Biodegradacja keratyny

Kierunek Biotechnologia – Biotechnologia w utylizacji odpadów stałych od 2014
Biodegradacja keratyny
Białka można degradować do niskocząsteczkowych peptydów lub aminokwasów zarówno na drodze hydrolizy kwasowej,
przebiegającej w drastycznych warunkach (stężony HCl, temperatura powyżej 100oC), jak i na drodze hydrolizy enzymatycznej,
pozwalającej na przebieg procesu w znacznie łagodniejszych warunkach pH i temperatury. Enzymy proteolityczne tzw. hydrolazy
peptydowe rozszczepiają wiązania peptydowe w białkach z przyłączeniem cząsteczki wody. Z ekonomicznego punktu widzenia są
one najważniejszymi enzymami przemysłowymi.
Do drobnoustrojów produkujących wykorzystywane w przemyśle enzymy proteolityczne należą głównie bakterie rodzaju Bacillus,
bakterie mlekowe (m. in. Lactobacillus, Leuconostoc), promieniowce (Streptomyces) i grzyby rodzajów: Mucor, Aspergillus i
Penicillium.
Spośród enzymów proteolitycznych, dominującą rolę zarówno pod względem wartości produkcji jak i zastosowania, odgrywają
proteinazy serynowe Bacillus subtilis, zwane popularnie proteinazami zasadowymi, ze względu na optymalne pH działania,
przypadające w zakresie pH 10. Proteinazy serynowe są enzymami o bardzo szerokiej specyficzności substratowej,
rozszczepiającymi wiązania peptydowe w białkach i niskocząsteczkowych peptydach. Ta szeroka specyficzność sprawia, że
proteinazy serynowe służą również do otrzymywania hydrolizatów białkowych w przemyśle spożywczym, paszowym,
kosmetycznym i farmaceutycznym.
Keratyny
Keratyny są białkami włókienkowymi o złożonej budowie strukturalnej, którą wzmacniają liczne sieciujące wiązania S-S. Są
nierozpuszczalne w roztworach wodnych z racji na ich charakter hydrofobowy. Na skutek tego wykazują wysoką oporność na
utylizację, w tym również na hydrolizę przez większość enzymów proteolitycznych pochodzenia roślinnego i zwierzęcego takich
jak trypsyna czy papaina. Białka zaliczane do keratyn są podstawowym budulcem cytoszkieletu i wyrostków skóry kręgowców:
włosów, pierza, kopyt, szczeciny, wełny, paznokci. Generacja dużych ilości odpadów keratynowych i jej kumulacja w środowisku
naturalnym wynika z niedostępności dla drobnoustrojów i enzymów białek keratynowych, które stanowią około 90% masy tych
struktur. Aminokwasy budujące keratyny mają w 40% charakter hydrofilowy oraz w 60% hydrofobowy. W sekwencji aminokwasów
duży udział ma cystyna, odpowiedzialna za wysoką liczbę wiązań disiarczkowych (S-S). W keratynie piór stanowi ona 7% wszystkich
aminokwasów i jej ilość jest 2,5 razy wyższa w stosunku do keratyn naskórka, rogów i paznokci.
Sposoby degradacji keratyny
W metodach degradacji keratyny wykorzystuje się wysoką temperaturę, działanie kwasów oraz zasad, a także enzymów.
Degradacja pod wpływem temperatury. Keratyna ulega degradacji pod wpływem temperatury do oligomerów, polipeptydów i
aminokwasów. Ogrzewanie w temperaturze 130-140oC w środowisku wodnym prowadzi do przemian struktury keratyny. Rozkład
aminokwasów następuje w temperaturze około 200oC. W strukturze włókien można zauważyć zmiany już w temperaturze 185oC
i czasie ogrzewania 30 s. Najbardziej stabilna jest ona w punkcie izoelektrycznym przy pH = 4,9.
Degradacja pod wpływem kwasów. Włókna białkowe ulegają degradacji pod wpływem kwasów mineralnych. Na stopień
degradacji wpływa temperatura, pH, czas reakcji oraz rodzaj stosowanych kwasów. Występuje tutaj degradacja wiązań
peptydowych. Roztwór powstały podczas degradacji kwasowej keratyny składa się z soli amoniowych oraz wolnych aminokwasów.
W wyniku hydrolizy wiązań peptydowych dochodzi do obniżenia mas cząsteczkowych oraz uwolnienia grup końcowych
aminokwasów białkowych.
Degradacja pod wpływem zasad. W wyniku działania zasad na keratynę następuje jej pęcznienie i degradacja. Keratyna jest
bowiem mniej odporna na działanie zasad niż kwasów. Rozerwanie wiązań peptydowych i disiarczkowych powoduje wzrost
rozpuszczalności keratyn w zasadach. Rozpuszczalność ta zależy od: stężenia zasady, temperatury procesu oraz czasu
oddziaływania. Pod wpływem działania zasady następuje wzrost plastyczności i spadek wytrzymałości keratyny.
Degradacja enzymatyczna. Włókna białkowe ulegają uszkodzeniu w wyniku działania organizmów żywych (bakterie, pleśnie,
drożdże, algi). Działanie organizmów na keratynę prowadzi do jej całkowitej biodegradacji spowodowanej enzymatyczną hydrolizą
i utlenieniem. U bakterii proces przebiega w trzech etapach. W pierwszym następuje redukcja siarki z mostków S-S cystyny za
pomocą reduktaz, w kolejnym przebiega proteoliza, a w końcowym zachodzi deaminacja peptydów i utlenienia grup S-H.
Szczególnie ważne są bakterie z rodzaju Bacillus, np.: B. subtilis, B. licheniformis, Lysobacer, Microbacterium. Mniejszy udział maja
bakterie gramujemne: Vibrio, Xanthomonas.
Keratynazy są szeroko rozpowszechnioną grupą metalo- lub serynoproteaz, które mają przeważnie charakter pozakomórkowy.
Porównanie właściwości keratynaz do innych proteaz wskazuje na ich przynależność do enzymów z grupy sublizyn, z uwagi na
budowę centrum katalitycznego oraz ich działanie w odczynie od neutralnego do alkalicznego, z optymalnym pH 7,5-9,0.
Mikroorganizmy są zdolne do wytwarzania enzymów keratynolitycznych na drodze indukcji substratowej w obecności surowców
keratynowych (wełna, rogi, włosy, pióra), wykorzystując je jako źródło węgla i azotu. Cukry proste takie jak glukoza mogą hamować
wydzielanie keratynaz poprzez represje kataboliczną.
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest wyznaczenie kinetyki rozkładu keratyny (lub kazeiny) przez enzymy proteolityczne bakterii z rodzaju Bacillus.
Wykonanie ćwiczenia
1.
Odczynniki używane w doświadczeniu:
1.1. 0,1 M bufor Tris-HCl o pH 8,6
1.2. bufor fosforanowy o pH 8,6
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Kierunek Biotechnologia – Biotechnologia w utylizacji odpadów stałych od 2014
Biodegradacja keratyny
2.
3.
4.
5.
6.
1.3. 7,5% roztwór kwasu trichlorooctowego (TCA)
1.4. 0,5 M roztwór NaOH
1.5. Odczynnik Folina rozcieńczony w wodzie, w proporcji 1: 2
1.6. Odczynnik Bradforda
1.7. Preparaty enzymu proteolitycznego: 10 mg proteazy rozpuszczono w 10 ml buforu Tris-HCl o pH 8,6
1.8. Keratyna w formie hydrolizatu z wełny owczej (lub kazeina izolowana ze ścieków mleczarskich)
1.9. 1 mM roztwór tyrozyny
Przeprowadzenie hydrolizy keratyny
2.1. Probówkę zawierającą 2 ml roztworu keratyny i 6 ml buforu fosforanowego o pH 8,6 umieszczamy w łaźni wodnej o
temperaturze 37oC, okresowo mieszając.
2.2. Po 5 minutach do kolbki wprowadzamy 2 ml enzymu proteolitycznego.
2.3. Po 0, 10, 20 i 30 minutach od momentu rozpoczęcia hydrolizy (dodania enzymu do roztworu keratyny) pobierać po 1 ml
mieszaniny reakcyjnej do probówki celem wykonania oznaczenia z odczynnikiem Bradforda lub Folina – konsultacja z
prowadzącym (przed pobraniem probówkę zamieszać)
Wykonanie oznaczenia odczynnikiem Folina
Enzymy proteolityczne (proteazy) uwalniają z białek krótkie peptydy, rozpuszczalne w roztworze kwasu TCA, które
oznacza się ilościowo w reakcji z odczynnikiem Folina.
3.1. Do 1 ml mieszaniny reakcyjnej pobranej w czasie t należy dodać 2 ml 7,5% roztworu TCA, służącego do odbiałczania
roztworu. Całość dokładnie wymieszać i odwirować 6000 rpm; 5 minut.
3.2. Odmierzyć po 1 ml klarownego przesączu/supernatantu i dodać 2 ml 0,5 M NaOH i 0,6 ml odczynnika Folina.
3.3. Szybko, dokładnie wymieszać zawartość probówki i po 10 minutach odczytać absorbancję wobec próby kontrolnej (która
zawierała 1 ml wody zamiast przesączu mieszaniny reakcyjnej) przy długości fali 670 nm.
Wykonanie oznaczenia metoda Bradforda
4.1. Do 1 ml mieszaniny reakcyjnej pobranej w czasie t należy dodać 2 ml 7,5% roztworu TCA, służącego do odbiałczania
roztworu. Całość dokładnie wymieszać i odwirować 6000 rpm; 5 minut).
4.2. Odmierzyć po 1 ml klarownego przesączu/supernatantu i dodać 2 ml odczynnika Bradforda Równocześnie przygotować
próbę kontrolną z woda destylowaną. Po wymieszaniu i upływie 10 minut dokonać pomiaru absorbancji w
spektrofotometrze, przy długości fali 595 nm, wobec próby kontrolnej.
Wykonanie krzywej wzorcowej tyrozyny
5.1. Do 6 probówek wprowadzić roztwór tyrozyny i buforu fosforanowego według tabeli, całość wymieszać:
Nr probówki
Ilość roztworu tyrozyny
Ilość buforu fosforanowego Stężenie tyrozyny [µM/l]
1
0,0
10,0
0
2
1,0
9,0
100
3
2,0
8,0
200
4
4,0
6,0
400
5
6,0
4,0
600
6
8,0
2,0
800
5.2. Do kolejnych 6 probówek pobrać po 1 ml przygotowanych roztworów tyrozyny i buforu, dodać 2 ml TCA, dokładnie
wymieszać i odwirować 6000 rpm/5 minut.
5.3. Dokonać pomiaru stężenia białka z odczynnikiem Folina lub metodą Bradforda (konsultacja z prowadzącym).
Opracowanie wyników
6.1. Wykreślić krzywą wzorcową zależności absorbancji od stężenia tyrozyny z roztworze.
6.2. Znając wartość absorbancji enzymu w czasie t hydrolizy keratyny, z krzywej wzorcowej odczytać stężenie tyrozyny St.
6.3. Wyznaczyć aktywność enzymu, przyjmując jako jednostkę aktywności (JAA) ilość tyrozyny (µM) uwolnionej przez 1 mg
enzymu podczas 1 minutowej hydrolizy białka:
𝑆𝑡 ∙ 2,5
JAA =
𝑡
gdzie:
St – stężenie tyrozyny odczytane z krzywej wzorcowej µM/l])
t – czas inkubacji
6.4. Wyznaczyć zależność JAA – f(czas) dla użytego enzymu.
7. Literatura
- Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; 1998
- Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna I i II tom; Wyd. Politechniki Łódzkiej; 2000
- Klimiuk E., Łebkowska M., Biotechnologia w ochronie środowiska. PWN, 2008.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba