Poliproteina Gag jest nie tylko głównym komponentem strukturalnym

Nr wniosku: 150152, nr raportu: 12530. Kierownik (z rap.): dr Katarzyna Pachulska-Wieczorek
Poliproteina Gag jest nie tylko głównym komponentem strukturalnym niedojrzałych wirionów
retrowirusów, lecz koordynuje skomplikowany proces formowania wirionów w zainfekowanej
komórce. Poliproteina Gag z ludzkich wirusów niedoboru odporności (HIV-1 i HIV-2), zawiera
trzy główne domeny, z których każda pełni specyficzną funkcję: matriks (MA) odpowiada za
wiązanie Gag do błony komórki; kapsyd (CA) ułatwia multimeryzację Gag; nukleokapsyd
(NC) oddziałuje z wirusowymi i komórkowymi kwasami nukleinowymi. Wiele badań
wskazuje, że domena MA może również wiązać kwasy nukleinowe, jednak nie jest do końca
jasne w jakim celu. W późnych etapach wirusowej replikacji Gag odpowiada za selekcję,
dimeryzację i pakowanie genomowego RNA wirusa. Wymaga to rozpoznania specyficznych
sekwencji Ψ zlokalizowanych w rejonie liderowym (5’UTR) wirusowego RNA. Dimeryzacja
genomu jest unikalną cechą retrowirusów i każdy infekcyjny wirion zawiera dwie połączone
niekowalencyjnie cząsteczki genomowego RNA. Ponadto Gag jest zaangażowany w proces
przyłączania tRNALys3 do sekwencji PBS zlokalizowanej w 5’UTR RNA wirusa. Cząsteczka
tRNALys3 wykorzystywana jest jako starter dla odwrotnej transkrypcji w następnej rundzie
replikacji wirusa. Funkcje Gag wymagają aktywności opiekuńczej względem kwasów
nukleinowych (nucleic acid chaperone - NAC). Dotychczas jednak , została ona potwierdzona
tylko dla poliprotein Gag z HIV-1 i RSV. Białka NAC, działając niezależnie od ATP,
wspomagają prawidłowe zwijanie cząsteczek kwasów nukleinowych i przyjęcie przez nie
najbardziej korzystnej termodynamicznie struktury.
Niniejszy projekt skupia się na badaniach aktywności opiekuńczej poliproteiny HIV-2
Gag oraz poznaniu specyfiki jej oddziaływania z wirusowym RNA. Istotnym celem było
zbadanie udziału domen NC i MA w aktywności HIV-2 Gag na kluczowych etapach pakowania
wirusowego RNA czyli dimeryzacji i przyłączania tRNALys3. Przeprowadzone badania
wskazują, że HIV-2 Gag cechuje się wysoką aktywnością NAC. Szczególnie ciekawe jest
ustalenie, że przeciwieństwie do HIV-1 Gag, w HIV-2 Gag obie domeny NC i MA odpowiadają
za aktywność opiekuńczą. Zarówno białko HIV-2 NC, jak i HIV-2 MA wykazują wysoką
aktywność NAC, jednak tylko HIV-2 NC promuje dimeryzację wirusowego RNA. Domena
MA poliproteiny HIV-2 Gag nie uczestniczy w dimeryzacji i kluczowa dla tego procesu jest
domena NC. Pewne funkcje HIV-2 Gag są stymulowane przez heksafosforan inozytolu (IP6),
mimikujący fosfolipidy błony komórkowej. IP6 stymuluje aktywność HIV-2 Gag w reakcji
przyłączania starterowego tRNA, ale nie podczas dimeryzacji.
W ramach projektu zidentyfikowano miejsca preferencyjnego wiązania HIV-2 Gag, NC
oraz MA w wirusowym RNA. Każde z białek najsilniej wiąże się w rejonie 5’UTR i 3’UTR
HIV-2 RNA. HIV-2 Gag, NC i MA nie wykazują preferencji do określonych motywów
strukturalnych RNA i miejsca ich wiązania przypadały zarówno w rejonach jedno-, jak i
dwuniciowych. Analiza kompozycji reszt nukleotydowych w miejscach wiązania białek i ich
najbliższym sąsiedztwie ujawniała interesującą zależność. HIV-2 MA wiąże się do rejonów
RNA bogatych w reszty G, NC wykazuje preferencje do reszt A, natomiast HIV-2 Gag wiąże
rejony bogate w reszty G i A. Zarówno HIV-2 NC, jak i Gag silnie wiążą, fragmenty
wirusowego RNA zawierające sygnały dimeryzacji i pakowania (Ψ), podczas gdy MA nie
wykazuje preferencji do Ψ i wiąże różne fragmenty funkcjonalne wirusowego RNA z
porównywalnym powinowactwem.
W oparciu o otrzymane wyniki, zaprojektowane zostały inhibitory typu RNA
(nazywane aptamerami lub RNA decoys) ukierunkowane na HIV-2 Gag oraz
scharakteryzowano ich aktywność in vitro. Aptamery są jednoniciowymi RNA, które wiążą się
z wysokim powinowactwem i specyficznością do molekuł na które są ukierunkowane.
Zaprojektowane inhibitory specyficznie rozpoznawały HIV-2 Gag, a także białka NC i MA.
Kilka spośród zaprojektowanych inhibitorów, skutecznie współzawodniczyło z wirusowym
RNA, zawierającym sygnały Ψ, o oddziaływanie z HIV-2 Gag.