Keratyna

Izolacja i analiza keratyny
1.Izolacja:
Materiały i odczynniki:
250 mg włosów przemytych etanolem
Chloroform
Metanol
Roztwór: 25mM Tris/HCl pH 8,5, 5M Mocznik, 25mM 2-merkaptoetanol
Instrukcja:
1.250 mg włosów przemytych etanolem umieścić w kolbie, zalać mieszaniną
chloroform:metanol 2:1 (v/v) i pozostawić na 7dni.
2. 200 mg tak przygotowanych włosów umieścić w naczyniu mikrofalowym i dodać 5 ml
roztworu zawierającego 25mM Tris/HCl pH 8,5, 5M mocznik, 25mM 2-merkaptoetanol.
3. Mieszaninę ogrzewać w reaktorze mikrofalowym przez 20 min w temp. 85oC.
4.Ochłodzić i przesączyć.
5.Przesącz wirować przez 20 min w temp. pokojowej.
6. Supernatant pozostawić do analizy.
2. Identyfikacja:
Identyfikacja keratyny nastąpi na zajęciach razem z identyfikacją kolagenu.
Materiały i odczynniki:
Wyizolowana keratyna
Marker
4x Bufor obciążający
10x bufor elektrodowy
Żel poliakrylamidowy 15%
Coomassie Blue G-250
Roztwór odbarwiający
Instrukcja:
1.Pobrać 9 μl próbki i dodać 3 μl 4x buforu obciążającego.
2. Umieścić próbki w termobloku rozgrzanym wcześniej do 95 oC na 5 min., zwortexować i
zwirować.
3.Przygotować 300ml 1x bufor elektrodowy poprzez rozcieńczenie 10x buforu elektrodowego
wodą destylowaną w stosunku 1:10.
4. Przygotować żel poliakrylamidowy usuwając grzebień do formowania studzienek.
5.Umieścić żel w aparacie do elektroforezy i wlać 300ml 1x buforu elektrodowego.
6.Nanieść po 10 μl próbki do studzienki.
7.Rozpocząć elektroforezę (V=const, 75V, po ok.30 min zmienić na 150V).
8.Po zakończeniu elektroforezy wyjąć żel, opłukać wodą.
9.Żel barwić za pomocą Coomassie Blue G-250 przez 15 min.
10.Odbarwić żel roztworem odbarwiającym 2x 20 min.
11.Zidentyfikować keratynę.
3.Sprawozdanie
1.Krótki przebieg doświadczenia.
2.Skan żelu z zidentyfikowaną keratyną.
3.Wnioski