BIOSYNTEZA KWASU PIROGRONOWEGO Z GLICEROLU PRZEZ

Acta Sci. Pol., Biotechnologia 12 (4) 2013, 5-14
ISSN 1644–065X (print) ISSN 2083–8654 (on-line)
BIOSYNTEZA KWASU PIROGRONOWEGO
Z GLICEROLU PRZEZ DROŻDŻE
YARROWIA LIPOLYTICA A-101
Krzysztof Cybulski
Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Streszczenie. Porównano parametry produkcji kwasu pirogronowego przez szczep
Yarrowia lipolytica A-10 z kosmetycznego (czystego) i odpadowego glicerolu przy różnym
stosunku węgla do azotu (C:N = 26,8 i 17,9). Wyższe stężenie kwasu pirogronowego uzyskano w hodowli o stosunku C:N = 26,8, w której substratem był glicerol odpadowy. Po 92
godzinach hodowli otrzymano 58,2 g·dm-3 kwasu pirogronowego z wydajnością 0,39 g·g-1
i szybkością objętościową produkcji 0,63 g·dm-3·h-1. Biomasę z tej hodowli odseparowano
od płynu pohodowlanego i analizowano pod kątem zawartości białka oraz wewnątrzkomórkowego tłuszczu. Komórki drożdży Yarrowia lipolytica A-10 były zbudowane w 43,9%
z białka i 10,42% z tłuszczu, w składzie którego dominowały kwasy tłuszczowe nienasycone: linolowy (18:2, 33,94%) i oleinowy (18:1, 30,98%).
Słowa kluczowe: Yarrowia lipolytica, glicerol, kwas pirogronowy, kwas α-ketoglutarowy
WSTĘP
Niekonwencjonalne drożdże z gatunku Yarrowia lipolytica są w ostatnich latach przedmiotem badań wielu ośrodków naukowych w Polsce i na świecie. Te wybitnie tlenowe
drożdże mają bogaty aparat enzymatyczny, który umożliwia komórkom nie tylko przyswajanie zróżnicowanych surowców w charakterze źródła węgla i energii, ale również
wydajną nadprodukcję (produkcję przewyższającą potrzeby metaboliczne komórki)
wielu cennych metabolitów komórkowych. Źródłami węgla dostępnymi dla komórek
drożdży Y. lipolytica są, między innymi, heksozy (glukoza, fruktoza, mannoza), kwasy
organiczne (octowy, mlekowy, cytrynowy), alkohole (etanol, glicerol) oraz związki hydrofobowe (oleje roślinne, kwasy tłuszczowe, n-alkany) [Rodrigues i in. 1997, Flores i in.
2000, Il`chenko i in. 2002, Musiał i in. 2004, Rywińska i in. 2013]. Co więcej, drożdże
© Copyright by Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Adres do korespondencji – Corresponding author: Krzysztof Cybulski, Katedra Biotechnologii
i Mikrobiologii Żywności, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, ul. Chełmońskiego 37/41,
51-630 Wrocław, e-mail: [email protected]
6
K. Cybulski
Y. lipolytica mają status GRAS (Gennerally Recognized As Safe) przyznany przez Agencję Żywności i Leków (FDA, USA), a biomasa tych mikroorganizmów na terenie Unii
Europejskiej może być zagospodarowywana na dodatki do pasz dla zwierząt hodowlanych (wpis katalogowy Europejskiej Federacji Producentów Pasz nr 00 575-EN).
Na przestrzeni kilkunastu ostatnich lat naukowcy opracowali podstawy wielu procesów biosyntezy różnorodnych produktów przy udziale drożdży Y. lipolytica. Wyróżnić
można tutaj produkcję m.in.:
– kwasów organicznych (cytrynowy, pirogronowy, α-ketoglutarowy, bursztynowy)
o bardzo szerokim zastosowaniu w wielu gałęziach przemysłu [Sauer i in. 2008, Zinjarde 2014];
– lipaz (E.C. 3.1.1.3), enzymów stosowanych w produkcji żywności, detergentów i do
oczyszczania wód [Corzo, Rewah 1999, Fickers i in. 2005];
– polioli, m.in. erytrytolu i mannitolu używanych jako niskokaloryczne, naturalne słodziki [Rywińska i in. 2013];
– Single Cell Oil (SCO), otrzymanego mikrobiologicznie oleju, który może znaleźć
zastosowanie jako źródło NNKT w diecie ludzi oraz zwierząt hodowlanych [Kosa,
Ragauskas 2011];
– Single Cell Protein (SCP), otrzymanego mikrobiologicznie białka, stosowanego jako
dodatek białkowy do pasz [Musiał, Rymowicz 2002, Juszczyk i in. 2013];
– związków zapachowych, np. γ-dekalaktonów używanych w przemyśle spożywczym
[Aguedo i in. 2004].
Wykorzystanie drożdży Y. lipolytica w powyższych celach jest szczególnie opłacalne
w aspekcie zagospodarowania produktów odpadowych. Ze względu na zwiększającą się
rokrocznie produkcję biodiesla jednym z najtańszych obecnie produktów odpadowych jest
glicerol. Możliwość wykorzystania tego surowca została podsumowana przez Rywińską
i in. [2013], obejmując biosyntezę większości wymienionych wcześniej produktów.
Celem podjętych badań była ocena wpływu relacji węgla do azotu na wydajność oraz
dynamikę produkcji kwasu pirogronowego przez drożdże Y. lipolytica z glicerolu kosmetycznego (czystego) (98%) oraz odpadowego (83%). Ponadto, zadaniem była również
ocena możliwości wykorzystania biomasy pozostałej po procesie produkcji kwasu pirogronowego na cele paszowe.
MATERIAŁ I METODY BADAŃ
Mikroorganizm. Do badań wykorzystano szczep drożdży Y. lipolytica A-10 o potwierdzonej zdolności do produkcji kwasu pirogronowego z glicerolu [Cybulski i in. 2012].
Szczep drożdży pochodził z kolekcji mikroorganizmów Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Materiał komórkowy
przechowywano na skosach YM w temperaturze 4°C.
Podłoża. Medium inokulacyjnym było gotowe podłoże YNB (Yeast Nitrogen Base)
[Sigma-Aldrich 2012]. Skład podłoża obejmował (g·dm-3): glicerol kosmetyczny – 50;
YNB – 0,67; wodę destylowaną do 1 litra. Podłoże produkcyjne składało się z (g·dm-3):
glicerolu odpadowego – 150; (NH4)2SO4 – 10 lub 15; KH2PO4 – 2; MgSO4·(7H2O) – 1,4;
NaCl – 0,5; Ca(NO3)2·(4H2O) – 0,8; biotyny (40 μg·dm-3); wody wodociągowej do 1 litra.
Podłoża sterylizowano w 121°C przez 20 minut.
Acta Sci. Pol.
Biosynteza kwasu pirogronowego...
7
Substrat. Substratem w hodowlach inokulacyjnych i produkcyjnych był glicerol kosmetyczny (98% w/w, Chempur, Polska). Do produkcji kwasu pirogronowego zastosowano także glicerol odpadowy pochodzący z produkcji biodiesla (Wratislavia Bio, Polska) zawierający 83% (w/w) glicerolu i 7,3% (w/w) NaCl.
Warunki hodowli. Namnażanie biomasy w hodowlach inokulacyjnych prowadzone
było w kolbach Erlenmeyera o pojemności 300 cm3 przy objętości podłoża 100 cm3.
Drożdże hodowano na wstrząsarce rotacyjnej typu Certomat IS (Sartorius Stedim, Niemcy) przy obrotach 140 rpm, w temperaturze 30°C przez 72 godziny. Podłoże produkcyjne
zaszczepiano 200 cm3 hodowli inokulacyjnej, aby uzyskać końcową roboczą objętość
podłoża równą 2 dm3. Hodowle produkcyjne prowadzone były w bioreaktorze Biostat
B+ (Sartorius, Niemcy) o objętości całkowitej 5 dm3, w stałych warunkach – temperatura
30°C, napowietrzanie 0,6 vvm, szybkość obrotów mieszadła 800 rpm. Odczyn podłoża
(pH 3,5) był utrzymywany automatycznie poprzez dodatek 40% NaOH.
Metody analityczne. Pobrane w trakcie hodowli próbki o objętości 10 cm3 odwirowywano w temperaturze pokojowej przy 5000 rpm przez 5 minut. Biomasę oznaczano metodą wagową – separowano na filtrze membranowym Millipore o porowatości
0,45 μm, przemywano wodą destylowaną i dosuszano do stałej masy w temperaturze
105°C. Stężenie glicerolu, kwasu pirogronowego i α-ketoglutarowego w supernatancie
oznaczano metodą wysoko sprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Analizy prowadzono w temperaturze 65°C na kolumnie HyperRez Xp carbohydrate H+ (Dionex, Ultimate 3000 Series) podłączonej do detektorów UV i RI. Przepływ fazy ciekłej (25 mM
TFA – kwas trifluorooctowy) wynosił 0,6 cm3·min-1. Tłuszcz wewnątrzkomórkowy oznaczano metodą wagową po ekstrakcji biomasy drożdży metodą Bligh i Dyer [Kates 1972],
fazę chloroformową odparowywano pod próżnią i suszono do stałej masy w naczynkach
wagowych w 105°C. Skład kwasów tłuszczowych w tłuszczu wewnątrzkomórkowym
oznaczano, stosując chromatografię gazową, zgodnie z metodologią przedstawioną przez
Kitę i in. [2007]. Zawartość białka w biomasie drożdży oznaczano metodą Kjeldahla.
SPIS UŻYTYCH SYMBOLI
PA – kwas pirogronowy – pyruvic acid
KGA – kwas α-ketoglutarowy – α-ketoglutaric acid
FA – kwasy tłuszczowe – fatty acids
QPA – objętościowa szybkość produkcji kwasu pirogronowego
volumetric pyruvic acid production rate (g·dm-3h-1)
YPA – wydajność całkowita produkcji kwasu pirogronowego
total yield of pyruvic acid (g·g-1)
X – stężenie biomasy drożdży – yeast cells concentration (g·dm-3)
OMÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW
Produkcja kwasu pirogronowego
Kwas pirogronowy (PA) jest końcowym produktem glikolizy powstającym bezpośrednio z aldehydu 3-fosfoglicerynowego. Może on być następnie przekształcany w procesie
Biotechnologia 12 (4) 2013
8
K. Cybulski
dekarboksylacji w acetylo-CoA i włączany do cyklu Krebsa. Odpowiednia manipulacja
stężeniem m.in. tiaminy, źródła węgla i azotu może przekierować metabolizm drożdży
Y. lipolytica na nadprodukcję i pozakomórkowe wydzielanie kwasu α-ketoglutarowego
(KGA) i PA. Warunkiem koniecznym do nadprodukcji tych kwasów jest nadmiar źródła węgla i azotu oraz limitujące wzrost drożdży stężenie tiaminy. W prezentowanych
badaniach źródłem węgla było 150 g·dm-3 gliceryny, natomiast stężenie tiaminy w podłożu produkcyjnym wynosiło 4 μg·dm-3. Przeprowadzono cztery procesy produkcyjne,
w których zastosowano czysty i odpadowy glicerol, a stosunek węgla do azotu wynosił
26,8 i 17,9. Wszystkie hodowle prowadzono do momentu całkowitego wykorzystania
substratu.
W stacjonarnej fazie wzrostu hodowli, w których stosowano 10 g·dm-3 siarczanu amonu, czyli przy stosunku C:N wynoszącym 26,8, poziom biomasy komórkowej wynosił
11,7 i 14,3 g·dm-3, odpowiednio w przypadku gliceryny kosmetycznej i odpadowej (rys.
1A, B). Wyższe stężenie biomasy w hodowli z użyciem glicerolu odpadowego wynikało z obecności w tym substracie niewielkich ilości składników odżywczych, prawdopodobnie witamin lub soli mineralnych. Obecność i stężenie tych substancji w glicerolu
odpadowym zależą od wielu czynników, wśród których wymienić można m.in. rodzaj
substratu do produkcji biodiesla czy zastosowaną technologię produkcji [Thompson, He
2006]. Zmniejszenie stosunku C:N uzyskane poprzez zwiększenie ilości siarczanu amonu w podłożu produkcyjnym miało wpływ na stężenie biomasy drożdży podczas procesu biosyntezy PA. Poziom biomasy w hodowlach prowadzonych przy C:N = 17,9 był
wyższy i wynosił, odpowiednio dla glicerolu kosmetycznego i odpadowego, 14,3 i 16,8
g·dm-3 (tab. 1).
Wpływ stosunku C:N na całkowity czas procesu produkcji PA zależał od użytego
substratu. W przypadku zastosowania glicerolu kosmetycznego czas biosyntezy został
skrócony o 11 godzin (ze 112 do 101 godz.) poprzez obniżenie wskaźnika C:N. Natomiast w hodowlach, w których źródłem węgla był glicerol odpadowy, obniżenie stosunku
C:N skutkowało efektem odwrotnym. Czas całkowitej utylizacji substratu wydłużył się
z 92 do 117,5 godz. (tab. 1, rys. 1A, B).
Tabela 1. Wpływ stosunku C:N na stężenie biomasy drożdży Y. lipolytica A-10 oraz produkcję
kwasu pirogronowego i α-ketoglutarowego z glicerolu kosmetycznego i odpadowego
Table 1. Influence of C:N ratio on Y. lipolytica A-10 biomass concentration and production of
pyruvic and α-ketoglutaric acids from pure and crude glycerol
Stosunek C:N
C:N ratio
Czas [h]
Time
X
[g·dm-3]
PA
[g·dm-3]
KGA
[g·dm-3]
PA:KGA
YPA
[g·g-1]
QPA
[g·dm-3·h-1]
Glicerol kosmetyczny – Pure glycerol
26,8
112
11,7
40,3
24,8
1,7
0,27
0,36
17,9
101
14,3
41,0
29,0
1,4
0,27
0,41
Glicerol odpadowy – Crude glycerol
26,8
92
14,3
58,2
23,6
2,5
0,39
0,63
17,9
117,5
16,8
38,5
27,5
1,4
0,26
0,33
Acta Sci. Pol.
Biosynteza kwasu pirogronowego...
9
Rys. 1. Produkcja biomasy (X), kwasu pirogronowego (PA), kwasu α-ketoglutarowego (KGA)
oraz zużycie glicerolu (GLY) przez Y. lipolytica A-10 w hodowlach okresowych. A – substrat – glicerol kosmetyczny. B –substrat – glicerol odpadowy. Białe znaczniki – hodowle
o stosunku C:N = 26,8. Czarne znaczniki – hodowle o stosunku C:N = 17,9
Fig. 1. Biomass (X), pyruvic acid (PA), α-ketoglutaric
-ketoglutaric acid (KGA) production and uptake of glycerol (GLY) during batch culture of Y. lipolytica A-10. A – substrate – pure glycerol. B – substrate – crude glycerol. White marks – C:N ratio = 26.8. Black marks – C:N ratio = 17.9
Obniżenie stosunku C:N z 26,8 na 17,9 było również przyczyną wymiernych różnic w ilościach i proporcjach wyprodukowanych ketokwasów. Stosunek rozpatrywanych
pierwiastków biogennych (C:N) miał niewielki wpływ na wynik hodowli, w których substratem był glicerol kosmetyczny. W hodowli z 15 g·dm-3 siarczanu amonu produkcja PA
była zbliżona do wyniku uzyskanego w procesie, w którym dodawano 10 g·dm-3 źródła
azotu. Zawartość niepożądanego KGA wzrosła natomiast o 4,2 g·dm-3 w stosunku do
hodowli z 10 g·dm-3 siarczanu amonu. Tym samym, stosunek wyprodukowanych ketokwasów (PA:KGA) uległ obniżeniu na niekorzyść PA, z 1,7 do 1,4. Wydajność produkcji
PA w hodowlach z glicerolem kosmetycznym (0,27 g·g-1) była nieco wyższa niż w przypadku opatentowanego procesu produkcji tego kwasu z użyciem drożdży Candida maltoza. Substratem w przytoczonym procesie był kwas propionowy, źródłem azotu siarczan
Biotechnologia 12 (4) 2013
10
K. Cybulski
amonu lub azotan (III) amonu, a drożdże wyprodukowały podczas hodowli wstrząsanej
2,2 g·dm-3 PA z wydajnością 0,22 g·g-1 [Uchio i in. 1974]. Zaskakujące okazały się wyniki
hodowli z glicerolem odpadowym. Przy stosunku C:N równym 26,8 drożdże wyprodukowały 58,2 g·dm-3 PA z wydajnością 0,39 g·g-1, co było najlepszym wynikiem otrzymanym podczas przeprowadzonych badań. Wydajność produkcji PA na tym poziomie jest
porównywalna z wynikami otrzymanymi przez Hua i Shimizu [1999]. Badacze uzyskali
42 g·dm-3 PA z wydajnością 0,45 g·g-1 z glukozy przy użyciu szczepu Torulopsis glabrata IFO 0005. Warto podkreślić, iż drożdże te reprezentowały fenotyp B1-Bio-B6-NA-, co
oznacza, że szczep jest auksotrofem w stosunku do aż 4 witamin, a dodatkowo ich komórki nie przyswajają mineralnych form azotu, co znacznie podwyższa koszty produkcji
PA. Przy obniżonym stosunku węgla do azotu (C:N = 17,9) drożdże Y. lipolytica A-10
wyprodukowały tylko 38,5 g·dm-3 PA z glicerolu odpadowego. W przypadku tego substratu wraz z obniżeniem stosunku C:N wzrosła również zawartość niepożądanego KGA
z 23,6 do 27,5 g·dm-3. Inhibicja produkcji PA pod wpływem zwiększonej ilości siarczanu amonu w podłożu przełożyła się na obniżenie szybkości objętościowej produkcji PA
z 0,63 do 0,33 g·dm-3·h-1 (tab. 1).
Charakterystyka biomasy drożdży
Biomasę drożdży po hodowli w podłożu z glicerolem odpadowym (stosunek C:N = 26,8)
odwirowano od płynu pohodowlanego, wysuszono w temperaturze pokojowej, dosuszono do stałej wagi w temperaturze 105°C i poddano analizom pod kątem oznaczenia ilości
białka i wewnątrzkomórkowego tłuszczu oraz profilu kwasów tłuszczowych.
Biomasa drożdży Y. lipolytica ma zastosowanie jako dodatek białkowy do pasz dla
zwierząt hodowlanych i została dopuszczona do obrotu na terenie Unii Europejskiej przez
Europejską Federację Producentów Pasz. Polskie przepisy określają jednoznacznie, iż suszone preparaty drożdży powinny charakteryzować się zawartością białka w granicach od
40 do 52% w przeliczeniu na suchą masę [PN-81/A-79006]. Otrzymany metodą Kjeldahla
wynik zawartości białka w biomasie Y. lipolytica A-10 wynosił 43,9% (tab. 2) i był o ponad 5% wyższy niż w przypadku wcześniej uzyskanych wyników [Cybulski i in. 2012].
Ten znaczący wzrost ilości białka mógł być spowodowany kilkoma czynnikami, wśród
których wymienić można rodzaj zastosowanego glicerolu odpadowego oraz dodatek
40 μg·dm-3 biotyny. Podobne stężenie białka (42–45%) w biomasie Y. lipolytica namnożonej w podłożu z glicerolem odpadowym zostało oznaczone przez Juszczyka i in. [2013].
Tabela 2. Zawartość białka, tłuszczu oraz profil kwasów tłuszczowych w biomasie drożdży Y. lipolytica A-10 uzyskanej po hodowli okresowej z glicerolem odpadowym (C:N 26,8)
Table 2. Content of protein, intracellular fat and fatty acid profile of Y. lipolytica A-10 biomass
obtained in batch culture supplemented with crude glycerol (C:N ratio 26.8)
Białko Tłuszcz
Protein
Fat
[%]
[%]
43,90
10,42
Kwas
tłuszczowy 14:0
Fatty acid
udział w sumie kwasów
tłuszczowych
0,48
[%]
% of total
fatty acids
16:0
17:0
18:0
16:1
n7
18:1
n7
16:1
n9
18:1
n9
18:2
n6
18:3
n3
18,58
0,31
4,86
5,21
0,98
1,17
30,98 33,94
2,76
Acta Sci. Pol.
11
Biosynteza kwasu pirogronowego...
Kwasy tłuszczowe
Fatty acid
[%]
nasycone ogółem
saturated
nienasycone ogółem
unsaturated
jednonienasycone
mono-unsaturated
dwunienasycone
di-unsaturated
trójnienasycone
tri-unsaturated
Rys. 2. Procentowa zawartość kwasów tłuszczowych w wewnątrzkomórkowym tłuszczu drożdży
Y. lipolytica A-10
Fig. 2. The percentage of fatty acids in the intracellular lipids of Y. lipolytica A-10
Cennym składnikiem biomasy drożdżowej jest również wewnątrzkomórkowy tłuszcz
(SCO), mogący w przyszłości stanowić alternatywę dla użycia konwencjonalnych źródeł tłuszczów w skarmianiu zwierząt. O wartości żywieniowej SCO decyduje nie tylko
jego ilość w komórkach drożdży, ale również skład kwasów tłuszczowych (FA). Biomasa
Y. lipolytica A-10 uzyskana po procesie produkcji PA z glicerolu odpadowego charakteryzowała się zawartością wewnątrzkomórkowego tłuszczu na poziomie 10,42% w przeliczeniu na suchą masę. Musiał i in. [2003] oznaczyli nieco niższą zawartość tłuszczu
w biomasie drożdży Y. lipolytica – 8,9%, jednakże substratem w tym procesie był olej
rzepakowy. Przy zastosowaniu glicerolu odpadowego jako źródła węgla i energii w procesie produkcji biomasy drożdżowej Juszczyk i in. [2013] otrzymali od 6,5 do 11,1%
tłuszczu wewnątrzkomórkowego, co zależało od użytego szczepu drożdży Y. lipolytica.
Wobec tego otrzymane 10,42% tłuszczu wydaje się być wynikiem bardzo dobrym. Wyekstrahowany chloroformem tłuszcz został poddany analizie pod kątem zawartości poszczególnych kwasów tłuszczowych. Wyniki tego eksperymentu zostały podsumowane
w tabeli 2. FA, których stężenie nie przekraczało 0,3% całkowitej sumy kwasów, zostały
pominięte, a wśród nich wyróżnić można było m.in. kwas kaprylowy (8:0), kaprynowy
(10:0), pentadekanowy (15:0) i arachidowy (20:0). Ogólna procentowa zawartość FA
z podziałem ze względu na ich stopień nasycenia została przedstawiona na rysunku 2.
Nienasycone kwasy tłuszczowe stanowiły aż 75,1% ogólnej sumy FA – w tym 38,4 i 33,9%
to kwasy, odpowiednio, jedno- i dwunienasycone. Proporcje pomiędzy poszczególnymi
FA zawartymi w biomasie drożdży zależą przede wszystkim od użytego substratu i składu
pożywki hodowlanej. Przeważającymi w komórkach drożdży Y. lipolytica A-10 kwasami
tłuszczowymi były kwasy nienasycone – linolowy (18:2, 33,9%), występujący w przyrodzie w oleju słonecznikowym i lnianym oraz oleinowy (18:1, 31%), spotykany głównie
w oliwie z oliwek i tranie. Wśród kwasów nasyconych dominował natomiast kwas palmitynowy (16:0, 18,6%). Wysoka zawartość nienasyconych FA jest związana z użyciem gliBiotechnologia 12 (4) 2013
12
K. Cybulski
cerolu jako substratu, co zostało wykazane w badaniach Papanikolaou i in. [2002]. Szczególnie interesująca jest bardzo wysoka ilość kwasu linolowego. Zarówno w badaniach
Juszczyka i in. [2013], jak i Papanikolau i in. [2002] zawartość tego kwasu w ogólnej puli
FA nie przekroczyła 25%. Porównując, drożdże Y. lipolytica LGAM S(7)I namnożone na
podłożu z glicerolem technicznym zawierały głównie kwasy: oleinowy 45%, linolenowy
(18:3) 20% i palmitynowy 15% [Papanikolaou, Aggelis 2002]. Zupełnie odmienny skład
kwasów tłuszczowych stwierdzono u drożdży Candida lipolytica wyrosłych na podłożu
z metanolem. W ich składzie dominowały kwasy nasycone (71,8–76,6%), w tym kwas
palmitynowy (45,8–56%) i stearynowy (18:0, 20,6–25,9%) [Iwanny, Rashad 1984].
PODSUMOWANIE
Przeprowadzone w niniejszej pracy badania wykazały, że na produkcję kwasu pirogronowego wpływ ma zarówno rodzaj zastosowanego glicerolu, jak i stosunek C:N. Uzyskane
wyniki świadczą o dużym potencjale drożdży Y. lipolytica A-10 w produkcji kwasu pirogronowego z glicerolu odpadowego. Przy stosunku C:N wynoszącym 26,8 szczep produkował 58,2 g·dm-3 tego kwasu z wydajnością 0,39 g·g-1. Niezależnie od zastosowanego
substratu niższy stosunek C:N (17,9) predysponował komórki drożdży do wzmożonej
produkcji KGA, którego ilość była średnio o 4 g·dm-3 wyższa w porównaniu z hodowlami, w których C:N wynosił 26,8.
Badania wykazały również, że biomasa drożdży uzyskana po procesie biosyntezy
kwasu pirogronowego może być cennym produktem, ponieważ charakteryzowała się
znaczną zawartością białka i tłuszczu na poziomie, odpowiednio, 43,9 i 10,42% w suchej
masie. W puli kwasów tłuszczowych dominowały kwasy nienasycone, głównie kwas linolowy (33,94%) i oleinowy (30,98%). Zgodnie z regulacjami prawnymi Polski i Unii
Europejskiej biomasa o takich właściwościach może zostać wykorzystana jako dodatek
białkowy do pasz dla zwierząt hodowlanych.
PIŚMIENNICTWO
Aguedo M., Wache Y., Coste F., Husson F., Belin J-M., 2004. Impact of surfactants on the biotransformation of methyl ricionoleate into γ-decalactone by Yarrowia lipolytica. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 29, 31–36.
Corzo G., Revah S., 1999. Production and characteristics of the lipase from Yarrowia lipolytica
681. Bioresource Technol.,70, 173–180.
Cybulski K., Tomaszewska L., Rywińska A., 2012. Dobór podłoża inokulacyjnego do produkcji
ketokwasów przez drożdże Yarrowia lipolytica. Biotechnologia, ACTA Scient. Polon. Biotechnol., 11(3), 5–14.
Fickers P., Fudalej F., Nicaud J.M., Destain J., Thonart P., 2005. Selection of new over-producing
derivatives for the improvement of extracellular lipase production by the non-conventional
yeast Yarrowia lipolytica. Journal of Biotechnology, 115, 379–386.
Flores C.L., Rodriguez C., Petit T., Gancedo C., 2000. Carbohydrate and energy yielding metabolism in non-conventional yeasts. FEMS Microbiology Reviews, 24, 507–529.
Hua Q., Shimizu K., 1999. Effect of dissolved oxygen concentration on intracelluar flux distribution for pyruvate fermentation. J. Biotechnol., 68, 135–147.
Acta Sci. Pol.
Biosynteza kwasu pirogronowego...
13
Il’chenko A.P., Chernyavskaya O.G., Shishkanova N.V., Finogenova T.V., 2002. Metabolism of Yarrowia lipolytica grown on ethanol under conditions promoting the production of α-ketoglutaric
and citric acids: a comparative study of the central metabolism enzymes. Microbiology, 71(3),
269–274.
Iwanny E.W., Rashad M.M., 1984. Lipid contens and fatty acid composition from Candida lipolytica and Pichia guilliermondii grown on methanol. Egypt. J. Food Sci., 12(1–2), 21–28.
Juszczyk P., Tomaszewska L., Kita A., Rymowicz W., 2013. Biomass production by novel strains of
Yarrowia lipolytica using raw glycerol, derived from biodiesel production. Bioresource Technology, 137, 124–131.
Kates M., 1972. Techniques of lipidology: isolation, analysis and identification of lipids. Lab. Tech.
Biochem. Mol., (ed.) T.S. Work and E. Work, Amsterdam.
Kita A., Lisinska G., Gołubowska G., 2007. The effect of oils and frying temperatures on the textures and fat content of potato crisps. Food Chem., 102, 1–5.
Kosa M., Ragauskas A.J., 2011. Lipids from heterotrophic microbes: advances in metabolism research. Trends in Biotechnology, 29, 53–61.
Musiał I., Rymowicz W., 2002. Charakterystyka produkcji single-cell-biomass z oleju rzepakowego
w różnych systemach hodowlanych. Inżynieria i Aparatura Chemiczna, 3, 108–109.
Musiał I., Rymowicz W., Kramkowski R., 2003. Charakterystyka drożdży paszowych Yarrowia
lipolytica suszonych metodą rozpyłową. ACTA Scient. Polon. Biotechnol., 2(1–2), 41–49.
Musiał I., Rymowicz W., Kita A., 2004. Produkcja biomasy drożdży Yarrowia lipolytica z tłuszczów
odpadowych po smażeniu produktów przekąskowych. Biotechnologia, ACTA Scient. Polon.
Biotechnol., 3(1–2), 75–83.
Papanikolaou S., Aggelis G., 2002. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial
glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresour. Technol., 82(1), 43–49.
Papanikolaou S., Chevalot I., Komaitis M., Marc I., Aggelis G., 2002. Single cell oil production
by Yarrowia lipolytica growing on an industrial derative of animal fat in batch cultures. Appl.
Microbiol. Biotechnol., 58, 308–312.
PN-81/A-79006, Drożdże paszowe suszone.
Rodrigues G., Pais C., 1997. The influence of acetic and other weak carboxylic acids on growth
and cellular death of the yeast Yarrowia lipolytica. Food Technology and Biotechnology, 38,
27–32.
Rywińska A., Juszczyk P., Wojtatowicz M., Robak M., Lazar Z., Tomaszewska L., Rymowicz W.,
2013. Glycerol as a promising substrate for Yarrowia lipolytica biotechnological applications.
Biomass and Bioenergy, 146–166.
Sauer M., Porro D., Mattanovich D. and Branduardi P., 2008. Microbial production of organic acids: expanding the markets. Trends Biotechnol., 26, 100–108.
Sigma-Aldrich Product Information [online]. Sigma-Aldrich 2012, dostępny w Internecie:http://
www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/y0626pis.
Par.0001.File.tmp/y0626pis.pdf
Thompson J.C., He B.B., 2006. Characterization of crude glycerol from biodiesel production from
multiple feedstocks. Appl. Eng. Agric., 22, 261–265.
Uchio R., Maeyashiki I., Okada H., 1974. Fermentative production of pyruvic acid. JP patent
74102894.
Zinjarde S.S., 2014. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chemistry, 152, 1–10.
Biotechnologia 12 (4) 2013
14
K. Cybulski
BIOSYNTHESIS OF PYRUVIC ACID FROM GLYCEROL BY YARROWIA
LIPOLYTICA YEAST
Abstract. The parameters of pyruvic acid production by Yarrowia lipolytica A-10 strain
from pure and crude glycerol at different C:N ratio (26.8 and 17.9) were compared. The
highest pyruvic acid concentration was achieved in culture with C:N ratio 26.8, using crude
glycerol as a substrate. After 92 hours of cultivation yeast produced 58.2 g·dm-3 of pyruvic
acid with yield 0.39 g·g-1 and volumetric production rate 0.63 g·dm-3·h-1. Biomass from this
process was separated from cultivation medium and determined for quantity of protein and
intracellular fat. Cells of Yarrowia lipolytica A-10 were composed of 43.9% of protein and
10.42% of fat, in which unsaturated acids represented the majority of total fatty acids (linoleic acid, 18:2 – 33.94% and oleic acid, 18:1 – 30.98%).
Key words: Yarrowia lipolytica, glycerol, pyruvic acid, α-ketoglutaric acid
Zaakceptowano do druku – Accepted for print: 30.12.2013
Do cytowania – For citation: Cybulski K., 2013. Biosynteza kwasu pirogronowego
z glicerolu przez drożdże Yarrowia Lipolytica A-10. Acta Sci. Pol. Biotechnol., 12 (4),
5–14.
Acta Sci. Pol.