COBAS® TaqMan® HIV-1 Test, version 2.0

Transkrypt

For Use With The High Pure System
DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
High Pure System Viral Nucleic Acid Kit
HIVHP2
48 Tests
P/N: 05923468 190
48 Tests
P/N: 03502295 001
ZASTOSOWANIE
Test COBAS® TaqMan® HIV-1, wersja 2.0 (v2.0), do stosowania z High Pure System (HPS), jest
testem in vitro opartym na amplifikacji kwasu nukleinowego w celu ilościowej oceny stężenia RNA
ludzkiego wirusa upośledzenia odporności typu 1 (HIV-1) w ludzkim osoczu, z wykorzystaniem High
Pure System Viral Nucleic Acid Kit do ręcznego przygotowywania próbek oraz analizatora COBAS®
TaqMan® 48 do automatycznej amplifikacji i detekcji. Za pomocą testu można dokonywać oceny
ilościowej RNA wirusa HIV-1 w zakresie stężenia 34–10 000 000 kopii/ml (57 do 1,67 x 107 jednostek
międzynarodowych/ml). Jedna kopia RNA wirusa HIV-1 odpowiada 1,67 jednostki międzynarodowej
IU (International Unit) według międzynarodowego standardu nr 1 Światowej Organizacji Zdrowia
(WHO) dla RNA wirusa HIV-1 (kod NIBSC 97/656)1,2.
Test ten łącznie z objawami klinicznymi i innymi markerami laboratoryjnymi progresji choroby znajduje
zastosowanie w opiece klinicznej nad chorymi zakażonymi HIV-1. Test może służyć do oceny rokowania
pacjenta na podstawie pomiaru początkowego poziomu RNA wirusa HIV-1, a także do monitorowania
leczenia przeciwretrowirusowego przez pomiar zmian poziomu RNA wirusa HIV-1 w trakcie terapii
w osoczu pobranym na EDTA.
Test COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System nie jest przeznaczony
do przesiewowego badania na obecność wirusa HIV-1 we krwi lub produktach
krwiopochodnych ani do stosowania jako test diagnostyczny potwierdzający zakażenie
wirusem HIV-1.
PODSUMOWANIE ORAZ OPIS TESTU
Ludzki wirus upośledzenia odporności (HIV) jest czynnikiem etiologicznym zespołu nabytego
upośledzenia odporności (AIDS)3-5. Zakażenie HIV może szerzyć się drogą stosunków płciowych,
przez kontakt z zakażoną krwią lub produktami krwiopochodnymi oraz z zakażonej matki na jej płód6.
W ciągu od trzech do sześciu tygodni od narażenia na wirus HIV ogólnie u osób zakażonych
występuje krótki, ostry zespół, charakteryzujący się objawami grypopodobnymi, któremu towarzyszy
duża wiremia we krwi obwodowej.7-10 Później u większości zakażonych osób występuje swoista dla
HIV odpowiedź immunologiczna oraz zmniejszenie wiremii w osoczu; zazwyczaj ma to miejsce od
czterech do sześciu tygodni od wystąpienia objawów11,12. Po serokonwersji zakażone osoby
wchodzą zazwyczaj w fazę o stabilnym przebiegu klinicznym, bezobjawową, która może trwać wiele
lat.13-15 Okres bezobjawowy charakteryzuje się utrwaloną niewielką wiremią w osoczu16 oraz
stopniowym zanikaniem limfocytów T CD4+, co prowadzi do ciężkiego niedoboru odporności,
mnogich zakażeń oportunistycznych, nowotworów złośliwych i zgonu.17 Pomimo że poziomy wiremii
w fazie bezobjawowej zakażenia we krwi obwodowej są stosunkowo małe, replikacja wirusa i jego
usuwanie wydają się być procesem dynamicznym, w którym duża produkcja wirusa i zakażanie
komórek CD4+ jest równoważone przez odpowiednio nasilone usuwanie wirusa, śmierć zakażonych
komórek i uzupełnianie komórek CD4+. Powoduje to, że poziomy wiremii i komórek CD4+ w osoczu
są względnie stałe.18-20
Za pomocą pomiarów ilościowych wiremii HIV we krwi obwodowej wykazano, że większe poziomy
wirusa mogą się wiązać ze zwiększonym ryzykiem progresji klinicznej choroby wywoływanej przez
HIV. Ponadto wykazano, że zmniejszenie poziomów wirusa w osoczu może się wiązać ze
zmniejszonym ryzykiem progresji klinicznej.21-23 Poziom wirusa we krwi obwodowej można oznaczać
ilościowo za pomocą pomiaru antygenu p24 HIV w surowicy, ilościowej hodowli HIV z osocza lub
przez bezpośredni pomiar wirusowego RNA w osoczu przy użyciu technologii amplifikacji kwasu
nukleinowego albo amplifikacji sygnału.24-28
Część Informacje na temat wersji dokumentu znajduje się na końcu tego dokumentu.
05923573049-05PL
1
Doc Rev. 5.0
Antygen p24 jest podstawowym białkiem rdzenia HIV, stwierdzanym w surowicy zarówno w postaci
wolnej, jak i związanej z przeciwciałem anty-p24. Wolny antygen p24 można oznaczać za pomocą
komercyjnie dostępnych enzymatycznych testów immunologicznych (EIA, enzyme immunoassay),
jednak przydatność antygenu p24 jako markera liczby kopii wirusa we krwi jest ograniczona,
ponieważ jest on wykrywany jedynie u 20% chorych bezobjawowych i 40–50% chorych objawowych.
Metody mające na celu rozdzielenie kompleksów antygen-przeciwciało poprawiają czułość testów
wykrywających antygen p24, jednak cząsteczka wirusa pozostaje niewykrywalna u większości
24
chorych bezobjawowych.
Zakaźny wirus HIV w osoczu można hodować, inokulując nim pobudzone komórki jednojądrowe krwi
obwodowej (PBMC, peripheral blood mononuclear cells), pochodzące od zdrowych dawców.
Oznaczenie ilościowe uzyskuje się, inokulując PBMC za pomocą seryjnych rozcieńczeń próbki
osocza. Hodowla ilościowa ma ograniczoną użyteczność w monitorowaniu poziomów wirusa u osób
zakażonych, ponieważ jedynie niewielka frakcja cząstek wirusa jest zakaźna w warunkach in vitro.
Zakaźny wirus jest często niewykrywalny u chorych bezobjawowych.24
RNA wirusa HIV można oznaczać ilościowo w osoczu przy użyciu technik amplifikacji kwasów
29-31
nukleinowych, takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR, Polymerase Chain Reaction).
Test COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System wykorzystuje technologię
reakcji PCR do osiągnięcia maksymalnej czułości i dynamicznego zakresu ilościowego oznaczania
RNA wirusa HIV-1 w osoczu pobranym na EDTA jako antykoagulantem.
ZASADY PROCEDURY
®
®
Test COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System jest testem amplifikacji
kwasu nukleinowego, służącym do ilościowego oznaczania RNA ludzkiego wirusa upośledzenia
odporności typu 1 (HIV-1) w ludzkim osoczu. Test COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania
z High Pure System obejmuje trzy główne procesy: (1) przygotowanie próbki ręcznie w celu
wyizolowania RNA wirusa HIV-1, (2) odwrotną transkrypcję docelowego RNA w celu wygenerowania
komplementarnego DNA (cDNA)32 oraz (3) jednoczesną amplifikację PCR32 docelowego cDNA
i detekcję rozszczepionych podwójnie znakowanych fluorescencyjnie sond oligonukleotydowych
swoistych dla materiału docelowego.
®
®
Test COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System przeprowadza się na
próbkach przygotowanych manualnie z użyciem High Pure System, poddawanym następnie
automatycznej odwrotnej transkrypcji, amplifikacji PCR oraz detekcji docelowego RNA wirusa HIV-1
i Armored RNA wzorca HIV-1 Quantitation Standard (QS). Odczynnik Master Mix zawiera pary
primerów i sondy swoiste zarówno dla RNA wirusa HIV-1, jak i RNA wzorca HIV-1 QS. Odczynnik
Master Mix został przygotowany tak, aby zapewniać równoważne oznaczenie ilościowe różnych
izolatów HIV-1. Detekcji amplifikowanego DNA dokonuje się przy użyciu swoistych dla sekwencji
docelowych oraz swoistych dla wzorca QS podwójnie znakowanych sond oligonukleotydowych,
pozwalających na niezależną identyfikację amplikonu HIV-1 i amplikonu HIV-1 QS.
RNA wirusa HIV-1 oznacza się ilościowo za pomocą standardu ilościowego HIV-1 QS. Rekompensuje to
wpływ hamowania oraz kontroluje proces przygotowywania i amplifikacji, pozwalając uzyskać
dokładniejsze oznaczenie ilościowe RNA wirusa HIV-1 w każdej próbce. Wzorzec HIV-1 QS to
niezakaźny konstrukt Armored RNA, zawierający miejsca wiązania dla primerów HIV-1 z odczynnika
COBAS® TaqMan® HIV-1 Master Mix, v2.0, oraz charakterystyczne miejsce wiązania sondy, co
umożliwia odróżnienie amplikonu HIV-1 QS od amplikonu docelowego HIV-1.
Wzorzec HIV-1 QS jest dodawany do każdej próbki w znanej liczbie kopii i wraz z nią przechodzi
przez kolejne procesy przygotowania, odwrotnej transkrypcji oraz jednoczesnej amplifikacji PCR
i detekcji rozszczepionej podwójnie znakowanej sondy oligonukleotydowej. Analizator COBAS®
TaqMan® 48 oblicza stężenie RNA wirusa HIV-1 w badanych próbkach przez porównywanie sygnału
HIV-1 z sygnałem HIV-1 QS dla każdej próbki i kontroli.
Wybór sekwencji docelowej
Wybór docelowej sekwencji RNA wirusa HIV-1 jest uzależniony od identyfikacji regionów w obrębie
genomu HIV-1, wykazujących największy konserwatyzm wśród różnych izolatów wirusa HIV-1.
W związku z wysoką zmiennością genetyczną wirusa celem amplifikacji oraz detekcji za pomocą
testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System są dwa regiony genomu
HIV-1. Podwójnie znakowane sondy oligonukleotydowe swoiste dla dwóch sekwencji docelowych
oraz dla wzorca QS pozwalają na niezależną identyfikację amplikonu HIV-1 i amplikonu HIV-1 QS,
v2.0. Dlatego właściwy wybór primerów oraz podwójnie znakowanych sond oligonukleotydowych ma
05923573049-05PL
2
Doc Rev. 5.0
kluczowe znaczenie dla zdolności testu do amplifikacji i detekcji różnych izolatów wirusa HIV-1. Test
®
®
COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System podczas odwrotnej transkrypcji
i amplifikacji PCR wykorzystuje primery komplementarne do sekwencji w obrębie wysoce
33
konserwatywnego regionu genu gag wirusa HIV-1 i regionu LTR wirusa HIV-1.
Przygotowanie próbki
Test COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System jest przeznaczony do
stosowania z próbkami osocza z dodatkiem EDTA oraz izolatami RNA wirusa HIV-1, przygotowywanymi
ręcznie zgodnie z ogólną procedurą, opierającą się na wiązaniu kwasu nukleinowego do włókien
szklanych. W procedurze używana jest objętość 500 µl osocza. Cząstki wirusa HIV-1 zostają poddane
lizie przez ich inkubację w podwyższonej temperaturze z proteazą oraz chaotropowym buforem do
lizy/wiążącym, który powoduje uwolnienie kwasów nukleinowych i ochronę uwolnionego RNA wirusa
HIV-1 przed znajdującymi się w osoczu cząsteczkami RNazy. Do każdej próbki wraz z odczynnikiem
lizującym wprowadzana jest proteaza oraz znana liczba cząsteczek Armored RNA standardu
ilościowego HIV-1 QS. W dalszej kolejności do mieszaniny, w której dokonano lizy, dodaje się
izopropanol, po czym mieszaninę wiruje się i przepuszcza przez kolumnę z wkładem filtrującym,
zawierającym włókna szklane. W trakcie wirowania cząsteczki RNA wirusa HIV-1 i standardu ilościowego
HIV-1 ulegają związaniu na powierzchni włókien szklanych filtra. Substancje niezwiązane, takie jak sole,
białka i inne zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, zostają usunięte w wyniku wirowania.
Zaadsorbowany kwas nukleinowy jest wymywany i poddany elucji roztworem wodnym. Materiały
jednorazowego użytku umożliwiają równoległą obróbkę 12 próbek lub wielokrotności tej liczby.
Poddawane obróbce próbki, zawierające RNA wirusa HIV-1 oraz RNA standardu ilościowego HIV-1 QS,
są następnie dodawane do mieszaniny do amplifikacji/detekcji i przenoszone do analizatora COBAS®
TaqMan® 48. Docelowe sekwencje RNA wirusa HIV-1 i RNA standardu ilościowego HIV-1 QS są
następnie poddawane odwrotnej transkrypcji, amplifikacji i jednoczesnej detekcji przez dwie rozcięte
podwójnie znakowane sondy oligonukleotydowe swoiste dla HIV-1 i jedną swoistą dla wzorca QS.
Odwrotna transkrypcja oraz amplifikacja PCR
Odwrotna transkrypcja
Reakcje odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR przeprowadza się z użyciem termostabilnego,
rekombinowanego enzymu polimerazy DNA Z05 Thermus specie (Z05). W obecności manganu
(Mn2+) i w odpowiednich warunkach układu buforowego Z05 wykazuje aktywność zarówno odwrotnej
transkryptazy, jak i polimerazy DNA.32 Umożliwia to prowadzenie odwrotnej transkrypcji i amplifikacji
PCR równocześnie z detekcją amplikonu w czasie rzeczywistym.
Poddane obróbce próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach do amplifikacji
(K-tube) lub na tackach do amplifikacji (K-tray), gdzie zachodzi zarówno odwrotna transkrypcja, jak
i amplifikacja PCR. Mieszanina reakcyjna jest ogrzewana, aby umożliwić primerowi antysensownemu
hybrydyzację do docelowego RNA wirusa HIV-1 oraz do RNA standardu ilościowego HIV-1 QS.
W-obecności jonów Mn2+ i nadmiaru trójfosforanów dezoksyrybonukleotydów (dNTP), do których
należą trójfosforany dezoksyadenozyny, dezoksyguanozyny, dezoksycytydyny, dezoksyurydyny
i-dezoksytymidyny, polimeraza Z05 wydłuża primery zhybrydyzowane z nicią RNA, tworząc nici DNA
komplementarne do docelowego RNA.
Amplifikacja sekwencji docelowej
Po odwrotnej transkrypcji docelowego RNA wirusa HIV-1 oraz RNA standardu ilościowego HIV-1
mieszanina reakcyjna jest ogrzewana, aby doszło do denaturacji hybrydy RNA:cDNA i odsłonięcia
docelowych sekwencji dla primerów. Po ochłodzeniu mieszaniny i hybrydyzacji primerów
sensownych z nicią cDNA Z05 wydłuża primer, syntetyzując drugą nić DNA. W ten sposób kończy
się pierwszy cykl PCR. W jego wyniku powstała dwuniciowa kopia DNA regionów docelowych RNA
HIV-1 oraz RNA HIV-1 QS. Mieszanina reakcyjna jest po raz kolejny podgrzewana w celu
rozdzielenia powstałego dwuniciowego DNA i odsłonięcia sekwencji docelowych primerów. Podczas
schładzania mieszaniny primery hybrydyzują do DNA docelowego. Z05 w obecności jonów Mn2+
i nadmiaru trójfosforanów dezoksyrybonukleotydów wydłuża zhybrydyzowane primery wzdłuż
docelowych matryc, tworząc dwuniciową cząsteczkę DNA, zwaną amplikonem. Analizator COBAS®
TaqMan® 48 automatycznie powtarza powyższy proces przez określoną liczbę cykli, w każdym z nich
zmierzając do podwojenia ilości amplikonu DNA. Wymagana liczba cykli jest zaprogramowana
w analizatorze COBAS® TaqMan® 48. Amplifikacja zachodzi wyłącznie w regionach genomu HIV-1,
które znajdują się pomiędzy primerami; cały genom HIV-1 nie jest amplifikowany.
05923573049-05PL
3
Doc Rev. 5.0
Amplifikacja wybiórcza
Selektywną amplifikację badanego kwasu nukleinowego z próbki klinicznej w teście COBAS® TaqMan®
HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System uzyskuje się dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase
(uracylo-N-glikozylaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dUTP). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje
niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę34, lecz nie łańcuchów DNA zawierających
dezoksytymidynę. W DNA występującym w naturze nie ma dezoksyurydyny, natomiast jest ona zawsze
obecna w amplikonie wskutek zastosowania trójfosforanu dezoksyurydyny jako jednego spośród
trójfosforanów dezoksyrybonukleotydu (dNTP) w odczynniku Master Mix. Dlatego dezoksyurydynę
zawiera wyłącznie amplikon. Dezoksyurydyna warunkuje wrażliwość zanieczyszczającego amplikonu na
rozkład przez enzym AmpErase przed amplifikacją docelowego DNA. Enzym AmpErase niszczy także
wszystkie nieswoiste produkty reakcji powstałe po wstępnej aktywacji odczynnika Master Mix przez jony
manganu. Zawarty w odczynniku Master Mix enzym AmpErase katalizuje rozszczepienie DNA
zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie pierścienia
dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym łańcuch amplikonu
DNA pęka w miejscu, w którym znajduje się dezoksyurydyna, w ten sposób wykluczając dalszą
amplifikację DNA. Gdy enzym AmpErase zostanie poddany działaniu temperatur powyżej 55°C (czyli
w ciągu wszystkich cykli reakcji w termocyklerze), pozostaje nieaktywny przez dłuższy czas, a zatem nie
niszczy docelowego amplikonu, utworzonego w wyniku odwrotnej transkrypcji i amplifikacji.
Detekcja produktów reakcji PCR w teście COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High
Pure System
®
®
Test COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System wykorzystuje technologię PCR
w czasie rzeczywistym (real-time PCR)35,36. Zastosowanie sond podwójnie znakowanych barwnikiem
fluorescencyjnym zapewnia ciągłą detekcję gromadzenia się produktu reakcji PCR na podstawie
monitorowania intensywności emisji fluorescencyjnych barwników reporterowych, uwalnianych w trakcie
procesu amplifikacji. Sondy składają się z oligonukleotydów swoistych dla HIV-1 i standardu ilościowego
HIV-1 QS, znakowanych barwnikiem reporterowym i wygaszaczem. W teście COBAS® TaqMan® HIV-1,
v2.0, do stosowania z High Pure System sondy dla HIV-1 i wzorca HIV-1 QS są oznakowane różnymi
fluorescencyjnymi
barwnikami
reporterowymi.
Gdy
podwójnie
oznakowane
barwnikami
fluorescencyjnymi cząsteczki sond są nienaruszone, fluorescencja reportera jest przytłumiona bliskością
wygaszacza, na zasadzie efektu przenoszenia energii typu Förstera. Podczas reakcji PCR sonda ulega
hybrydyzacji z sekwencją docelową, a następnie rozszczepieniu pod wpływem posiadanej przez
termostabilną polimerazę DNA Z05 aktywności 5' do 3' nukleazy. Od chwili uwolnienia i rozdzielenia
reportera i wygaszacza nie zachodzi już zjawisko wygaszania, a fluorescencja barwnika reporterowego
nasila się. Amplifikację RNA HIV-1 oraz RNA HIV-1 QS mierzy się niezależnie od siebie, wykorzystując
różne długości fal. Proces ten powtarza się przez określoną liczbę cykli, a w każdym cyklu następuje
efektywne zwiększenie intensywności emisji poszczególnych barwników reporterowych, umożliwiające
niezależną identyfikację RNA wirusa HIV-1 oraz RNA wzorca HIV-1 QS. Cykl PCR, w którym krzywa
wzrostu rozpocznie wzrost wykładniczy, zależy od ilości materiału startowego na początku reakcji PCR.
Podstawy oznaczania ilościowego w teście COBAS
z High Pure System
®
TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania
Test COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System zapewnia dokładne wyniki
ilościowe w bardzo szerokim zakresie dynamiki, ponieważ monitorowanie amplikonu przeprowadza
się w fazie wykładniczej amplifikacji. Im wyższe jest miano HIV-1 w badanej próbce, tym wcześniej
fluorescencja barwnika reporterowego sondy HIV-1 wzrasta powyżej wyjściowego poziomu
fluorescencji (rysunek 1). Ponieważ ilość RNA standardu ilościowego HIV-1 QS jest stała we
wszystkich próbkach, fluorescencja barwnika reporterowego sondy HIV-1 QS powinna pojawiać się
w każdej próbce w tym samym cyklu (rysunek 2). W próbkach, w których fluorescencja standardu QS
jest nieprawidłowa, stężenie jest poddawane odpowiedniej modyfikacji. Pojawienie się swoistego
sygnału fluorescencyjnego jest rejestrowane jako krytyczna wartość progowa (Ct). Wartość Ct
definiuje się jako liczbę cykli cząstkowych, po której fluorescencja barwnika reporterowego
przekracza ustaloną wcześniej wartość progową fluorescencji (ustalony poziom fluorescencji)
i zapoczątkowuje fazę wykładniczego wzrostu sygnału (rysunek 3). Większa wartość Ct wskazuje na
niższe miano początkowe docelowego RNA wirusa HIV-1. Dwukrotny wzrost miana koreluje ze
zmniejszeniem wartości Ct docelowego RNA wirusa HIV-1 o 1, natomiast 10-krotny wzrost miana
koreluje ze zmniejszeniem Ct o 3,3.
05923573049-05PL
4
Doc Rev. 5.0
Rysunek 1 przedstawia krzywe wzrostu materiału docelowego dla serii rozcieńczeń próbek wirusa,
obejmującej przedział 5-log10. W miarę wzrostu stężenia wirusów krzywe wzrostu przesuwają się
w kierunku wcześniejszych cykli. Zatem krzywa wzrostu leżąca najdalej na lewo odzwierciedla
najwyższy poziom miana wirusa, a krzywa wzrostu leżąca najdalej na prawo oznacza najniższy
poziom miana wirusa.
Normalizowana fluorescencja
Rysunek 1
Krzywe wzrostu materiału docelowego dla serii rozcieńczeń wirusa,
obejmującej przedział 5-log10
10
Miano najwyższe
5
Miano najniższe
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Liczba cykli
Rysunek 2 przedstawia krzywe wzrostu standardu ilościowego QS dla próbek z serią rozcieńczeń
wirusa, obejmującą przedział 5-krotnej wartości log10. Ilość dodanego do każdej próbki preparatu
Quantitation Standard jest stała dla każdej reakcji. Wartość Ct dla preparatu Quantitation Standard
jest podobna, niezależnie od miana wirusa.
Rysunek 2
Krzywe wzrostu wzorca QS w serii rozcieńczeń wirusa obejmującej przedział 5-log10
50
40
Miano najniższe
30
20
10
0
Miano najwyższe
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Liczba cykli
05923573049-05PL
5
Doc Rev. 5.0
Rysunek 3 pokazuje na przykładzie, w jaki sposób wartości fluorescencji w każdym cyklu są
normalizowane dla każdej krzywej wzrostu. Liczbę cykli cząstkowych (Ct) oblicza się w chwili, gdy
sygnał fluorescencyjny przekracza ustalony poziom fluorescencji.
Rysunek 3
Wartości fluorescencji w każdym cyklu są normalizowane dla każdej krzywej wzrostu
1.0
1,0
0.8
0,8
0.6
0,6
Ustalony poziom
fluorescencji
0.4
0,4
Wartość Ct = 28,2
0.2
0,2
0.0
0,0
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
Liczba cykli
Oznaczanie ilościowe RNA wirusa HIV-1
®
®
Test COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System ilościowo oznacza RNA wirusa
HIV-1, wykorzystując drugą sekwencję docelową (HIV-1 QS), którą w znanym stężeniu dodaje się do
każdej próbki badanej. Preparat HIV-1 QS jest niezakaźnym konstruktem Armored RNA, zawierającym
fragmenty sekwencji gag wirusa HIV-1 z obszarami wiązania primerów, które są identyczne z obszarami
wiązania na docelowej sekwencji HIV-1. Wzorzec HIV-1 QS wytwarza również produkt amplifikacji o tej
samej długości łańcucha i składzie zasad co docelowa sekwencja gag RNA wirusa HIV-1. Obszar
wiązania sondy detekcyjnej w obrębie HIV-1 QS został zmodyfikowany, aby umożliwić odróżnienie
amplikonu HIV-1 QS od amplikonu docelowego gag HIV-1.
Podczas fazy hybrydyzacji primerów w reakcji PCR w analizatorze COBAS® TaqMan® 48 próbki
zostają oświetlone i wzbudzone światłem przefiltrowanym, a następnie rejestruje się wyniki emisji
przefiltrowanej fluorescencji każdej próbki. Odczyty dotyczące poszczególnych próbek poddaje się
korekcji w celu wyeliminowania zmienności wywołanej działaniem instrumentów. Aparat wprowadza
odczyty fluorescencji do programu AMPLILINK i zapisuje w bazie danych. Stosuje się metodę
odczytów wstępnych dla określenia, czy RNA HIV-1 oraz RNA HIV-1 QS reprezentują zestawy, które
można uznać za ważne. W sytuacji gdy dane nie mieszczą się w ustalonych granicach, aparat
generuje oflagowania. Po zakończeniu i pomyślnej ocenie odczytów wstępnych odczyty fluorescencji
są następnie przetwarzane w celu obliczenia wartości Ct dla RNA HIV-1 i dla RNA HIV-1 QS. Karta
®
®
swoistych dla danej serii stałych kalibracji, dołączona do testu COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, do
stosowania z High Pure System służy do obliczania wartości miana próbek i kontroli na podstawie
wartości Ct RNA wirusa HIV-1 oraz RNA wzorca HIV-1 QS. Test COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do
stosowania z High Pure System jest zgodny z międzynarodowym standardem Światowej Organizacji
Zdrowia (WHO) dla RNA wirusa HIV-11,2,37. Wyniki oznaczenia miana podaje się jako liczbę kopii/ml
(cp/mL) lub jednostek międzynarodowych/ml (IU/mL). Współczynnik konwersji wyniku miana RNA
wirusa HIV-1, podanego w kp/ml oraz w jednostkach międzynarodowych HIV-1/ml, firma Roche
Molecular Systems, Inc. określa jako 0,6 kopii/IU (1,67 IU/kopię).
05923573049-05PL
6
Doc Rev. 5.0
ODCZYNNIKI
Zestaw wirusowych kwasów nukleinowych o wysokiej czystości
(P/N: 03502295 001)
48 testów
LYS
(Bufor do lizy/wiążący)
Tris
50% (udział wagowy) chlorowodorku guanidyny
<1% mocznik
19% (udział wagowy) Tritonu X-100
2 x 25 ml
CAR
(RNA, liofilizowany)
2 x 2 mg
2 x 100 mg
PK
(Proteinaza K, liofilizowana)
≥ 64% (udział wagowy) proteinazy K, liofilizowanej
IRB
(Bufor usuwający inhibitor)
Tris
65% (udział wagowy) chlorowodorku guanidyny
(dodać 20 ml etanolu)
1 x 33 ml
WASH
(Bufor płuczący)
Tris
NaCI
(dodać 80 ml etanolu)
1 x 20 ml
ELB
(Bufor do elucji)
1 x 30 ml
RS
(Zestaw statywów High Pure System Viral Nucleic Acid Rack)
Statyw do przeprowadzania lizy
Statyw z rurkami filtracyjnymi z mocowanym statywem na odpady
Statyw do elucji
Statyw z pokrywkami
4 x każdy
WR
(Statyw na odpady High Pure System Viral Nucleic Acid)
8 x każdy
(P/N: 05923468 190)
HIVHP2
48 testów
Odczynniki do przygotowywania próbki i odczynniki kontrolne
HIV-1 QS, v2.0
(Standard ilościowy HIV-1, v2.0)
Bufor Tris-HCl
EDTA
< 0,001% konstruktu Armored RNA, zawierającego sekwencje
genomu HIV-1 wiążące primery oraz swoisty obszar wiążący sondę
(niezakaźny RNA obecny w bakteriofagu MS2)
Barwnik amarantowy
< 0,005% poly rA RNA (syntetycznego)
0,05% azydku sodu
05923573049-05PL
7
2 x 1,0 ml
Doc Rev. 5.0
HIV-1 H(+)C, v2.0
[Kontrola HIV-1 wysoko (+), v2.0]
< 0,001% konstruktu Armored RNA zawierającego sekwencje
genomu HIV-1 (niezakaźny RNA obecny w bakteriofagu MS2)
Ujemne osocze ludzkie, niereaktywne w testach na obecność
przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2,
antygenu HIV p24 oraz antygenu HBsAg; RNA HIV-1, RNA HCV
i DNA HBV niewykrywalne przy użyciu metod PCR
®
0,1% substancji konserwującej ProClin 300
2 x 1,0 ml
HIV-1 L(+)C, v2.0
[Kontrola HIV-1 nisko (+) v2.0]
< 0,001% konstruktu Armored RNA zawierającego sekwencje
genomu HIV-1 (niezakaźny RNA obecny w bakteriofagu MS2)
Ujemne osocze ludzkie, niereaktywne w testach na obecność przeciwciał
przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24
oraz antygenu HBsAg; RNA HIV-1, RNA HCV i DNA HBV niewykrywalne
przy użyciu metod PCR
0,1% substancji konserwującej ProClin® 300
2 x 1,0 ml
CTM (–) C
[Kontrola ujemna COBAS® TaqMan® (osocze ludzkie)]
Ujemne osocze ludzkie, niereaktywne w testach na obecność przeciwciał
przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24
oraz antygenu HBsAg; RNA HIV-1, RNA HCV i DNA HBV niewykrywalne
przy użyciu metod PCR
®
0,1% substancji konserwującej ProClin 300
4 x 1,0 ml
Odczynniki do amplifikacji i detekcji
HIV-1 MMX, v2.0
(Odczynnik COBAS® TaqMan® HIV-1 Master Mix, v2.0)
Bufor Tricine
Wodorotlenek potasu
Octan potasu
< 20% dimetylosulfotlenku
Glicerol
< 0,001% dATP, dCTP, dGTP, dUTP, dTTP
< 0,001% preparatu primerów HIV-1
< 0,05% polimerazy DNA Z05 (bakteryjnej)
< 0,1% enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozylazy) (bakteryjnej)
< 0,001% preparatu znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi
sond oligonukleotydowych, swoistych dla HIV-1 oraz wzorca
HIV-1 Quantitation Standard
0,09% azydku sodu
2 x 24 testy
2 x 1,4 ml
CTM Mn2+
(Roztwór manganu COBAS® TaqMan®)
< 1,2% octanu manganu
Kwas octowy lodowaty
0,09% azydku sodu
2 x 24 testy
2 x 1,0 ml
05923573049-05PL
8
Doc Rev. 5.0
OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
A.
DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
B.
Test ten jest przeznaczony do stosowania wyłącznie z osoczem ludzkim pobranym na
antykoagulant EDTA.
C.
Nie należy pipetować za pomocą ust.
D.
Nie jeść, nie pić ani nie palić w obszarach roboczych laboratorium. Posługując się próbkami
i odczynnikami z zestawów, należy stosować jednorazowe rękawice, fartuchy laboratoryjne
oraz odpowiednią ochronę oczu. Dokładnie umyć ręce po pracy z próbkami i odczynnikami.
E.
Przy pobieraniu poszczególnych dawek odczynników z butelek unikać skażenia
bakteryjnego odczynników i ich zanieczyszczenia rybonukleazą.
F.
Zaleca się używanie jałowych jednorazowych pipet oraz końcówek pipet wolnych od
RNazy.
G.
Nie łączyć odczynników z różnych serii ani z różnych butelek z tej samej serii.
H.
Nie mieszać odczynników pochodzących z różnych zestawów.
I.
Wyrzucić wszystkie niezużyte odczynniki, odpady i próbki, postępując zgodnie z przepisami
krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi.
J.
Nie używać zestawu po upływie daty ważności.
K.
Karty charakterystyki (ang. Safety Data Sheet, SDS) są dostępne na żądanie w miejscowym
przedstawicielstwie firmy Roche.
L.
Z próbkami oraz kontrolami należy obchodzić się jak z materiałem zakaźnym, stosując
bezpieczne procedury laboratoryjne, przedstawione w dokumencie Biosafety in Microbiological
and Biomedical Laboratories38 oraz w CLSI Document M29-A339. Dokładnie oczyścić i odkazić
wszystkie powierzchnie robocze świeżo przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu
w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.
Uwaga:
Dostępny w handlu płynny domowy wybielacz zazwyczaj zawiera podchloryn
sodu w stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku
1:10 pozwoli uzyskać roztwór 0,5% podchlorynu sodu.
M.
UWAGA: Odczynniki CTM (–) C, HIV-1 L(+)C, v2.0, oraz HIV-1 H(+)C, v2.0, zawierają ludzkie
osocze otrzymane z krwi ludzkiej. Materiał źródłowy został przebadany i uznany za niereaktywny
pod względem obecności antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg),
przeciwciał przeciwko HIV-1/2 oraz HCV, a także antygenu HIV p24. Badanie ujemnego osocza
ludzkiego przy zastosowaniu metod PCR nie wykazało wykrywalnej obecności RNA wirusa HIV-1,
RNA wirusa HCV ani DNA wirusa HBV. Nie ma znanych metod testowych mogących zapewnić
całkowitą pewność, że produkty pochodzące z krwi ludzkiej nie przenoszą czynników zakaźnych.
Dlatego każdy materiał pochodzenia ludzkiego należy traktować jako potencjalnie zakaźny.
Z odczynnikami CTM (–) C, HIV-1 L(+)C, v2.0, oraz HIV-1 H(+)C, v2.0, należy obchodzić się tak
jak z materiałem zakaźnym, stosując bezpieczne procedury laboratoryjne, takie jak przedstawione
38
w wytycznych Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories oraz w dokumencie
CLSI M29-A339. Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie powierzchnie robocze świeżo
przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.
N.
Odczynniki HIV-1 MMX, v2.0, HIV-1 QS, v2.0, oraz CTM Mn2+ zawierają azydek sodu.
Azydek sodu może reagować z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub
miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu
do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać je dużą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu
azydków.
O.
Podczas pracy z jakimkolwiek odczynnikiem należy używać osłon na oczy oraz fartuchów
laboratoryjnych i rękawic jednorazowych. Należy unikać kontaktu wymienionych materiałów ze
skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, trzeba natychmiast spłukać
dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń.
W razie rozlania wspomnianych odczynników należy przed wytarciem plam rozcieńczyć je
wodą.
05923573049-05PL
9
Doc Rev. 5.0
WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA
Odczynniki do przygotowywania próbki
A.
Po dostarczeniu przechowywać odczynniki z zestawu High Pure System Viral Nucleic Acid
w temperaturze 15–25°C.
B.
Przechowywać bufor do elucji (ELB) oraz bufor do lizy/wiążący (LYS) w temperaturze
15–25°C. Po otwarciu przechowywać odczynniki ELB oraz LYS w temperaturze 15–25°C.
Otwarte odczynniki ELB oraz LYS należy zużyć w ciągu 30 dni lub przed upływem daty
ważności, zależnie od tego, która z dat jest wcześniejsza.
C.
Po dodaniu buforu do elucji (ELB) w celu rozpuszczenia nośnika RNA i proteinazy K
przechowywać niezużyty nośnik RNA (CAR) oraz niezużytą proteinazę K (PK) w temperaturze od
-15 do -25°C. Po rozpuszczeniu nośnik RNA oraz proteinazę K należy zużyć w ciągu 30 dni lub
przed upływem daty ważności, zależnie od tego, która z dat wypada wcześniej.
D.
Po dodaniu etanolu przechowywać bufor usuwający inhibitor (IRB) oraz bufor płuczący
(WASH) w temperaturze 15–25°C. Wymienione roztwory robocze zachowują stabilność przez
30 dni lub do daty ważności, w zależności od tego, który termin wypada wcześniej.
E.
Roboczy roztwór do lizy/wiążący [bufor do lizy/wiążący w połączeniu z nośnikiem RNA,
proteinazą K oraz HIV-1 QS, v2.0] należy zużyć natychmiast po jego przygotowaniu. Wszelkie
jego pozostałości należy wyrzucić.
A.
Nie zamrażać odczynników ani kontroli.
B.
Odczynniki HIV-1 MMX, v2.0, CTM (–) C, HIV-1 L(+)C, v2.0, HIV-1 H(+)C, v2.0, HIV-1 QS v2.0,
oraz CTM Mn2+ przechowywać w temperaturze 2–8°C. Przed otwarciem odczynniki te zachowują
stabilność do wskazanej daty przydatności. Po otwarciu opakowania w celu pobrania porcji
odczynnika wystarczającej na 12 próbek przechowywać pozostałą ilość odczynników: HIV-1 MMX,
v2.0, HIV-1 L(+)C, v2.0, HIV-1 H(+)C, v2.0, HIV-1 QS, v2.0, oraz CTM Mn2+ w temperaturze
2–8°C. Po otwarciu odczynniki: HIV-1 MMX, v2.0, HIV-1 L(+)C, v2.0, HIV-1 H(+)C, v2.0,
HIV-1 QS, v2.0, oraz CTM Mn2+ zachowują stabilność w temperaturze 2–8°C przez 30 dni lub do
upływu daty przydatności, zależnie od tego, która z dat jest wcześniejsza.
C.
Po otwarciu opakowania wszelkie niezużyte partie odczynnika CTM (–) C należy wyrzucić.
D.
Roboczy odczynnik Master Mix (przygotowany przez dodanie odczynnika CTM Mn2+ do
HIV-1 MMX, v2.0) należy przechowywać w temperaturze 2–8°C w zaciemnionym miejscu.
Przygotowane próbki i kontrole należy dodać do roboczego odczynnika Master Mix w ciągu
2 godzin od jego przygotowania.
E.
Przetwarzane próbki i kontrole zachowują stabilność do 2 godzin w temperaturze 4–30°C.
F.
Amplifikację należy rozpocząć w ciągu 1 godziny od chwili dodania przygotowanych próbek
badanych i kontrolnych do roboczego odczynnika Master Mix.
05923573049-05PL
10
Doc Rev. 5.0
DOSTARCZONE MATERIAŁY
Odczynniki do przygotowywania próbki
A.
Zestaw wirusowych kwasów nukleinowych o wysokiej czystości
(P/N: 03502295 001)
LYS
(Bufor do lizy/wiążący)
CAR
(Nośnik RNA)
PK
(Proteinaza K)
IRB
(Bufor usuwający inhibitor)
WASH
(Bufor płuczący)
ELB
(Bufor do elucji)
RS
(Zestaw statywów High Pure System Viral Nucleic Acid Rack)
WR
(Statyw na odpady High Pure System Viral Nucleic Acid)
B.
®
®
COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0
(P/N: 05923468 190)
HIVHP2
HIV-1 QS, v2.0
(HIV-1 Quantitation Standard)
HIV-1 H(+)C, v2.0
[Kontrola HIV-1 wysoko (+)]
HIV-1 L(+)C, v2.0
[Kontrola HIV-1 nisko (+)]
CTM (–) C
[Kontrola ujemna COBAS® TaqMan® (osocze ludzkie)]
HIV-1 MMX, v2.0
®
®
(Odczynnik COBAS TaqMan HIV-1 Master Mix, v2.0)
CTM Mn2+
(Roztwór manganu COBAS® TaqMan®)
MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE
Przyrządy i oprogramowanie
•
Analizator COBAS® TaqMan® 48
•
Program AMPLILINK w wersji serii 3.3
•
Stacja robocza z drukarką do programu AMPLILINK
•
Instrukcja obsługi analizatora COBAS® TaqMan® 48 do użytku z podręcznikiem
programu AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3
•
Instrukcja obsługi programu AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z aparatem
COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS®
TaqMan® 48, analizatorem COBAS® AMPLICOR® oraz aparatem cobas p 630
•
Plik definicji testu (Test Definition File, TDF). Nazwa i numer wersji TDF znajdują się na
karcie informacyjnej produktu dołączonej do opakowania zestawu.
05923573049-05PL
11
Doc Rev. 5.0
•
Statyw na nośniki K (P/N: 03287696001)
•
Transporter nośników K (P/N: 03517519001)
•
Narzędzie korkujące do tac K (P/N: 03339904001)
•
Nośnik na tackę K (P/N: 03341488001)
•
Urządzenie do mocowania korka w probówkach K, z silnikiem (P/N: 03516539001)
•
Nośnik K (P/N: 28150397001)
Materiały jednorazowe
•
Opakowanie zawierające tacki K, 24 sztuki (P/N: 03343146001)
•
Opakowanie zawierające probówki K 12 x 96 (P/N: 03137082001)
Wymagania dotyczące wirówki
•
Wirówka Sigma 4-15C Benchtop lub odpowiadający jej typ wirówki z płytką
mikrotitracyjną, umożliwiający wirowanie z przyspieszeniem 4600 x g
•
Rotor horyzontalny do wirówki Sigma P/N: 11118 (zawiera 2 koszyki P/N: 13218 oraz
2 uchwyty do płytek P/N: 17978) lub odpowiednik
INNE MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE
•
Izopropanol (> 99%) – odpowiadający specyfikacjom ACS lub lepszy
•
Etanol (96–100%) – odpowiadający specyfikacjom ACS lub lepszy
•
Pipetory zmiennopojemnościowe*: (pojemność 250 µl i 1000 µl) z barierą aerozolową
lub końcówkami dodatniego wypierania, wolnymi od RNazy
•
Rękojeść pomocnicza do pipety: Drummond (P/N: 4-000-100) lub odpowiednik
•
Łaźnia wodna o temperaturze 50°C (± 2°C)
•
Suchy blok grzejny o temperaturze 70°C (± 2°C)
•
Jałowe jednorazowe pipety serologiczne: 5, 10 i 25 ml
•
Jałowe probówki stożkowe z polipropylenu; 15 ml i 50 ml: Corning (P/N: 430052
i P/N: 430290) lub odpowiednik
•
Jałowe probówki do mikrowirówki o pojemności 2,0 ml: Sarstedt (P/N: 72.693.005)
lub odpowiednik
•
Mieszadło wibracyjne
•
Statywy do probówek
•
Rękawice jednorazowe bezpudrowe
•
Kalibrowane termometry do łaźni wodnej i suchego bloku grzejnego
* Dokładność pipetorów musi pozostawać w granicach 3% podanej objętości. Tam gdzie wymagane,
należy używać pozbawionych RNazy końcówek z filtrem lub barierą dodatniego wypierania w celu
zapobieżenia skażeniu krzyżowemu między próbką i amplikonem.
05923573049-05PL
12
Doc Rev. 5.0
POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK
Uwaga:
Ze wszystkimi próbkami i próbami kontrolnymi należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym.
Uwaga:
Test ten został zatwierdzony wyłącznie do badania ludzkiego osocza pobranego na
EDTA jako antykoagulant. Badanie innych rodzajów próbek może dawać
nieprawidłowe wyniki.
A.
Pobieranie próbek
®
®
Test COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System jest przeznaczony
wyłącznie do stosowania z próbkami osocza pobranego na EDTA. Krew należy pobierać do jałowych
probówek do pobierania krwi, zawierających EDTA jako antykoagulant, a następnie mieszać zgodnie
z zaleceniami producenta probówek. Można stosować probówki z EDTA z lawendowym korkiem lub
probówki do otrzymywania nierozcieńczonego osocza BD Vacutainer® PPT™ (BD PPT™) z perliście
białym korkiem. Probówki BD PPT™ zawierają suszony rozpylonyo K2EDTA i żelowy materiał
separujący. Rysunek 4 pokazuje porównanie miana wirusowego RNA wirusa HIV-1 39 próbek HIV-1
dodatnich pobranych do probówek z lawendowym korkiem i probówek BD PPT™. Próbki z probówek
BD PPT™ zostały zebrane, odwirowane, zdekantowane, a osocze zamrożono w ciągu 6 godzin od
pobrania.
Rysunek 4
Porównanie miana wirusowego RNA wirusa HIV-1 próbek pobranych
do probówek z lawendowym korkiem i probówek do otrzymywania nierozcieńczonego
®
osocza BD Vacutainer PPT™
®
osocza BD Vacutainer PPT™
Log10 ilości RNA wirusa HIV-1 [kopie/ml]
Probówka do otrzymywania nierozcieńczonego
6
5
4
3
Regresja SPC
Y = 1,006 * X - 0,04
R2 = 0,9871
2
N = 39
1
1
2
3
4
5
6
Probówka z korkiem lawendowym
05923573049-05PL
13
Doc Rev. 5.0
Probówki z EDTA z lawendowym korkiem
Po wymieszaniu, zgodnie z instrukcją producenta probówki, przechowywać pobraną krew
w probówkach z EDTA z lawendowym korkiem w temperaturze 2–25°C przez najwyżej 24 godziny.
Oddzielić osocze od krwinek w ciągu 24 godzin od pobrania, odwirowując (800–1600 x g przez
20 minut) w temperaturze pokojowej. Osocze należy przenieść do jałowych probówek
polipropylenowych. Rysunek 5 pokazuje wpływ warunków przechowywania pełnej krwi na miano
®
®
RNA wirusa HIV w teście COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System. Pełną
krew pobrano do probówek z lawendowym korkiem od zdrowych dawców i dodano HIV-1 do
osiągnięcia miana RNA wirusa HIV-1 około 330 kopii/ml. Przygotowano równe objętości
i przechowywano w różnych warunkach, uzyskano osocze i przeprowadzono test COBAS® TaqMan®
HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System.
Rysunek 5
Stabilność wirusa HIV-1 we krwi pełnej zebranej do probówek z lawendowym korkiem,
zawierających antykoagulant EDTA, przed oddzieleniem osocza
3,0
2,5
2,0
< 10 minut
1,5
24 godziny,
2–8°C
24 godziny,
25°C
1,0
0,5
0,0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Średnio
Dawca
Probówki do otrzymywania nierozcieńczonego osocza BD Vacutainer® PPT™
Po wymieszaniu, zgodnie z instrukcją producenta probówki, przechowywać pobraną krew
w ustawionych pionowo probówkach BD PPT™ w temperaturze 2–25°C przez najwyżej 24 godziny.
Wstrząsanie probówek BD PPT™ lub postępowanie z nimi w inny sposób, niż opisano, może
zakłócać oznaczenie zawartości wirusa HIV-1. Oddzielić osocze od krwinek w ciągu 24 godzin od
pobrania, odwirowując w wirówce z rotorem horyzontalnym (1100 x g przez 20 minut)
w temperaturze pokojowej. Osocze należy przenieść do jałowych probówek polipropylenowych.
Rysunek 6 pokazuje wpływ warunków przechowywania pełnej krwi na miano RNA wirusa HIV-1
w teście COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System. Krew pełna dawców
zakażonych HIV-1 została zebrana do probówki z lawendowym korkiem i pięciu probówek BD PPT™.
Po wymieszaniu probówki przechowywano w warunkach wskazanych na rysunku 6. Następnie
oddzielono osocze i zamrożono je do przeprowadzenia testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do
stosowania z High Pure System.
05923573049-05PL
14
Doc Rev. 5.0
Rysunek 6
Stabilność wirusa HIV-1 we krwi pełnej zebranej do probówek do otrzymywania
nierozcieńczonego osocza BD Vacutainer® PPT™ przed oddzieleniem osocza
Z lawendowym korkiem < 10 minut
PPT 2 godziny, 2–8°C
PPT 24 godziny, 2–8°C
PPT < 10 minut
PPT 2 godziny, 25°C
PPT 24 godziny, 25°C
6
5
4
3
2
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Dawca
B.
Transport próbek
Krew pełna lub osocze muszą być transportowane zgodnie z przepisami krajowymi i lokalnymi
dotyczącymi transportu czynników etiologicznych.40 Krew pełną należy transportować
w temperaturze 2–25°C i poddawać obróbce w ciągu 24 godzin od pobrania. Osocze należy
transportować w temperaturze 2–8°C lub zamrożone w temperaturze od -20°C do -80°C.
C.
Przechowywanie próbek
Próbki osocza można przechowywać w temperaturze pokojowej do 1 doby, w temperaturze 2–8°C do
6 dni albo zamrożone w temperaturze od -20°C do -80°C. Zaleca się przechowywanie próbek
w postaci odmierzonych, równych objętości 800–900 µl w jałowych, zakręcanych probówkach
polipropylenowych o pojemności 2,0 ml (takich jak Sarstedt P/N: 72.694.006). Rysunek 7 pokazuje
wyniki badania stabilności z zastosowaniem testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania
z High Pure System i osocza od zdrowych dawców, do którego dodano wirus HIV-1 do osiągnięcia
miana RNA wirusa HIV-1 około 124 kopii/ml.
Rysunek 7
Stabilność HIV-1 w osoczu z dodatkiem EDTA
3,0
2,5
< 1 godzina
2,0
24 godziny, 30°C
6 dni, 2–8°C
1,5
6 tygodni, -20°C
6 tygodni, -80°C
1,0
0,5
0,0
11
12
13
14
15
16
19
18
19
20
Średnio
Dawca
Próbki surowicy i osocza można zamrażać i rozmrażać do 5 razy bez znaczącej utraty RNA HIV-1.
Rysunek 8 pokazuje wyniki badania stabilności podczas zamrażania i rozmrażania z zastosowaniem
testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System i osocza od zdrowych
dawców, do którego dodano wirus HIV-1 do osiągnięcia miana RNA wirusa HIV-1 około 124 kopii/ml.
05923573049-05PL
15
Doc Rev. 5.0
Rysunek 8
Stabilność HIV-1 podczas zamrażania i rozmrażania w osoczu z dodatkiem EDTA
3,0
2,5
2,0
0 Z/R
1 Z/R
1,5
3 Z/R
5 Z/R
1,0
0,5
0,0
11
12
13
14
15
16
19
18
19
20
Średnio
Dawca
INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA
Uwaga:
Szczegółowe instrukcje obsługi, wyniki wydruków i dane na temat interpretowania
sygnałów, komentarzy i komunikatów o błędach można znaleźć w podręczniku
urządzenia analizator COBAS® TaqMan® 48 do użytku z instrukcją obsługi programu
AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3 i w instrukcji obsługi programu AMPLILINK
w wersji serii 3.3 do użytku z aparatem COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS®
TaqMan®, analizatorem COBAS® TaqMan® 48, analizatorem COBAS® AMPLICOR®
oraz aparatem cobas p 630.
Uwaga:
Przed użyciem wszystkie odczynniki do amplifikacji i detekcji należy ogrzać do
temperatury otoczenia. Należy wyjąć je z miejsca przechowywania o temperaturze
2–8°C co najmniej 30 minut przed użyciem.
Uwaga:
Próbki osocza i kontrole należy przed użyciem ogrzewać do temperatury otoczenia
przez 15–30 minut.
Uwaga:
Tam gdzie jest to wskazane, należy używać pipetorów z końcówkami z barierą
aerozolową lub dodatnim wypieraniem. Zachować najdalej posuniętą ostrożność,
aby uniknąć zanieczyszczenia.
Liczba testów w przebiegu
Każdy zestaw zawiera odczynniki wystarczające do czterech przebiegów po 12 oznaczeń, które
można wykonywać oddzielnie lub równocześnie. W każdym z przebiegów testowych, liczących do
24 próbek i kontroli, należy włączyć 1 powtórzenie kontroli: CTM (–) C, HIV-1 L(+)C, v2.0, oraz
HIV-1 H(+)C, v2.0 (patrz rozdział „Kontrola jakości”). Odczynniki do amplifikacji i detekcji są
pakowane do butelek dwukrotnego użytku, wystarczających do wykonania 24 testów. Aby jak
najwydajniej wykorzystać odczynniki, próbki badane i kontrolne należy poddawać obróbce w seriach
będących wielokrotnością 12.
Przygotowanie próbki i próby kontrolnej
Uwaga:
Jeśli używa się zamrożonych próbek osocza, należy umieścić próbki
w temperaturze pokojowej aż do ich całkowitego rozmrożenia, a następnie przed
użyciem wytrząsać na mieszadle wibracyjnym przez 5–10 sekund.
Uwaga:
Przed przystąpieniem do wykonywania testu pozwolić odczynnikom na ogrzanie się
do temperatury otoczenia. Przed rozpoczęciem izolacji materiału ogrzać blok
grzewczy do temperatury 70°C (± 2°C) oraz łaźnię wodną do temperatury 50°C
(± 2°C).
05923573049-05PL
16
Doc Rev. 5.0
A. Przygotowanie odczynników
Uwaga:
Przygotować roboczy roztwór do lizy/wiążący dopiero wtedy, gdy w ciągu
15–30 minut wszystkie próbki i kontrole ogrzeją się do temperatury otoczenia.
1.
Przygotować bufor usuwający inhibitor, pipetując 20 ml 96–100% etanolu do odczynnika
Inhibitor Removal Buffer (bufor usuwający inhibitor) (IRB). Dokładnie wymieszać zawartość,
odwracając 5–10 razy. Przygotowany w ten sposób bufor usuwający inhibitor stanowi zapas
wystarczający na 48 testów.
2.
Przygotować bufor płuczący, dodając 80 ml 96–100% etanolu do odczynnika bufor płuczący
(WASH). Dokładnie wymieszać zawartość, odwracając 5–10 razy. Przygotowany w ten
sposób bufor płuczący wystarcza na 48 testów.
3.
Ogrzać bufor do elucji (ELB) do temperatury 70°C (± 2°C) w zakręcanej probówce
o pojemności 2,0 ml. Można w tym celu używać wielu probówek. Objętość elucji na jedną
próbkę wynosi 75 µl. Należy ogrzać objętość odczynnika podaną w poniższej tabeli, zgodnie
z liczbą testów.
Liczba powtórzeń testu
4.
Odczynnik
12
24
Bufor do elucji (ml)
2,0
4,0
Przenieść za pomocą pipety do czystej, jałowej probówki objętość izopropanolu określoną
w poniższej tabeli, w zależności od liczby testów.
Odczynnik
12
24
Izopropanol (ml)
5,0
10,0
5.
Dodać 500 µl buforu do elucji (ELB) do nośnika RNA (CAR). Zatkać korkiem, odwrócić fiolkę
i wytrząsać ją na mieszadle wibracyjnym do chwili pełnego rozpuszczenia się nośnika RNA.
Rozpuszczony nośnik RNA wystarczy do wykonania 24 testów. Niezużyte partie
rozpuszczonego nośnika RNA można przechowywać w temperaturze od -15 do -25°C do
30 dni lub do zakończenia okresu przydatności, zależnie od tego, która z dat jest wcześniejsza.
6.
Dodać 5,0 ml buforu do elucji (ELB) do proteinazy K (PK). Zatkać korkiem, odwrócić fiolkę
i wytrząsać ją na mieszadle wibracyjnym do chwili pełnego rozpuszczenia się proteinazy K.
Rozpuszczona proteinaza K wystarczy do wykonania 24 testów. Niezużyte partie
rozpuszczonej proteinazy K można przechowywać w temperaturze od -15 do -25°C do 30 dni
lub do zakończenia okresu przydatności, zależnie od tego, która z dat jest wcześniejsza.
7.
Przygotować roboczy roztwór do lizy/wiążący w następujący sposób: przenieść za pomocą
pipety objętości odczynników przedstawionych w poniższej tabeli, zgodne z liczbą próbek
i kontroli przeznaczonych do obróbki.
Uwaga:
Odczynniki
12
24
Bufor do lizy/wiążący (ml)
7,0
14,0
Nośnik RNA (µl)
140
280
HIV-1 QS, v2.0 (µl)
84
168
Proteinaza K (ml)
1,4
2,8
Objętość standardu HIV-1 QS, v2.0, jest swoista dla testu COBAS® TaqMan® HIV-1,
v2.0, do stosowania z High Pure System.
05923573049-05PL
17
Doc Rev. 5.0
Uwaga:
Jeśli zamierza się użyć zamrożonego uprzednio, rozpuszczonego nośnika RNA lub
proteinazy K, należy je rozmrażać w temperaturze pokojowej, a przed użyciem
kilkakrotnie wymieszać przez odwracanie fiolki.
•
Dodać wskazaną objętość buforu do lizy/wiążącego do czystej, jałowej probówki
o pojemności 50 ml.
•
Do probówki zawierającej bufor
rozpuszczonego nośnika RNA.
•
Wytrząsać probówkę ze standardem ilościowym HIV-1 QS, v2.0, na mieszadle
wibracyjnym przez 3–5 sekund, po czym dodać wskazaną objętość HIV-1 QS, v2.0, do
probówki zawierającej bufor do lizy/wiążący oraz rozpuszczony nośnik RNA.
•
Zamknąć probówkę i wymieszać zawartość, odwracając 10–15 razy. NIE wytrząsać na
mieszadle wibracyjnym – wytrząsanie spowoduje tworzenie się pęcherzyków w roztworze.
•
Dodać wskazaną objętość rozpuszczonej proteinazy K do probówki zawierającej bufor do
lizy/wiążący.
•
Zamknąć probówkę i wymieszać zawartość, odwracając 10–15 razy. NIE wytrząsać na
mieszadle wibracyjnym – wytrząsanie spowoduje tworzenie się pęcherzyków w roztworze.
Rozpocząć rozpipetowanie roboczego roztworu do lizy/wiążącego natychmiast po dodaniu
proteinazy K do buforu do lizy/wiążącego i wymieszaniu zawartości.
•
Niezużyte partie buforu do lizy/wiążącego (LYS) można przechowywać w temperaturze
15–25°C do 30 dni lub do zakończenia okresu przydatności, zależnie od tego, która z dat
jest wcześniejsza. Niezużyte partie roboczego roztworu do lizy/wiążącego należy wyrzucić.
B.
do
lizy/wiążący
dodać
wskazaną
objętość
Przygotowanie próbki i próby kontrolnej
Uwaga:
Do wykonywania tej procedury zalecane jest stosowanie regulowanych pipetorów
z końcówkami z barierą aerozolową.
Uwaga:
Do wykonania czynności z etapów 1, 14, 16, 19 i 22 można używać pipetora powtarzalnego
z jałowymi końcówkami typu „combi-tip” odpowiedniego rozmiaru. Jednak należy
zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć rozpryskiwania się odczynników
i zanieczyszczenia krzyżowego próbek.
Uwaga:
W trakcie całej procedury unikać rozlewania roztworu roboczego do lizy/wiążącego,
próbki, kontroli i izopropanolu na uszczelnienie znajdujące się między dołkiem
a pokrywką na krawędzi każdego dołka.
Uwaga:
Stosować dobrze dopasowane do dłoni użytkownika rękawice. Rękawice należy
często zmieniać, szczególnie po pracy z kontrolami dodatnimi i otwieraniu pełnych
probówek statywu do przeprowadzania lizy Lysis Rack. Nigdy nie należy dotykać
wewnętrznej strony pokrywek (np. podczas otwierania lub zamykania).
Uwaga:
Podczas pracy z kontrolami zestawu i próbkami klinicznymi należy przed
przystąpieniem do ładowania kontroli dodatnich załadować kontrole ujemne.
1.
Dodać pipetą 625 µl roboczego roztworu do lizy/wiążącego do każdego z dołków statywu do
przeprowadzania lizy (I, przezroczysty). Unikać powstawania kropelek na uszczelnieniu
znajdującym się między dołkiem a pokrywką na krawędzi każdego dołka. Delikatnie wcisnąć
pokrywki na miejsce, nakrywając dołki. Nie zamykać zatrzasku.
2.
Otwierając dołki pojedynczo, ostrożnie dodawać pipetą do odpowiedniego dołka po 500 µl
próbki bądź kontroli. Unikać powstawania kropelek na uszczelnieniu znajdującym się między
dołkiem a pokrywką na krawędzi każdego dołka. Po dodaniu każdej próbki bądź kontroli
wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu. Następnie
delikatnie naciskając środek pokrywki, zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć dołek.
3.
Po dodaniu wszystkich próbek i kontroli wymieszać zawartość napełnionego statywu do
przeprowadzania lizy, wytrząsając go na mieszadle wibracyjnym przez około 10 sekund.
Unikać energicznego wytrząsania. Wzrokowo upewnić się, że wytrząsanie przebiega we
wszystkich dołkach, a ich zawartość jest dokładnie mieszana.
05923573049-05PL
18
Doc Rev. 5.0
4.
Ostrożnie umieścić statyw Lysis Rack w podgrzanej do temperatury 50°C (± 2°C) łaźni wodnej,
unikając rozchlapywania. Inkubować statyw Lysis Rack przez 10 minut. Podczas inkubacji
statyw Lysis Rack powinien być zanurzony w wodzie, ale nie może w niej pływać. Należy się
upewnić, że podczas inkubacji górna powierzchnia statywu Lysis Rack pomiędzy dołkami
pozostanie sucha. Po wyjęciu z łaźni wodnej ostrożnie wytrzeć do sucha wierzch i spód
statywu Lysis Rack.
5.
W wirówce z rotorem na płytki mikrotitracyjne odwirować statyw Lysis Rack przez
10–20 sekund z przyspieszeniem 4600 x g. Wirówka może nie osiągnąć w tym czasie
nastawionej prędkości obrotów. Potwierdzić wzrokowo, że nie doszło do wycieku, sprawdzając
poziom cieczy we wszystkich dołkach. W razie stwierdzenia wycieku przerwać procedurę.
6.
Otwierać każdy dołek pojedynczo, delikatnie naciskając zawias zatrzaskowy, aby zwolnić
mechanizm zatrzasku i unieść wieczko dołka. Za pomocą pipety dodawać do każdego dołka
po 350 µl izopropanolu. Po dodaniu każdej próbki bądź kontroli wcisnąć pokrywkę delikatnym
ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu. Następnie delikatnie naciskając środek pokrywki,
zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć dołek.
Uwaga:
®
®
Objętość izopropanolu jest swoista dla każdego testu COBAS TaqMan .
7.
Potwierdzić wzrokowo, że wszystkie dołki są szczelnie zamknięte. Wymieszać próbki,
trzykrotnie odwracając statyw, a następnie wytrząsać go na mieszadle wibracyjnym przez
około 10 sekund. Unikać energicznego wytrząsania. Wzrokowo upewnić się, że wytrząsanie
przebiega we wszystkich dołkach, a ich zawartość jest dokładnie mieszana.
8.
W wirówce z rotorem na płytki mikrotitracyjne odwirować statyw Lysis Rack przez
10–20 sekund z przyspieszeniem 4600 x g. Wirówka może nie osiągnąć w tym czasie
nastawionej prędkości obrotów. Potwierdzić wzrokowo, że nie doszło do wycieku, sprawdzając
poziom cieczy we wszystkich dołkach. W razie stwierdzenia wycieku przerwać procedurę.
9.
mechanizm zatrzasku i unieść wieczko dołka. Przenieść 750 µl próbki lub mieszaniny
kontrolnej do odpowiednich dołków statywu z rurkami filtracyjnymi Filter Tube Rack (II, żółty)
z przymocowanym statywem na odpady Waste Rack (biały). Po dodaniu każdej próbki bądź
mieszaniny kontrolnej wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony
zawiasu. Następnie delikatnie naciskając środek pokrywki, zamknąć zatrzask, aby szczelnie
zamknąć dołek.
10.
Po dodaniu wszystkich próbek lub kontroli wirować zestaw zawierający statyw z rurkami
filtracyjnymi przez 2 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z rotorem na płytki
mikrotitracyjne. Potwierdzić wzrokowo, że nie doszło do wycieku, sprawdzając poziom cieczy
we wszystkich dołkach. W razie stwierdzenia wycieku przerwać procedurę.
11.
mechanizm zatrzasku i unieść wieczko dołka. Przenieść pozostałość próbki lub mieszaniny
kontrolnej do odpowiednich dołków statywu z rurkami filtracyjnymi Filter Tube Rack. Po
dodaniu każdej próbki bądź mieszaniny kontrolnej wcisnąć pokrywkę delikatnym ruchem w dół,
zaczynając od strony zawiasu. Następnie delikatnie naciskając środek pokrywki, zamknąć
zatrzask, aby szczelnie zamknąć każdy dołek. Utylizować statyw do wykonywania lizy we
właściwy sposób.
12.
Wirować zestaw zawierający statyw z rurkami filtracyjnymi przez 2 minuty z przyspieszeniem
4600 x g w wirówce z rotorem na płytki mikrotitracyjne. Potwierdzić wzrokowo, że nie doszło
do wycieku, sprawdzając poziom cieczy we wszystkich dołkach. W razie stwierdzenia wycieku
przerwać procedurę.
13.
Wyjąć statyw z rurkami filtracyjnymi ze statywu na odpady, przyciskając obie spinki na górnej
części statywu z rurkami filtracyjnymi. Wyrzucić statyw na odpady. Zastąpić zużyty statyw na
odpady nowym i przypiąć statyw z rurkami filtracyjnymi do statywu na odpady.
14.
Otworzyć wszystkie pokrywki statywu z rurkami filtracyjnymi i dodać pipetą 400 µl buforu
usuwającego inhibitor (IRB), wlewając płyn po ściance każdego dołka. Nie dotykać ścianek
dołka. Po dodaniu buforu usuwającego inhibitor do każdego dołka wcisnąć pokrywkę danego
dołka delikatnym ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu. Następnie delikatnie
naciskając środek pokrywki, zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć pokrywki.
05923573049-05PL
19
Doc Rev. 5.0
15.
16.
płuczącego Wash Buffer (WASH), wlewając płyn po ściance każdego dołka. Nie dotykać
ścianek dołka. Po dodaniu buforu płuczącego do każdego dołka wcisnąć pokrywkę danego
17.
18.
części statywu z rurkami filtracyjnymi. Wyrzucić statyw na odpady. Zastąpić zużyty statyw na
odpady nowym i przypiąć statyw z rurkami filtracyjnymi do statywu na odpady.
19.
płuczącego Wash Buffer (WASH), wlewając płyn po ściance każdego dołka. Nie dotykać
ścianek dołka. Po dodaniu buforu płuczącego do każdego dołka wcisnąć pokrywkę danego
20.
21.
części statywu z rurkami filtracyjnymi. Nałożyć statyw z rurkami filtracyjnymi na statyw do
elucji (IIIA, niebieski) i przypiąć statyw z rurkami filtracyjnymi do statywu do elucji. Utylizować
statyw na odpady w odpowiedni sposób.
22.
Otworzyć wszystkie pokrywki statywu z rurkami filtracyjnymi i dodać pipetą 75 µl ogrzanego
buforu do elucji (ELB) na środek każdego filtra, nie dotykając samego filtra.
Uwaga:
Nie dodawać buforu do elucji przez wlewanie go po ściance dołka.
Po dodaniu buforu do elucji do każdego dołka wcisnąć pokrywkę danego dołka delikatnym
ruchem w dół, zaczynając od strony zawiasu. Następnie delikatnie naciskając środek pokrywki,
zamknąć zatrzask, aby szczelnie zamknąć pokrywki.
23.
Inkubować statyw Elution Rack w temperaturze pokojowej co najmniej przez 3 minuty od
dodania buforu do elucji do ostatniego dołka.
24.
25.
Wyjąć statyw z rurkami filtracyjnymi ze statywu do elucji, przyciskając obie spinki na górnej
powierzchni statywu z rurkami filtracyjnymi. Utylizować statyw z rurkami filtracyjnymi we
właściwy sposób.
26.
Nałożyć statyw z pokrywkami (IIIB, niebieski) na statyw do elucji (IIIA, niebieski). Docisnąć
mocno i zapiąć spinki na statywie do elucji. Wciskać każdą pokrywkę delikatnym ruchem w dół,
zaczynając od strony zawiasu. Następnie delikatnie naciskając środek pokrywki, zamknąć
zatrzask, aby szczelnie zamknąć wszystkie pokrywki.
27.
Poddawane obróbce próbki i kontrole są stosowane bezpośrednio w reakcji PCR. Do
amplifikacji należy użyć po 50 µl poddawanych obróbce próbek i kontroli. Dodać obrabiane
próbki i kontrole do roboczego odczynnika Master Mix w ciągu 2 godzin od ukończenia
przygotowania próbek i kontroli. Obrabiane próbki i kontrole należy poddać amplifikacji
w ciągu 1 godziny od dodania próbek i kontroli do roboczego odczynnika Master Mix i w ciągu
3 godzin od zakończenia przygotowywania próbki.
05923573049-05PL
20
Doc Rev. 5.0
Uwaga:
Obrabiane próbki zawierające HIV-1 można przechowywać w temperaturze 4–30°C
do 2 godzin przed dodaniem ich do roboczego odczynnika Master Mix; można je
dodać do roboczego odczynnika Master Mix do 1 godziny przed amplifikacją.
Odwrotna transkrypcja, amplifikacja i detekcja
Uwaga:
C.
Nośniki na probówki K oraz statyw na nośnik należy przetrzeć tkaniną
nieuwalniającą włókien, zwilżoną 70-procentowym roztworem izopropanolu.
Przygotowanie odczynnika
Uwaga:
Uwaga:
Uwaga:
Uwaga:
Uwaga:
Uwaga:
®
®
Odczynnik COBAS TaqMan HIV-1 Master Mix, v2.0 (HIV-1 MMX, v2.0), roboczy
mastermix (Working MMX) oraz roboczy mastermix z dodaną próbką lub kontrolą są
wrażliwe na światło. Chronić wymienione odczynniki przed światłem.
Odczynniki COBAS® TaqMan® HIV-1 Master Mix, v2.0 (HIV-1 MMX, v2.0), oraz roztwór
manganu COBAS® TaqMan® (CTM Mn2+) należy ogrzać do temperatury pokojowej co
najmniej na 30 minut przed przygotowaniem roboczego odczynnika Master Mix.
Przygotować roboczy odczynnik MMX po zakończeniu przygotowywania próbek
i kontroli.
Obrabiane próbki zachowują stabilność do 2 godzin przed dodaniem ich do
roboczego odczynnika MMX.
Roboczy odczynnik MMX należy zużyć w ciągu 2 godzin od jego przygotowania.
Po dodaniu obrabianych próbek i kontroli do roboczego odczynnika MMX
amplifikacja powinna rozpocząć się w ciągu 1 godziny.
1.
Ogrzewać jedną fiolkę odczynnika HIV-1 MMX, v2.0, oraz jedną fiolkę odczynnika CTM Mn2+
do temperatury otoczenia przez co najmniej 30 minut.
2.
Umieścić nośnik probówek K lub na tace K w statywie na nośnik K.
3.
Włożyć nowe probówki K lub nowe tace K do nośnika K lub nośnika na tace K, nie dotykając
bocznych ścianek probówek.
Uwaga:
Jeśli do przebiegu testowego mają być włączone mniej niż 24 probówki, należy
wypełnić probówkami następujące pozycje nośnika: 1, 2, 5, 20, 23 i 24, tak aby
obciążenie nośnika na probówki K po umieszczeniu w termocyklerze było
równomierne. Nie ma potrzeby równoważenia termocyklera podczas stosowania
tac K.
4.
Jeśli jest taka potrzeba, zdjąć korki z probówek K za pomocą urządzenia do mocowania
korków.
5.
Przygotować roboczy odczynnik MMX w następujący sposób:
W celu wykonania 24 testów dodać 170 µl odczynnika CTM
z odczynnikiem HIV-1 MMX, v2.0. Zamknąć fiolkę i dokładnie
odwracając 10 razy. Nie wytrząsać roboczego odczynnika MMX na
Chronić roboczy odczynnik Master Mix przed światłem i zużyć
przygotowania.
Mn2+ do jednej fiolki
wymieszać zawartość,
mieszadle wibracyjnym.
w ciągu 2 godzin od
W celu wykonania 12 testów pobrać 660 µl odczynnika HIV-1 MMX, v2.0, i przenieść do
2-mililitrowej probówki. Dodać 80 µl odczynnika CTM Mn2+ do 2-mililitrowej probówki zawierającej
HIV-1 MMX, v2.0, zamknąć probówkę korkiem i dokładnie wymieszać zawartość, odwracając
probówkę 10 razy. Chronić roboczy odczynnik MMX przed światłem i zużyć w ciągu 2 godzin.
Przechowywać niezużyte partie odczynników: HIV-1 MMX, v2.0, i CTM Mn2+ w oryginalnych
fiolkach w temperaturze 2–8°C. Po otwarciu odczynniki HIV-1 MMX, v2.0, i CTM Mn2+ zachowują
stabilność w temperaturze 2–8°C przez 30 dni lub do zakończenia okresu przydatności, zależnie
od tego, która z dat jest wcześniejsza.
Uwaga: Objętość odczynnika CTM Mn2+ jest swoista dla testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0,
do stosowania z High Pure System.
6.
Przenieść pipetą 50 µl roboczego odczynnika MMX do każdej probówki K lub do studzienki
tacki K.
05923573049-05PL
21
Doc Rev. 5.0
7.
Dodać po 50 µl każdej poddanej obróbce próbki i kontroli do odpowiednich probówek K lub
studzienek tacki K, zawierających roboczy odczynnik MMX, wykorzystując do tego celu
mikropipetor z końcówką z barierą aerozolową lub dodatnim wypieraniem. Ostrożnie
wymieszać każdą próbkę i próbę kontrolną, trzy razy nabierając do mikropipetora
i wypuszczając ponownie, nie doprowadzając przy tym do tworzenia się pęcherzyków.
8.
Powtórzyć czynności z etapu 7 w odniesieniu do każdej przygotowanej próbki i kontroli aż do
przeniesienia każdej z nich do probówki K. Do każdej próbki badanej i kontrolnej użyj nowej
końcówki. Sprawdzić wzrokowo probówki pod kątem obecności pęcherzyków, a w razie
konieczności usunąć je. Za pomocą urządzenia do mocowania korków lub urządzenia
korkującego do tac K nałożyć korki na probówki K lub tace K. Sprawdzić wzrokowo, czy
dodano odpowiednie objętości próbek.
9.
Amplifikację należy rozpocząć w ciągu 1 godziny od czasu dodania przygotowanych próbek
badanych i kontrolnych do probówek K lub tacek K zawierających roboczy odczynnik MMX.
D.
Ładowanie i obsługa analizatora COBAS® TaqMan® 48
1.
Włączyć komputer stacji roboczej i zalogować się do systemu Windows XP, używając
odpowiedniej nazwy użytkownika i hasła.
2.
Włączyć analizator COBAS® TaqMan® 48. Upewnić się, że urządzenie uruchamia się i jest
gotowe do użytku. Jeśli nośniki K lub tace K z poprzednich przebiegów testowych znajdują się
nadal w którymkolwiek z termocyklerów, należy je wyjąć za pomocą transportera do nośników K.
3.
Uruchomić na komputerze program AMPLILINK. Zalogować się, używając odpowiedniej
nazwy użytkownika i hasła.
4.
Aby wprowadzić numerację próbek przeznaczonych do analizy w zasobniku na probówki K lub
tace K, należy kliknąć ikonę Orders. Wybrać zakładkę Sample, następnie kliknąć przycisk
New i za pomocą klawiatury lub czytnika kodów kreskowych wprowadzić numer porządkowy
każdej próbki. Wybrać odpowiedni plik definicji testu powiązany z testem COBAS® TaqMan®
HIV-1, v2.0 do stosowania z High Pure System w celu uzyskania wyników w kopiach/ml
(cp/mL) lub w jednostkach międzynarodowych/ml (IU/mL). Nazwy i numery wersji plików
definicji testu znajdują się na karcie informacyjnej produktu dołączonej do opakowania
zestawu. Powtórzyć opisaną procedurę w odniesieniu do każdej próbki. Kliknąć przycisk Save.
5.
Wprowadzić dane dotyczące kontroli jakości, wybierając zakładkę Quality Control w oknie
Orders. Kliknąć przycisk New i za pomocą klawiatury lub czytnika kodów kreskowych
wprowadzić dane zamieszczone na dostarczonej wraz z zestawem karcie wartości
®
®
kontrolnych testu COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System.
W odpowiednich oknach wprowadzić: numer serii testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do
stosowania z High Pure System datę przydatności do użycia, zakresy wartości kontroli Low (+)
i High (+) oraz swoiste dla każdej serii współczynniki kalibracji. Kliknąć przycisk „OK”.
6.
Przypisać numer zasobnika na probówki K lub tacy K do przebiegu testu, klikając zakładkę
K-Carrier w oknie Orders. W oknie K-Carrier kliknąć przycisk New. W okienku znajdującym się
na prawo od napisu „K-Carrier ID” wprowadzić numer zasobnika na probówki K lub tacy K
z klawiatury lub skanując kod kreskowy zasobnika na probówki K lub tacy K za pomocą czytnika
kodów kreskowych. Z panelu dotyczącego testu w dolnej części okna wybrać odpowiedni plik
definicji testu powiązany z testem COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0 do stosowania z High Pure
System w celu uzyskania wyników w kopiach/ml lub w jednostkach międzynarodowych/ml
(IU/mL). Nazwy i numery wersji plików definicji testu znajdują się na karcie informacyjnej
produktu dołączonej do opakowania zestawu.
Uwaga:
7.
Jeśli stosuje się nośnik K użyty w poprzednim przebiegu testowym, należy
zaakceptować wyniki, zanim będzie można ponownie przypisać ten sam numer
nośnika K w nowym przebiegu testowym.
Na liście roboczej Worklist wybrać pierwszy wiersz w kolumnie Type (T). Zaznaczyć to pole
w celu uzyskania dostępu do menu rozwijanego i wybrać wymagany typ kontroli. Następnie
dwukrotnie kliknąć pole z numerem identyfikacyjnym próbki w tym samym wierszu. Wyświetli
się okno LookUp Control ze wszystkimi dostępnymi próbami kontrolnymi. Po wybraniu
kontroli w dolnej części po prawej stronie panelu Information wyświetlą się odpowiednie
wartości kalibracji i kontrolne. Powtórzyć opisaną procedurę w odniesieniu do wszystkich
wymaganych kontroli.
05923573049-05PL
22
Doc Rev. 5.0
8.
W celu wprowadzenia próbek na listę roboczą Worklist dwukrotnie kliknąć pierwszą pozycję
(wiersz) okna informacyjnego danej próbki. Spowoduje to wyświetlenie okna Lookup Sample,
zawierającego numery przypisane danej próbce. W celu zaznaczenia więcej niż jednego
numeru porządkowego użyć klawiszy Shift + strzałka. Sprawdzić, czy wszystkim zleceniom
®
®
przypisano odpowiedni plik definicji testu powiązany z testem COBAS TaqMan HIV-1, v2.0
do stosowania z High Pure System w celu uzyskania wyników w kopiach/ml (cp/mL) lub
w jednostkach międzynarodowych/ml (IU/mL). Nazwy i numery wersji plików definicji testu
znajdują się na karcie informacyjnej produktu dołączonej do opakowania zestawu.
9.
Kliknąć przycisk Save, aby zapisać zlecenie dla danego zasobnika probówek K.
Uwaga:
Jeśli do przebiegu testowego mają być włączone mniej niż 24 probówki, należy
wypełnić probówkami następujące pozycje nośnika: 1, 2, 5, 20, 23 i 24, tak aby
obciążenie nośnika na probówki K po umieszczeniu w termocyklerze było
równomierne. Nie ma potrzeby równoważenia termocyklera podczas stosowania
tac K.
E.
Odwrotna transkrypcja, amplifikacja i detekcja
1.
Wybrać ikonę Systems w zakładce System; kliknąć przycisk Open, aby otworzyć termocykler.
Gdy w oknie Systems pokrywa termocyklera jest całkowicie otwarta i widoczny jest napis
„Ready to Load”, należy podnieść i przytrzymać pokrywę termocyklera w celu załadowania
zasobnika na probówki K. Za pomocą przenośnika nośników umieścić w termocyklerze
załadowany nośnik na probówki K lub tacki K zawierający zamknięte probówki K lub tackę K
z roboczym odczynnikiem Master Mix, próbkami i kontrolami. Zamknąć pokrywę termocyklera.
2.
Kliknąć przycisk Start w oknie Systems poniżej ikony TC w celu zamknięcia pokrywy
termocyklera i uruchomienia aparatu.
3.
Analizator COBAS® TaqMan® 48 automatycznie wykonuje odwrotną transkrypcję, amplifikację
i detekcję.
WYNIKI
Obliczanie wyników
Analizator COBAS® TaqMan® 48 automatycznie określa miano RNA wirusa HIV-1 w każdej próbce
i kontroli. Miano RNA HIV-1 jest wyrażane w kopiach/ml lub w jednostkach międzynarodowych/ml,
w zależności od zastosowanego pliku definicji testu. Współczynnik konwersji pomiędzy stężeniem
RNA wirusa HIV-1, wyrażanym w kopiach/ml, a stężeniem w jednostkach międzynarodowych IU
(International Unit)/ml wynosi 0,6 kopii/IU wg międzynarodowego standardu nr 1 Światowej
Organizacji Zdrowia (WHO) dla RNA wirusa HIV-1 dla technik opartych na detekcji kwasów
nukleinowych (NAT) (NIBSC 97/656)1,2. Wspomniany współczynnik konwersji został określony
z użyciem testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, testu COBAS® AmpliPrep/COBAS®
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, oraz testu COBAS® TaqMan® HIV-1 do stosowania z High Pure
System.
Oprogramowanie AMPLILINK
•
Określa wartość progową liczby cykli (Ct) dla RNA wirusa HIV-1 oraz RNA standardu
HIV-1 Quantitation Standard.
•
Określa miano RNA HIV-1 na podstawie wartości Ct dla RNA HIV-1 i RNA HIV-1
Quantitation Standard oraz swoistych dla danej serii współczynników kalibracji.
•
Określa, czy obliczone i wyrażone w kopiach/ml wartości dla kontroli HIV-1 L(+)C, v2.0,
i HIV-1 H(+)C, v2.0, mieszczą się w przypisanych im przedziałach.
05923573049-05PL
23
Doc Rev. 5.0
Walidacja przebiegu testowego
Sprawdzić okno wyników programu AMPLILINK lub wydruk w poszukiwaniu oznaczeń i komentarzy, aby
stwierdzić, czy dany przebieg testowy jest ważny. Przebieg testowy jest ważny, jeśli żadna z kontroli
®
®
testu COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, nie została opatrzona znacznikiem błędu. Przebieg jest nieważny,
jeżeli kontrole testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, są opatrzone którymkolwiek z poniższych oznaczeń:
Kontrola ujemna
Znacznik
NC_INVALID
Wynik
Invalid
Interpretacja
Wynik nieważny albo ważny, lecz nie „Target Not
Detected”
Próba kontrolna nisko dodatnia dla HIV-1, v2.0
Znacznik
LPCINVALID
Wynik
Invalid
Interpretacja
Wynik nieważny lub kontrola poza zakresem
wartości
Próba kontrolna wysoko dodatnia dla HIV-1, v2.0
Znacznik
HPCINVALID
Wynik
Invalid
Interpretacja
Wynik nieważny lub kontrola poza zakresem
wartości
Jeżeli przebieg jest nieważny, należy powtórzyć cały przebieg testowy, w tym przygotowanie próbek
i kontroli, odwrotną transkrypcję, amplifikację i detekcję.
Interpretacja wyników
Jeśli przebieg pracy jest ważny, należy sprawdzić poszczególne próbki na wydruku z wynikami
w poszukiwaniu oflagowań lub komentarzy. Wyniki należy zinterpretować następująco:
•
Ważny przebieg może zawierać zarówno ważne, jak i nieważne próbki, zależnie od tego,
jakimi znacznikami i/lub komentarzami są one opatrzone.
05923573049-05PL
24
Doc Rev. 5.0
Wyniki badania próbek interpretuje się w następujący sposób:
Wynik (miano)
Jednostki międzynarodowe/ml
Kopie/ml
Target Not Detected
Interpretacja
Podać wynik jako „Nie wykryto RNA HIV-1”.
< 3.40E+01 C/mL
Obliczone wartości w kopiach/ml są mniejsze niż granica
oznaczalności testu. Podać wyniki jako „Wykryto RNA HIV-1,
mniej niż 34 kopii/ml RNA HIV-1”.
≥ 3.4E+01 C/mL oraz
≤ 1.00E+07 C/mL
Obliczone wyniki o wartości 34 kopii/ml lub wyższej albo
o wartości 1,00E+07 kopii/ml lub niższej mieszczą się
w zakresie liniowym testu.
> 1.00E+07 C/mL
Obliczona wartość w kopiach/ml jest powyżej zakresu testu.
Podać wyniki jako „Powyżej 1,00E+07 kopii RNA HIV-1/ml”. Jeśli
żądane są wyniki ilościowe, oryginalną próbkę należy rozcieńczyć
w proporcji 1:100 HIV-1-ujemnym ludzkim osoczem z dodatkiem
EDTA, a następnie powtórzyć test. Otrzymany wynik należy
pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia.
< 5.68E+01 IU/mL
Obliczone wartości w IU/ml są mniejsze niż granica
oznaczalności testu. Podać wyniki jako „Wykryto RNA HIV-1,
mniej niż 56,8 IU RNA HIV-1/ml”.
≥ 5.68E+01 IU/mL oraz
≤ 1.67E+07 IU/mL
Obliczone wyniki o wartości 56,8 IU/ml lub wyższej albo
o wartości 1,67E+07 IU/ml lub niższej mieszczą się w
zakresie liniowym testu.
> 1.67E+07 IU/mL
Obliczona wartość IU/ml przewyższa zakres testu. Podać wyniki
jako „Powyżej 1,67E+07 IU RNA HIV-1/ml”. Jeśli żądane są
wyniki ilościowe, oryginalną próbkę należy rozcieńczyć
w proporcji 1:100 HIV-1-ujemnym ludzkim osoczem z dodatkiem
EDTA, a następnie powtórzyć test. Otrzymany wynik należy
pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia.
Uwaga:
Próbki o wynikach powyżej zakresu wartości testu, dające wynik nieważny,
opatrzony
oznaczeniem
„QS_INVALID”,
nie
powinny
być
opisywane
jako >1,00E+07 kp/ml lub 1,67E+07 IU/ml. Oryginalną próbkę należy rozcieńczyć HIV1-ujemnym ludzkim osoczem z dodatkiem EDTA w stosunku 1:100, a następnie
powtórzyć test. Otrzymany wynik należy pomnożyć przez współczynnik
rozcieńczenia.
Uwaga:
Wyniki miana „Invalid”. Interpretacja: wynik nieważny.
KONTROLA JAKOŚCI
W każdym z przebiegów testowych, liczących do 24 próbek i kontroli, należy włączyć 1 powtórzenie
kontroli: COBAS® TaqMan® Negative Control, COBAS® TaqMan® HIV-1 Low (+) Control, v2.0, i COBAS®
TaqMan® HIV-1 High (+) Control, v2.0. Tak jak w przypadku każdej nowej procedury laboratoryjnej, nowy
operator powinien rozważyć zastosowanie dodatkowych, wewnętrznych kontroli za każdym razem, kiedy
przeprowadzany jest test, do czasu osiągnięcia dużego stopnia pewności dotyczącego poprawności
przeprowadzania testu. Nie ma wymagań co do położenia kontroli w nośniku na probówki K lub tacy K.
Należy sprawdzić, czy na wydruku przebiegu znajdują się oznaczenia i komentarze, aby się upewnić, że
jest on ważny.
Kontrola ujemna
Próba kontrolna CTM (–) C musi dawać wynik Target Not Detected, tj. wartość Ct dla RNA wirusa
HIV-1 powyżej granicznej wartości testu lub brak uzyskanej wartości Ct dla RNA wirusa HIV-1, lecz
jednocześnie ważny wynik oznaczania wartości Ct dla RNA standardu HIV-1 Quantitation Standard.
Jeżeli próba kontrolna CTM (–) C nie spełnia tego kryterium, wyniki całego przebiegu są nieważne.
Należy powtórzyć cały proces (przygotowanie próbek i kontroli, amplifikację i detekcję). Jeśli wyniki
kontroli CTM (–) C nadal pozostają nieważne, należy skontaktować się z miejscowym
przedstawicielstwem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej.
05923573049-05PL
25
Doc Rev. 5.0
Kontrole dodatnie
Przypisane zakresy wartości kontroli: HIV-1 L(+)C, v2.0, i HIV-1 H(+)C, v2.0, zostały zamieszczone
®
®
w karcie wartości kontrolnych testu COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure
System, dostarczonej łącznie z zestawem. Te zakresy są wprowadzane do stacji danych do
oprogramowania AMPLILINK.
Miano RNA wirusa HIV-1, wyrażone w kopiach/ml, dla obu kontroli: HIV-1 L(+)C, v2.0, i HIV-1 H(+)C,
v2.0, musi się mieścić w przedziale wartości zamieszczonym na karcie wartości kontrolnych testu
COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System, dostarczonej łącznie
z zestawem. Jeżeli jedna lub obie dodatnie kontrole nie spełniają tego kryterium, cały przebieg testu
jest nieważny. Należy powtórzyć cały proces (przygotowanie próbek i kontroli, amplifikację i detekcję).
Jeżeli obliczone miano RNA wirusa HIV-1 w jednej lub obu dodatnich próbach kontrolnych stale
mieści się poza przypisanym zakresem, należy zwrócić się do regionalnego przedstawicielstwa firmy
Roche w celu uzyskania pomocy technicznej.
ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DOTYCZĄCE PROCEDURY
1.
Jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia badania
kluczowe znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej. Z uwagi na wysoką
czułość analityczną niniejszego testu należy zachować wyjątkową ostrożność, aby zapewnić
czystość zestawów odczynników oraz mieszanin do amplifikacji i zapobiec potencjalnej
kontaminacji krzyżowej próbek i kontroli. Należy ściśle monitorować czystość wszystkich
odczynników. Należy usunąć wszystkie podejrzane odczynniki. Stosować dobrze dopasowane
do dłoni użytkownika rękawice. Rękawice należy często zmieniać, szczególnie po pracy
z kontrolami dodatnimi i otwieraniu pełnych probówek statywu do przeprowadzania lizy Lysis
Rack. Nigdy nie należy dotykać wewnętrznej strony pokrywek (np. podczas otwierania lub
zamykania).
OGRANICZENIA METODY
1.
Ten test został zatwierdzony wyłącznie do badania ludzkiego osocza pobranego na EDTA.
Badanie innych rodzajów próbek może dawać nieprawidłowe wyniki.
2.
Jeśli stosuje się probówki do otrzymywania nierozcieńczonego osocza BD Vacutainer® PPT™,
należy przechowywać w nich pełną krew w pozycji pionowej, w temperaturze 2–25°C nie
dłużej niż 24 godziny przed odwirowaniem. Po odwirowaniu osocze należy przenieść do
jałowej probówki polipropylenowej. Nie zamrażać probówek BD PPT™. Wstrząsanie
probówek BD PPT™ lub postępowanie z nimi w inny sposób, niż opisano, może zakłócać
oznaczenie zawartości wirusa HIV-1.
3.
Nie oceniono dotąd działania testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure
System dla próbek zawierających grupę N wirusa HIV-1.
4.
Uzyskanie wiarygodnych wyników zależy od właściwego pobrania próbki, transportu,
przechowywania oraz procedur przetwarzania.
5.
Obecność enzymu AmpErase w odczynniku testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0 Master Mix,
zmniejsza ryzyko skażenia amplikonu. Jednak zanieczyszczenia materiałem pochodzącym
z dodatnich dla HIV-1 kontroli i próbek klinicznych można uniknąć jedynie dzięki stosowaniu
zasad dobrej praktyki laboratoryjnej i uważnemu wykonywaniu procedur opisanych
w niniejszej ulotce, dołączonej do opakowania zestawu.
6.
Tego produktu powinny używać wyłącznie osoby wykwalifikowane w technikach PCR.
7.
Niniejszy produkt może być używany wyłącznie z analizatorem COBAS® TaqMan® 48.
8.
Mutacje w obrębie wysoko konserwatywnych regionów genomu wirusa, z którymi wiążą się
primery i/lub sondy używane w teście COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High
Pure System chociaż rzadkie, mogą spowodować niedoszacowanie ilości lub niewykrycie
wirusa.
9.
Detekcja RNA HIV-1 zależy od liczby cząsteczek wirusa obecnych w próbce, na którą mogą
wpływać metody pobierania próbek oraz czynniki związane z pacjentem (tj. wiek, obecność
objawów i/lub faza zakażenia).
10.
Z uwagi na różnice pomiędzy technologiami zaleca się, aby przed zmianą stosowanych metod
użytkownik przeprowadził w laboratorium badanie korelacji stosowanych metod w celu
określenia ilościowych różnic występujących pomiędzy nimi.
05923573049-05PL
26
Doc Rev. 5.0
11.
Niektóre izolaty HIV-1 grupy O mogą dawać wyniki zaniżone o 2 jednostki logarytmiczne.
Niektóre izolaty HIV-1 grupy M podgrupy G o wysokim mianie mogą dawać wyniki zaniżone
o 0,6 jednostki logarytmicznej.
SUBSTANCJE WPŁYWAJĄCE NA WYNIK TESTU
Wykazano, że podwyższone poziomy trójglicerydów (do 3500 mg/dl), bilirubiny (do 18 mg/dl),
albuminy (do 6200 mg/dl), hemoglobiny (do 250 mg/dl) i ludzkiego DNA (do 0,4 mg/dl) w próbkach,
a także obecność chorób autoimmunizacyjnych lub odpowiadających im markerów immunologicznych, takich jak np. toczeń rumieniowaty układowy (SLE), reumatoidalne zapalenie stawów
(RA), oraz obecność przeciwciał przeciwjądrowych (ANA) nie wpływają na wyniki oznaczeń
ilościowych RNA wirusa HIV-1 ani nie zaburzają swoistości testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do
stosowania z High Pure System. Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi CLSI
Guideline EP7-A2, z użyciem jednego zestawu odczynników testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do
stosowania z High Pure System.
Wykazano, że przedstawione w tabeli 1 składniki, przebadane w stężeniach 3-krotnie wyższych niż
maksymalne stężenie w osoczu (Cmax), nie wpływają na wyniki oznaczeń ilościowych RNA wirusa
®
®
HIV-1 ani nie zaburzają swoistości testu COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure
System.
Tabela 1
Leki przebadane pod kątem interferencji
Nukleotydowe inhibitory odwrotnej
transkryptazy i polimerazy DNA
Tenofowir DF
Dipiwoksyl adefowiru
Nukleozydowe inhibitory odwrotnej
transkryptazy i polimerazy DNA
Lamiwudyna, 3TC
Zidowudyna
Stawudyna, 4dT
Siarczan abakawiru
Didanozyna, ddI
Telbiwudyna
Entekawir
Emtricitabina
Inhibitory proteazy HIV
Sakwinawir
Ritonawir
Lopinawir/Ritonawir
Atazanawir
Metanosulfonian nelfinawiru
Darunawir
Tipranawir
Fosamprenawir
Nienukleozydowe inhibitory odwrotnej
transkryptazy HIV
Newirapina
Efawirenz
Inhibitor integrazy HIV
Raltegravir
Inhibitory fuzji HIV
Enfuwirtyd
Immunomodulatory
Rybawiryna
Peginterferon alfa-2a
Peginterferon alfa-2b
Inhibitor wejścia HIV
Maraviroc
Preparaty do leczenia zakażeń wirusami
opryszczki (Herpes)
Gancyklowir
Chlorowodorek walgancyklowiru
Acyklowir
05923573049-05PL
27
Doc Rev. 5.0
OCENA DZIAŁANIA W BADANIACH NIEKLINICZNYCH
A. Granica wykrywalności
®
®
Granica wykrywalności dla testu COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System,
została określona z użyciem międzynarodowego standardu WHO nr 2 dla RNA wirusa HIV-1, NIBSC
2, 37
Code 97/650
, podtyp B wirusa HIV-1, rozcieńczonego w ludzkim osoczu ujemnym dla HIV-1
z dodatkiem EDTA. Granica detekcji została określona dla trzech zestawów odczynników. Dla
każdego z zestawów odczynników analizie poddano co najmniej po pięć serii rozcieńczeń. Łącznie
przebadano 183 powtórzenia na każde rozcieńczenie. Badanie zostało przeprowadzone zgodnie
z wytycznymi CLSI Guideline EP17-A.
Stężenie RNA wirusa HIV-1, jakie można oznaczyć ze wskaźnikiem dodatniości powyżej 95%,
określonym na podstawie analizy PROBIT, wynosi 17 kopii/ml lub 29 IU/ml. Wyniki dla
poszczególnych partii, w kopiach/ml, wyniosły 15,6 kopii/ml (przedział ufności 95%: 13,3–
20,3 kopii/ml), 20,1 kopii/ml (przedział ufności 95%: 16,8–27,0 kopii/ml) i 15,8 kopii/ml (przedział
ufności 95%: 13,4–20,7 kopii/ml), odpowiednio dla partii 1, 2 i 3. Wyniki dla poszczególnych partii,
w IU/ml, wyniosły 26,1 IU/ml (przedział ufności 95%: 22,2–33,9 IU/ml), 33,6 IU/ml (przedział ufności
95%: 28,0–45,1 IU/ml) i 26,4 IU/ml (przedział ufności 95%: 22,3–34,6 IU/ml), odpowiednio dla partii 1,
2 i 3. Łączne wyniki dla wszystkich trzech zestawów odczynników przedstawiono w tabeli 2.
Współczynnik przeliczania IU/ml na kopie/ml został określony z użyciem testu COBAS®
AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HIV-1
MONITOR, v1.5, oraz testu COBAS® TaqMan® HIV-1 do stosowania z High Pure System.
Tabela 2
Granica wykrywalności testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0,
do stosowania z High Pure System
na podstawie międzynarodowego standardu WHO oraz analizy PROBIT
Nominalne
stężenie
wejściowe
(RNA HIV-1
IU/ml)
Nominalne
stężenie
wejściowe
(RNA HIV-1
kopie/ml)
Liczba
powtórzeń
testu
Liczba
wyników
dodatnich
Odsetek
wyników
dodatnich
83
50
183
183
100,0%
62
37
182
181
99,5%
45
27
183
181
98,9%
33
20
182
174
95,6%
25
15
183
174
95,1%
17
10
183
146
79,8%
PROBIT 95-procentowy
odsetek trafień
29 IU/ml (95-procentowy przedział ufności: 26,0–32,9)
17 kopii/ml (95-procentowy przedział ufności: 15,6–19,7)
Granicę wykrywalności potwierdzono na podtypach HIV-1 grupy M, badając wyhodowane izolaty
podtypów A, B, C, D, CRF01_AE, F, G i H grupy M w nominalnych stężeniach wynoszących około 10,
15, 20, 40 i 60 kopii/ml w ludzkim osoczu ujemnym dla HIV-1 z dodatkiem EDTA, w co najmniej
48 powtórzeniach na dane stężenie. Stężenia nominalne określono dla izolatów hodowlanych
z uśrednionych mian RNA wirusa HIV-1, uzyskanych w teście COBAS® AMPLICOR® HIV-1
MONITOR, v1.5, i dwóch porównawczych testach diagnostycznych in vitro na RNA wirusa HIV-1.
Obserwowano dodatnie wyniki na poziomie 95% i wyższym dla wszystkich podtypów grupy M
w stężeniach 15–40 kopii/ml i większych. Wyniki przedstawiono w tabeli 3.
05923573049-05PL
28
Doc Rev. 5.0
Tabela 3
Granica kontroli wykrywalności dla testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0,
do stosowania z High Pure System dla podtypów A–H grupy M wirusa HIV-1
oraz 95-procentowej analizy odsetka trafień
Podtyp
Oznaczenie izolatu
Najniższy poziom stężenia przy
≥ 95-procentowym odsetku
trafień (kopie/ml)
20
A
92UG029
B
8E5/LAV
40
C
92BR025
10
D
92UG021
15
CRF01_AE
92TH022
15
F
93BR020
20
G
ARP173/RU570
15
H
HIV V1557
15
B. Dokładność
Dokładność testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System określono na
podstawie analizy seryjnych rozcieńczeń próbki zawierającej supernatant z hodowli komórkowej
wirusa HIV-1 (podtyp B wirusa HIV-1) w ludzkim osoczu ujemnym dla HIV-1 z dodatkiem EDTA.
Oznaczenie miana supernatantów z hodowli komórkowych (stężenia roztworu podstawowego)
przeprowadzono metodą gwarantującą zgodność z międzynarodowym standardem Światowej
Organizacji Zdrowia (WHO) nr 2 dla RNA wirusa HIV-1, NIBSC Code 97/6502, 37. Przeanalizowano
trzy zestawy odczynników, po 15 przebiegów pracy dla każdego z zestawu, z 6 poziomami
rozcieńczeń dla każdej z prób oraz 3 powtórzeniami dla każdego z poziomów. Każda próbka
przeszła pełną procedurę testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System
wliczając w to przygotowanie próbki, amplifikację i detekcję. Dlatego podana dokładność
odzwierciedla wszystkie aspekty procedury badawczej. Łączne wyniki dla wszystkich trzech
zestawów odczynników przedstawiono w tabeli 4.
Tabela 4
Dokładność testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System
Wszystkie trzy serie połączone
Liczba
Całkowite
odchylenie
standardowe
(SD)
(log10 miana)
Całkowity CV
dla rozkładu
lognormalnego
(%)
1,93
135
0,19
46
2,93
136
0,09
22
8,6E+03
3,93
136
0,09
22
8,6E+04
4,93
136
0,07
17
8,6E+05
5,93
136
0,07
17
8,6E+06
6,93
136
0,14
33
Miano
(kopie/ml)
Log10 miana
(log10
kopii/ml)
8,6E+01
8,6E+02
05923573049-05PL
29
Doc Rev. 5.0
C. Zakres liniowy
®
®
Liniowość testu COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System określono na
podstawie analizy seryjnych rozcieńczeń próbki o wysokim mianie, zawierającej supernatant
z hodowli komórkowej wirusa HIV-1 (podtyp B wirusa HIV-1) w prawidłowym ludzkim osoczu ujemnym
dla HIV-1 z dodatkiem EDTA. Oznaczenie miana supernatantów z hodowli komórkowych (stężenia
roztworu podstawowego) przeprowadzono metodą gwarantującą zgodność z międzynarodowym
standardem Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) nr 2 dla RNA wirusa HIV-1, NIBSC Code 97/6502, 37.
Test COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System wykazał liniowość od
9 (log10= 0,93) kopii/ml RNA HIV-1 do 1,7E+07 (log10 = 7,24) kopii/ml RNA wirusa HIV-1, z dolną
granicą oceny ilościowej wynoszącą 34 (log10 = 1,54) kopii/ml RNA wirusa HIV-1 i górną granicą
oceny ilościowej wynoszącą 1,0E+07 (log10 = 7,00) kopii/ml RNA wirusa HIV-1. Badanie zostało
przeprowadzone zgodnie z wytycznymi CLSI Guidelines EP6-A i EP17-A, z użyciem dwóch
zestawów odczynników testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0. Wykonano 15 przebiegów testowych
na każdym zestawie odczynników, przy czym każdy obejmował 14 poziomów rozcieńczeń
i 3 powtórzenia na każdym poziomie. Łączne wyniki dla obu zestawów odczynników przedstawiono
na rysunku 9.
Rysunek 9
Liniowość testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System
®
®
Test COBAS TaqMan HIV-1, v2.0
8
y = 1,023x - 0,292
2
R = 0,983
7
6
5
4
3
2
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Stężenie nominalne
D. Badanie reprezentatywności grupy M wirusa HIV-1
Działanie testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System na podtypy HIV-1
grupy M oceniano, analizując wyhodowane izolaty podtypów A, B, C, D, CRF01_AE, F, G i H
grupy M w nominalnych stężeniach wynoszących około 2,0E+02, 2,0E+04 i 2,0E+06 kopii/ml
w osoczu z dodatkiem EDTA. Stężenia nominalne określono na podstawie uśrednionych mian RNA
wirusa HIV-1, uzyskanych w teście COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5, i porównawczego
testu diagnostycznego in vitro na RNA wirusa HIV-1. Porównywano siedem powtórzeń testu
COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System dla każdej próbki i porównywano
średnie wartości log10 miana z mianami nominalnymi. Przy użyciu testu COBAS® TaqMan® HIV-1,
v2.0, do stosowania z High Pure System uzyskano wyniki równoważne ze stężeniami nominalnymi
dla wszystkich badanych podtypów grupy M wirusa HIV-1 (rysunek 10). Średnia wartość log10
stężenia wszystkich próbek znajdowała się w przedziale ±0,3 log10 stężenia nominalnego,
z wyjątkiem próbek o najwyższych stężeniach dwóch z trzech testowanych izolatów podtypu G, które
dały wyniki o 0,51 i 0,56 log10 poniżej stężenia nominalnego 6,30 log10 kopii/ml (2,0E+06 kopii/ml).
05923573049-05PL
30
Doc Rev. 5.0
Rysunek 10
Test COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System
Badanie reprezentatywności – supernatanty kultur komórkowych grupy M
Skuteczność w badaniu podtypów grupy M testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania
z High Pure System, w porównaniu z testem COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0,
oceniono na 308 próbkach o znanym podtypie, w tym 141 próbkach podtypów grupy M innych niż
podtyp B. Testy COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System i COBAS®
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, dawały równoważne wyniki we wszystkich podtypach
(rysunek 12).
E. Wykrywalność grupy O wirusa HIV-1
Skuteczność testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System w badaniu
próbek HIV-1 z grupy O oceniano, badając trzy izolaty hodowli HIV-1 z grupy O rozcieńczone do
różnych stężeń w ludzkim osoczu z dodatkiem EDTA. Stężenia nominalne określono dla każdego
z izolatów, stosując porównawczy test diagnostyczny in vitro na RNA wirusa HIV-1, w tym HIV-1
z grupy O. Granicę wykrywalności testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure
System w badaniu próbek HIV-1 z grupy O oceniano, badając trzy izolaty o stężeniach nominalnych
pomiędzy 10 a 200 kopii/ml (tabela 5). Wykonano 48 powtórzeń testu dla każdego stężenia. Dla
dwóch z trzech izolatów podtypów grupy O obserwowano dodatnie wyniki na poziomie 94%
i wyższym w stężeniach 15–20 kopii/ml i większych. Dla jednego z trzech izolatów podtypów grupy O
(MVP5180), obserwowano dodatnie wyniki na poziomie 92% i wyższym w stężeniach 100 kopii/ml
i większych, a limitem 95% wykrywalności w analizie probitowej było stężenie 112 kopii/ml.
Liniowość testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System w badaniu
próbek HIV-1 z grupy O oceniano, badając te same trzy izolaty rozcieńczone w ludzkim osoczu
z dodatkiem EDTA do stężeń 2,0E+2, 2,0E+4 i 2,0E+6 kopii/ml. Wykonano 7 powtórzeń testu dla
każdego stężenia (rysunek 11). Dla dwóch z trzech izolatów, średnie wartości log10 wyników dla
wszystkich rozcieńczeń znajdowały się w przedziale wartości ± 0,3 log10 stężenia nominalnego.
Średnie wyniki log10 dla izolatu MVP5180 wynosiły około 1,3 log poniżej stężeń nominalnych. Średnie
wyniki dla próbki MVP5180 o niskim stężeniu, pokazane na rysunku 11, stanowią dolną granicę
oznaczenia ilościowego (34 kopie/ml). We wszystkich powtórzeniach wykryto wirus, lecz wszystkie
wyniki były poniżej granicy wykrywalności testu.
Skuteczność testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System w badaniu
próbek HIV-1 z grupy O oceniano następnie, badając sześć dodatkowych izolatów hodowli z grupy O
rozcieńczonych w ludzkim osoczu z dodatkiem EDTA z zastosowaniem testu COBAS® TaqMan®
HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System i porównawczego testu diagnostycznego in vitro na
RNA wirusa HIV-1, w tym HIV-1 z grupy O (tabela 6). W przypadku pięciu z sześciu testów uzyskano
w teście COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System wyniki równoważne do
wyników testu porównawczego; w przypadku jednego izolatu wyniki testu COBAS® TaqMan® HIV-1,
v2.0, do stosowania z High Pure System były niższe.
05923573049-05PL
31
Doc Rev. 5.0
Tabela 5
Granica wykrywalności testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0,
do stosowania z High Pure System w badaniu izolatów HIV-1 z grupy O
Izolaty
z grupy O
Nominalne
stężenie
wejściowe
(RNA HIV-1
kopie/ml)
Liczba
powtórzeń
Liczba
wyników
dodatnich
Odsetek
wyników
dodatnich
100
48
48
100%
80
48
48
100%
60
48
48
100%
40
20
48
48
48
45
100%
94%
100
47
47
100%
80
60
48
48
48
48
100%
100%
40
48
48
100%
20
48
46
96%
15
10
48
48
47
44
98%
92%
200
47
47
100%
175
150
100
80
60
48
48
48
47
48
47
48
44
43
38
98%
100%
92%
91%
79%
40
48
33
69%
20
48
25
52%
BCF01
BCF03
MVP5180
PROBIT
95-procentowy
odsetek trafień
20 kopii/ml
(95-procentowy
przedział ufności:
niedostępny)
13 kopii/ml
(95-procentowy
0,7–24 kopii/ml)
112 kopii/ml
(95-procentowy
90–156 kopii/ml)
Rysunek 11
Test COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System
Badanie reprezentatywności – supernatanty kultur komórkowych grupy O
05923573049-05PL
32
Doc Rev. 5.0
Tabela 6
Porównanie testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System
z porównawczym testem do diagnostyki in vitro izolatów HIV-1 z grupy O
Log10 RNA wirusa HIV-1 [kopie/ml]
Test COBAS®
TaqMan®
HIV-1, v2.0
Test
porównawczy
Różnica
(COBAS® TaqMan®
HIV-1, v2.0 – test
porównawczy)
1,0E+4
4,16
4,20
-0,04
BCR06
1,0E+4
4,43
4,34
0,10
BCF07
1,0E+4
3,98
4,10
-0,12
BCF11
1,0E+4
4,35
4,58
-0,23
BCF13
1,0E+4
2,79
4,69
-1,90
I2478B
100
3,25
3,40
-0,15
Izolaty
z grupy O
Współczynnik
BCF02
F. Swoistość
Swoistość kliniczną testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System określono
na podstawie analizy próbek osocza ujemnego dla HIV-1 z dodatkiem EDTA, pobranych od zdrowych
dawców krwi, przy użyciu 2 zestawów odczynników. Przebadano ogółem 547 próbek osocza
z dodatkiem EDTA z zastosowaniem testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure
System z czego 543 próbek dało wynik „Target Not Detected”, 3 dały wynik „<34 copies/mL”, a 1 była
®
®
nieważna. Na podstawie tych wyników swoistość testu COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, do stosowania
z High Pure System wynosi 99,5% (dolna granica jednostronnego 95-procentowego przedziału ufności
na poziomie 98,45%).
G. Swoistość analityczna
Swoistość analityczną testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System
określono przez dodanie do niezawierającego HIV-1 osocza ludzkiego z dodatkiem EDTA oraz do
zawierającego HIV-1 osocza ludzkiego z dodatkiem EDTA o stężeniu HIV-1 2,4E+02 kopii/ml
mikroorganizmów z hodowli (wirusy, bakterie, drożdże) lub DNA (HTLV-2) o stężeniu wejściowym
1E+06 cząstek/ml (patrz tabela 7). Żaden z badanych mikroorganizmów nie wykazał reakcji krzyżowej
z testem COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System ani nie zaburzał jego
działania. We wszystkich badanych próbkach niezawierających HIV-1, lecz zawierających inne
mikroorganizmy, uzyskano wynik „Target Not Detected”. W próbkach zawierających HIV-1, w obecności
badanych mikroorganizmów uzyskiwano miano RNA z dokładnością 0,2 log10 kopii/ml RNA wirusa HIV-1
w porównaniu z próbkami kontrolnymi zawierającymi HIV-1.
05923573049-05PL
33
Doc Rev. 5.0
Tabela 7
Materiały do oceny swoistości analitycznej
Wirus
Adenowirus typ 5
Wirus cytomegalii
Wirus Epsteina-Barr
Ludzki wirus opryszczki typu 6
Wirus opryszczki Herpes simplex typu 1
Wirus opryszczki Herpes simplex typu 2
Ludzki wirus T-limfotropowy typu 1
Ludzki wirus T-limfotropowy typu 2
Ludzki wirus upośledzenia odporności typu 2
Wirus grypy typu A
Wirus zapalenia wątroby typu A
Wirus zapalenia wątroby typu B
Wirus zapalenia wątroby typu C
Bakteria
Staphylococcus aureus
Propionibacterium acnes
Drożdżak
Candida albicans
H. Korelacja metody
Skuteczność testu COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System porównywano ze
skutecznością testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, analizując 308 próbek
klinicznych zawierających HIV-1. Wszystkie próbki rozcieńczono w proporcji 1:5 w osoczu
niezawierającym HIV-1 z dodatkiem EDTA i testowano w dwóch powtórzeniach z zastosowaniem testów
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, i COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania
z High Pure System. 290 próbek dało co najmniej jeden ważny wynik w zakresie liniowości obu testów.
Analiza regresji Deminga średnich wyników log miana wirusowego dała nachylenie krzywej 0,991, punkt
przecięcia 0,09 i współczynnik determinacji 0,983 (rysunek 12). Średnia różnica log pomiędzy metodami
wynosiła 0,06 (95-procentowy przedział ufności 0,04 do 0,07).
Podtyp wszystkich próbek był znany. Zastosowano 167 próbek podtypu B (54%) i 141 próbek (46%)
podtypów grupy M innych niż B. Próbki podtypów innych niż B obejmowały wszystkie podtypy
głównej grupy M i formy zrekombinowane (tabela 8). Średnia różnica log pomiędzy metodami
wynosiła 0,09 dla próbek podtypu B i 0,02 dla próbek innych podtypów.
Tabela 8
Rozkład podtypów w próbkach klinicznych w porównaniu metod klinicznych
Podtyp
Liczba
Podtyp
A
3
G
8
CRF10_CD
3
B
167
H
3
CRF11_CPX
4
C
16
CRF01_AE
15
CRF13_CPX
12
D
5
CRF02_AG
47
CRF14_BG
6
F
10
CRF09_CPX
3
CX
6
05923573049-05PL
Liczba
34
Podtyp
Liczba
Doc Rev. 5.0
Rysunek 12
Korelacja testów COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0, do stosowania z High Pure System
®
i COBAS AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1, v2.0
8
A (n = 3)
B (n = 154)
C (n = 16)
D (n = 5)
F (n = 8)
G (n = 7)
H (n = 3)
CRF01_AE (n = 15)
CRF02_AG (n = 45)
CRF09_CPX (n = 3)
CRF11_CPX (n = 4)
CRF13_CPX (n = 12)
CX (n = 6)
CRF10_CD (n = 3)
CRF14_BG (n = 6)
®
®
do stosowania z High Pure System
Log10 ilości RNA wirusa HIV-1, wartość średnia [kopie/ml]
Test COBAS TaqMan HIV-1, wersja 2.0
7
6
5
4
3
2
Regresja SPC
Y = 0,991 * X + 0,09
2
1
R = 0,9831
N = 290
0
0
1
2
3
4
®
5
®
6
7
8
®
Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, wersja 2.0
Log10 ilości RNA wirusa HIV-1, wartość średnia [kopie/ml]
05923573049-05PL
35
Doc Rev. 5.0
PIŚMIENNICTWO
1.
Holmes H, Davis C, Heath A, Hewlett I, Lelie N. 2001. An international collaborative study to
establish the 1st international standard for HIV-1 RNA for use in nucleic acid-based
techniques. J Virol Methods 92: 141-150
2.
National Institute for Biological Standards and Control. Blanche Lane, South Mimms, Potters
Bar Hertfordshire, EN6 3QG United Kingdom,
3.
Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, Nugeyre MT, Chamaret S, Gruest J, Dauguet C,
Axler-Blin C, Vezinet-Brun F, Rouzioux C, Rozenbaum W, Montagnier L. 1983. Isolation of a
T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome
(AIDS). Science 220: 868-871
4.
Gallo RC, Salahuddin SZ, Popovic M, Shearer GM, Kaplan M, Haynes BF, Palker TJ, Redfield
R, Oleske J, Safai B, et al. 1984. Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses
(HTLV-III) from patients with AIDS and at risk for AIDS. Science 224: 500-503
5.
Popovic M, Sarngadharan MG, Read E, Gallo RC. 1984. Detection, isolation, and continuous
production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS.
Science 224: 497-500
6.
Curran JW, Jaffe HW, Hardy AM, Morgan WM, Selik RM, Dondero TJ. 1988. Epidemiology of
HIV infection and AIDS in the United States. Science 239: 610-616
7.
Gaines H, von Sydow MA, von Stedingk LV, Biberfeld G, Bottiger B, Hansson LO, Lundbergh
P, Sonnerborg AB, Wasserman J, Strannegaard OO. 1990. Immunological changes in primary
HIV-1 infection. Aids 4: 995-999
Tindall B, Cooper DA. 1991. Primary HIV infection: host responses and intervention strategies.
Aids 5: 1-14
8.
9.
Daar ES, Moudgil T, Meyer RD, Ho DD. 1991. Transient high levels of viremia in patients with
primary human immunodeficiency virus type 1 infection. N Engl J Med 324: 961-964
10.
Clark SJ, Saag MS, Decker WD, Campbell-Hill S, Roberson JL, Veldkamp PJ, Kappes JC,
Hahn BH, Shaw GM. 1991. High titers of cytopathic virus in plasma of patients with
symptomatic primary HIV-1 infection. N Engl J Med 324: 954-960
11.
Horsburgh CR, Jr., Ou CY, Jason J, Holmberg SD, Longini IM, Jr., Schable C, Mayer KH,
Lifson AR, Schochetman G, Ward JW, et al. 1989. Duration of human immunodeficiency virus
infection before detection of antibody. Lancet 2: 637-640
12.
Schnittman SM, Psallidopoulos MC, Lane HC, Thompson L, Baseler M, Massari F, Fox CH,
Salzman NP, Fauci AS. 1989. The reservoir for HIV-1 in human peripheral blood is a T cell
that maintains expression of CD4. Science 245: 305-308
13.
Schnittman SM, Greenhouse JJ, Psallidopoulos MC, Baseler M, Salzman NP, Fauci AS, Lane
HC. 1990. Increasing viral burden in CD4+ T cells from patients with human immunodeficiency
virus (HIV) infection reflects rapidly progressive immunosuppression and clinical disease. Ann
Intern Med 113: 438-443
14.
Pantaleo G, Graziosi C, Fauci AS. 1993. New concepts in the immunopathogenesis of human
immunodeficiency virus infection. N Engl J Med 328: 327-335
15.
Piatak M, Jr., Saag MS, Yang LC, Clark SJ, Kappes JC, Luk KC, Hahn BH, Shaw GM, Lifson
JD. 1993. High levels of HIV-1 in plasma during all stages of infection determined by
competitive PCR. Science 259: 1749-1754
16.
Fauci AS, Schnittman SM, Poli G, Koenig S, Pantaleo G. 1991. NIH conference.
Immunopathogenic mechanisms in human immunodeficiency virus (HIV) infection. Ann Intern
Med 114: 678-693
17.
Coffin JM. 1995. HIV population dynamics in vivo: implications for genetic variation,
pathogenesis, and therapy. Science 267: 483-489
18.
Ho DD, Neumann AU, Perelson AS, Chen W, Leonard JM, Markowitz M. 1995. Rapid turnover
of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection [see comments]. Nature 373: 123126
05923573049-05PL
36
Doc Rev. 5.0
19.
Wei X, Ghosh SK, Taylor ME, Johnson VA, Emini EA, Deutsch P, Lifson JD, Bonhoeffer S,
Nowak MA, Hahn BH, et al. 1995. Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1
infection. Nature 373: 117-122
20.
O'Brien WA, Hartigan PM, Martin D, Esinhart J, Hill A, Benoit S, Rubin M, Simberkoff MS,
Hamilton JD. 1996. Changes in plasma HIV-1 RNA and CD4+ lymphocyte counts and the risk
of progression to AIDS. Veterans Affairs Cooperative Study Group on AIDS. N Engl J Med
334: 426-431
21.
Welles SL, Jackson JB, Yen-Lieberman B, Demeter L, Japour AJ, Smeaton LM, Johnson VA,
Kuritzkes DR, D'Aquila RT, Reichelderfer PA, Richman DD, Reichman R, Fischl M, Dolin R,
Coombs RW, Kahn JO, McLaren C, Todd J, Kwok S, Crumpacker CS. 1996. Prognostic value
of plasma human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) RNA levels in patients with advanced
HIV-1 disease and with little or no prior zidovudine therapy. AIDS Clinical Trials Group
Protocol 116A/116B/117 Team. J Infect Dis 174: 696-703
22.
Coombs RW, Welles SL, Hooper C, Reichelderfer PS, D'Aquila RT, Japour AJ, Johnson VA,
Kuritzkes DR, Richman DD, Kwok S, Todd J, Jackson JB, DeGruttola V, Crumpacker CS,
Kahn J. 1996. Association of plasma human immunodeficiency virus type 1 RNA level with risk
of clinical progression in patients with advanced infection. AIDS Clinical Trials Group (ACTG)
116B/117 Study Team. ACTG Virology Committee Resistance and HIV-1 RNA Working
Groups. J Infect Dis 174: 704-712
23.
Hammer S, Crumpacker C, D'Aquila R, Jackson B, Lathey J, Livnat D, Reichelderfer P. 1993.
Use of virologic assays for detection of human immunodeficiency virus in clinical trials:
recommendations of the AIDS Clinical Trials Group Virology Committee. J Clin Microbiol 31:
2557-2564
24.
Schochetman G, George JR. 1994. AIDS testing : a comprehensive guide to technical,
medical, social, legal, and management issues. New York: Springer-Verlag. xiv, 411 p. pp.
25.
Mulder J, McKinney N, Christopherson C, Sninsky J, Greenfield L, Kwok S. 1994. Rapid and
simple PCR assay for quantitation of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma:
application to acute retroviral infection. J Clin Microbiol 32: 292-300
26.
Dewar RL, Highbarger HC, Sarmiento MD, Todd JA, Vasudevachari MB, Davey RT, Jr., Kovacs
JA, Salzman NP, Lane HC, Urdea MS. 1994. Application of branched DNA signal amplification to
monitor human immunodeficiency virus type 1 burden in human plasma. J Infect Dis 170: 11721179
27.
van Gemen B, Kievits T, Schukkink R, van Strijp D, Malek LT, Sooknanan R, Huisman HG,
Lens P. 1993. Quantification of HIV-1 RNA in plasma using NASBA during HIV-1 primary
infection. J Virol Methods 43: 177-187
28.
Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. 1985. Enzymatic
amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of
sickle cell anemia. Science 230: 1350-1354
29.
Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. 1988.
Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science
239: 487-491
30.
Mullis KB, Faloona FA. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed
chain reaction. Methods Enzymol 155: 335-350
31.
Meng Q, Wong C, Rangachari A, Tamatsukuri S, Sasaki M, Fiss E, Cheng L, Ramankutty T,
Clarke D, Yawata H, Sakakura Y, Hirose T, Impraim C. 2001. Automated multiplex assay
system for simultaneous detection of hepatitis B virus DNA, hepatitis C virus RNA, and human
immunodeficiency virus type 1 RNA. J Clin Microbiol 39: 2937-2945
32.
Smith ES, Li AK, Wang AM, Gelfand DH, Myers TW. 2003. Amplification of RNA: Hightemperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-activated
Thermostable DNA Polymerase. In PCR Primer: A Laboratory Manual, ed. CW Dieffenbach,
GS Dveksler, pp. 211-219. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press
33.
Kwok S, Sninsky JJ. 1993. PCR Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral
DNA Sequences. In Diagnostic molecular microbiology : principles and applications, ed. DH
Persing, TF Smith, FC Tenover, TJ White, pp. 309-315. Washington, D.C.: American Society
for Microbiology
05923573049-05PL
37
Doc Rev. 5.0
34.
Longo MC, Berninger MS, Hartley JL. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carryover contamination in polymerase chain reactions. Gene 93: 125-128
35.
Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, Griffith R. 1992. Simultaneous amplification and detection
of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y) 10: 413-417
36.
Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. 1996. Real time quantitative PCR. Genome Res 6:
986-994
37.
Davis C, Berry N, Heath A, Holmes H. 2008. An international collaborative study to establish a
replacement World Health Organization International Standard for human immunodeficiency
virus 1 RNA nucleic acid assays. Vox Sang 95: 218-225
38.
Richmond JY, McKinney RW, Centers for Disease Control (U.S.), National Institutes of Health
(U.S.). 1999. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. Washington: U.S.
G.P.O. : For sale by the Supt. of Docs., U.S. G.P.O. ix, 250 p. pp.
39.
Clinical and Laboratory Standards Institute. 2005. Protection of Laboratory Workers From
Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline-Third Edition. CLSI document M29-A3
[ISBN 1-56238-5674],. Wayne, PA 19087-1898 USA, 2005: CLSI. viii, 111 p. pp.
40.
International Air Transport Association. 2010. Dangerous Goods Regulations
05923573049-05PL
38
Doc Rev. 5.0
Informacje dotyczące wersji dokumentu
Z części ODCZYNNIKI usunięto symbole ostrzegające o niebezpieczeństwie,
hasła ostrzegawcze i kody.
Dodano symbol GTIN oraz jego opis na stronie z ujednoliconymi symbolami.
Zaktualizowano część dotyczącą znaków towarowych i patentów w celu
odzwierciedlenia tylko źródeł internetowych.
Z informacji o prawach autorskich usunięto tekst „Wszystkie prawa
zastrzeżone”.
W razie jakichkolwiek pytań prosimy o kontakt z miejscowym
przedstawicielstwem firmy Roche.
Doc Rev. 5.0
03/2015
Roche Molecular Systems, Inc.
1080 US Highway 202 South
Branchburg, NJ 08876 USA
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
Industriestrasse 7
6343 Rotkreuz, Switzerland
Roche Diagnostics
2, Avenue du Vercors
38240 Meylan, France
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Strasse 116
68305 Mannheim, Germany
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics S.p.A.
Viale G. B. Stucchi 110
20052 Monza, Milano, Italy
Distributed by
Roche Diagnostics, SL
Avda. Generalitat, 171-173
E-08174 Sant Cugat del Vallès
Barcelona, Spain
Roche Diagnostics
201, boulevard Armand-Frappier
H7V 4A2 Laval, Québec, Canada
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877-273-3433)
Distribuidor em Portugal:
Roche Sistemas de Diagnósticos Lda.
Estrada Nacional, 249-1
2720-413 Amadora, Portugal
Roche Diagnostica Brasil Ltda.
Av. Engenheiro Billings, 1729
Jaguaré, Building 10
05321-010 São Paulo, SP Brazil
Znaki towarowe i patenty
Patrz http://www.roche-diagnostics.us/patents
©2015 Roche Molecular Systems, Inc.
03/2015
Doc Rev. 5.0
05923573049-05PL
(05923573001-05ENGL)
05923573049-05
39
Doc Rev. 5.0
Na etykietach produktów diagnostycznych Roche PCR stosuje się obecnie
następujące oznaczenia.
Oprogramowanie pomocnicze
Wyrób do diagnostyki in vitro
Autoryzowany Przedstawiciel we
Wspólnocie Europejskiej
Dolna granica przypisanego zakresu
Arkusz kodów kreskowych
Wytwórza
Kod partii
Przechowywać z dala od światła
Zagrożenie biologiczne
Zawartość wystarczająca na <n>
testów
Numer katalogowy
Przestrzegać zakresu temperatury
SW
Sprawdź w instrukcji obsługi
Plik definicji testów
TDF
Zawartość zestawu
Górna granica przypisanego zakresu
Dystrybucja przez
Użyć przed
Wyłącznie do oceny działania
w badaniach IVD
Numer pozycji handlu globalnego
Ten produkt spełnia wymogi dyrektywy Wspólnoty Europejskiej 98/79/WE
dotyczącej diagnostycznych urządzeń medycznych do stosowania in vitro.
Linia pomocy technicznej dla klientów w Stanach Zjednoczonych 1-800-526-1247
05923573049-05PL
40
Doc Rev. 5.0

COBAS® TaqMan® HIV-1 Test, version 2.0

Transkrypt

Podobne dokumenty

Kontrola QConnect™ HIVp24 - Thermo Fisher Scientific

AcroMetrix™ Kontrola o wysokiej zawartości HIV-1

AcroMetrix™ Kontrola o niskiej zawartości HIV-1

Rodzaje RNA - Biologia.net.pl

6.2 Część VI.2 Podsumowanie planu zarządzania ryzykiem

biochemia wirusa hiv