnio wykorzystany do wyjaśnienia oddziaływania białko-białko w przypadku ubikwityny i jej
białkowych ligandów. Ubikwityna pełni kluczową role w wielu procesach biologicznych, w szczególności jako
cząsteczka sygnałowa, która np. jest markerem kierującym białka do degradacji w proteasomie.
Celem mojej pracy była weryfikacja tego modelu w oparciu o dostępne struktury kompleksów ubikwityny
(zarówno krystaliczne jak i NMR-owskie), za pomocą analizy in silico lokalnych zmian w strukturze
ubikwityny. Przeprowadziłem tę analizę poprzez porównywanie struktury związanej i niezwiązanej ubikwityny,
sprawdzając zakres stosowalności modelu wymuszonego dopasowania i selekcji konformacyjnej w procesie
rozpoznawania ubikwityny. Gdyby struktura związanej i niezwiązanej ubikwityny była taka sama oznaczałoby
to, że wiązanie odbywa się poprzez model CS, w przeciwnym wypadku do opisu należałoby wykorzystać model
IF. Porównując fragmenty struktur (ubikwityny związanej i niezwiązanej) w funkcji odległości od miejsca
wiązania ligandu wykazałem, iż wokół tego miejsca w ubikwitynie, pod wpływem wiązania, dochodzi do
lokalnych zmian strukturalnych, które są bardziej znaczące niż globalne zmiany struktury ubikwityny. Analiza
statystyczna wykazała również, że rozkład tych lokalnych zmian jest zupełnie inny i nie może być wyjaśniony
tylko poprzez model dopasowania konformacyjnego. Oznacza to, że CS nie oddaje całego mechanizmu
oddziaływania białko-białko w przypadku ubikwityny i należy go jeszcze uzupełnić o model IF, w szczególności
wokół miejsca wiązania ligandu.
Wynikiem ostatniej części niniejszej rozprawy było zaproponowanie nowego modelu oddziaływania
białko-białko dla ubikwityny, który uzupełnia dotychczasowy model selekcji konformacyjnej o model
następującego po niej lokalnego wymuszonego dopasowania. Ponadto opracowana przeze mnie metodyka może
być wykorzystana w podobnych badaniach nad innymi białkami, co umożliwi pełniejsze zrozumienie ich
funkcji.