ĆWICZENIE 5 Optymalizacja rozdzielania mieszaniny wybranych

ĆWICZENIE 5
Optymalizacja rozdzielania mieszaniny wybranych związków metodą HPLC
Wstęp
Celem ćwiczenia jest optymalizacja składu i prędkości przepływu fazy ruchomej oraz analiza jakościowa
wybranych związków w próbkach wodnych metodą HPLC-UV/Vis. Próbka wodna zostanie poddana
ekstrakcji do fazy stałej (SPE) w celu wyodrębnienia niepolarnych analitów: benzenu i toluenu.
Wykonanie ćwiczenia
1. Dobór warunków analizy HPLC
Sporządzić pierwszą fazę ruchomą zawierającą wodę i metanol o wybranym przez studentów składzie (po
konsultacji z prowadzącym). Wykonać analizę próbki zawierającej benzen i toluen. Ocenić wynik
rozdzielenia. Warunki pracy chromatografu HPLC:
· kolumna HPLC C18,
· przepływ fazy ruchomej 0,5 ml/min,
· długość fali λ = 254 nm
WAŻNE! Podczas pracy zestawu HPLC należy często sprawdzać poziom rozpuszczalnika w
kolbie z fazą ruchomą, by nie dopuścić do zassania powietrza przez pompę.
Przed każdą analizą należy przemyć kilkakrotnie badaną próbą strzykawkę i pętlę dozownika
metanolem.
Przygotować drugą fazę ruchomą zmieniając proporcje rozpuszczalników użyte do przygotowania
fazy pierwszej. Ponownie wykonać analizę próbki zawierającej benzen i toluen. Ocenić wynik rozdzielenia.
W razie konieczności (niewystarczające rozdzielenie sygnałów) przygotować kolejną fazę o innym składzie.
Przy użyciu przygotowanej fazy ruchomej wykonać analizę HPLC roztworów wzorcowych benzenu
oraz toluenu w celu wyznaczenia czasów retencji.
Wykonać analizę próbki zawierającej benzen i toluen przy użyciu najlepszej z przetestowanych faz
stosując inną prędkość przepływu (raz obniżając raz podwyższając prędkość w stosunku do prędkości
wyjściowej 0,5 ml/min). Ocenić wpływ prędkości przepływu fazy ruchomej na wynik rozdzielenia i kształt
sygnałów.
Po każdej analizie z chromatogramu odczytać czasy retencji poszczególnych analitów i sporządzić
rysunek w formacie JPG jako dokumentację analizy zawartą w sprawozdaniu.
2. Przygotowanie próbki wody do analizy właściwej – rozdział metodą SPE
Celem rozdziału metodą SPE jest przygotowanie próbki do analizy właściwej czyli wyizolowanie analitów
z matrycy w maksymalnie czystej i skoncentrowanej postaci.
Strata-X (Phenomenex) – sorbent: C18, faza niepolarna.
Warunki rozdziału z zastosowaniem ekstrakcji do fazy stałej:
kondycjonowanie kolumny: 6 mL MeOH, 6 mL woda
nanoszenie próbki: 100 mL próbki wody
osuszenie złoża
elucja: 6 mL MeOH
regeneracja złoża: 6 mL MeOH
osuszenie kolumienki
Wykonać analizę HPLC otrzymanej frakcji 6 mL MeOH w opracowanych podczas zajęć warunkach.
Na podstawie czasów retencji zidentyfikować anality obecne w próbce wody.
Odczynniki i sprzęt laboratoryjny
·zestaw do ekstrakcji do fazy stałej – SPE: kolumienki Strata-X C18, kolbka podłączona
do pompki wodnej, szklana nadstawka do dozowania próbki wody;
· cylinder miarowy poj. 100 mL - 2 szt.,
· pipety o poj. 5 mL 4 szt.,
· zlewka o pojemności 25 mL 1 szt.,
· pipeta Pasteura,
· strzykawka o poj. 50 µL,
· strzykawka o poj. 100 µL do HPLC,
· buteleczki z ciemnego szkła o poj. 2 mL 5 szt.,
· metanol,
· woda destylowana,
· kolba stożkowa o poj. 100 mL 3 szt.,
· roztwory wzorcowe benzenu i toluenu o stężeniu 0,2 mg/mL (w MeOH);
· zanieczyszczona próbka wody,
· chromatograf HPLC: pompa, dozownik typu zaworu z pętlą, kolumna chromatograficzna RP-18 oraz
detektor spektrofotometryczny UV-VIS (λ = 254 nm)