Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin Clones AE1/AE3

Monoclonal Mouse
Anti-Human
Cytokeratin
Clones AE1/AE3
POLSKI
Nr kat. M3515
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciała Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin, Clones AE1/AE3, są przeznaczone do stosowania w immunohistochemii (IHC).
Przeciwciało identyfikuje dwa epitopy obecne na większości cytokeratyn nabłonkowych w utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie
tkankach. Wyniki są pomocne w klasyfikacji tkanek prawidłowych i zmienionych nowotworowo pochodzenia nabłonkowego1–3. Wyniki panelu
przeciwciał są pomocne w diagnostyce róŜnicowej nowotworów. Interpretacja kliniczna dodatniego lub ujemnego odczynu powinna być
uzupełniona przez badania morfologiczne i histologiczne oraz wykonywanie odpowiednich prób kontrolnych. Ocena wyników powinna zostać
przeprowadzona przez wykwalifikowanego patologa z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i wyników innych badań diagnostycznych.
Przeciwciała te przeznaczone są do stosowania po pierwotnym rozpoznaniu guza w konwencjonalnym badaniu histopatologicznym z
zastosowaniem barwników do nieimmunologicznych barwień histochemicznych.
Streszczenie i informacje ogólne
Cytokeratyny to rodzina rozpuszczalnych w wodzie białek o masie cząsteczkowej wynoszącej 40–70 kDa, tworzących cytoszkielet w
komórkach nabłonkowych. Do tej pory zidentyfikowano co najmniej 19 róŜnych cytokeratyn, które moŜna podzielić na dwie podrodziny.
Do podrodziny A naleŜą cytokeratyny względnie kwaśne (o pI poniŜej 5,5), podczas gdy do podrodziny B naleŜą białka względnie zasadowe,
o pI 6 lub wyŜszym.
Patrz dokument General Instructions for Immunohistochemical Staining (Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych)
firmy Dako lub instrukcje do systemu detekcji IHC.
Dostarczony odczynnik
Mysie przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci nadsączu hodowli tkankowej w buforze Tris/HCl o stęŜeniu 0,05 mol/L i pH 7,2,
zawierającym azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/L. Produkt zawiera białko stabilizujące.
Klony: AE1/AE31,2
Izotyp: IgG1, kappa
StęŜenie mysich IgG (mg/L): Patrz: informacja podana na etykiecie fiolki.
M3515 moŜna stosować w rozcieńczeniu 1:50 w barwieniu IHC przy uŜyciu systemu wizualizacji EnVision, LSAB2 lub EnVision FLEX. Są to
jednak wyłącznie wytyczne. Optymalne stęŜenia przeciwciała mogą się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobu jego
przygotowania i powinny być określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. UŜytkownik powinien ustalić działanie przeciwciała podczas
korzystania z innych systemów barwienia ręcznego lub z systemów zautomatyzowanych.
StęŜenie białek w róŜnych partiach moŜe się róŜnić, co nie ma wpływu na optymalne rozcieńczenie. W celu zapewnienia jednolitości
odczynów immunohistochemicznych wykonywanych przy uŜyciu róŜnych partii produktu, miano kaŜdej partii jest porównywane i
dostosowywane do partii referencyjnej.
Immunogen
Modzel ludzki1
Swoistość
AE1/AE3 to mieszanina dwóch przeciwciał monoklonalnych uzyskanych poprzez immunizację myszy ludzkimi keratynami z modzelu.2
Wykazano, Ŝe przeciwciała AE1/AE3 rozpoznają większość ludzkich cytokeratyn, w związku z czym moŜna je stosować w pozytywnej
identyfikacji immunohistochemicznej komórek pochodzących z nabłonków jednowarstwowych i wielowarstwowych.1,2,4 Przeciwciało AE1
wykazuje immunoreaktywność w stosunku do determinanty antygenowej obecnej na większości cytokeratyn podrodziny A, do której naleŜą, wg
oznaczeń Molla4, cytokeratyny 10, 13, 14, 15 16 i 19 (o masach cząsteczkowych odpowiednio: 56,5, 54', 50, 50', 48 i 40 kDa), ale nie na
cytokeratynach 12, 17 i 18 (55, 47 i 45 kDa).4 Przeciwciało AE3 reaguje z determinantą antygenową obecną na cytokeratynach podrodziny B, do
której naleŜą cytokeratyny 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8 (o masach cząsteczkowych odpowiednio: 65, 67, 64, 59, 58, 56, 54 i 52 kDa).5
Materiały wymagane, ale niedostarczane
Patrz dokument General Instructions for Immunohistochemical
immunohistochemicznych) firmy Dako lub instrukcje do systemu detekcji.
Staining
(Ogólne
instrukcje
wykonywania
odczynów
Środki ostroŜności
1. Do badań diagnostycznych in vitro.
2. Do stosowania przez wyszkolony personel.
3. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny w czystej postaci związek chemiczny – azydek sodu (NaN3). Azydek sodu (NaN3)
zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z elementami kanalizacji
wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością
wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydków metali w kanalizacji.6
4. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych naleŜy stosować właściwe procedury
postępowania.
5. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
6. Niewykorzystane odczynniki usuwać zgodnie z rozporządzeniami lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi.
(113216-004)
303322PL_004 s. 1/3
Przechowywanie
Przechowywać w temperaturze 2-8 °C. Nie u Ŝywać po upływie daty waŜności podanej na fiolce. Jeśli odczynniki są przechowywane w
warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik powinien zweryfikować te warunki. Nie ma wyraźnych oznak wskazujących na
niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne.
W przypadku uzyskania nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, i gdy
podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Przygotowanie próbek
Skrawki parafinowe
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania skrawków utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie.
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o grubości około 4 µm.
Obróbka wstępna
Zaleca się wstępne potraktowanie odparafinowanych preparatów tkankowych enzymami proteolitycznymi lub poddanie cieplnemu
odmaskowaniu antygenu. W przypadku cieplnego odmaskowania antygenu optymalne wyniki uzyskuje się z zastosowaniem roztworu
EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat. K8004). Odmaskowanie antygenu przeprowadza się w urządzeniu Dako
PT Link (nr kat. PT100/PT101). Szczegółowe informacje zawiera instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link (PT Link User Guide).
Zamiast cieplnego odmaskowania antygenu moŜna zastosować enzymatyczną obróbkę wstępną. W obróbce wstępnej preparatów
tkankowych utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie moŜna stosować następujące enzymy: Proteinase K, RTU (nr kat. S3020),
Pepsin (nr kat. S3002) lub Proteolytic Enzyme, RTU (nr kat. S3007). Preparaty naleŜy dokładnie przemyć wodą destylowaną, a następnie
postępować według zaleceń zawartych w procedurze barwienia odpowiedniego systemu detekcji.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć. W celu
uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie szkiełek FLEX IHC Microscope Slides
(nr kat. K8020). Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą zostać odwodnione, oczyszczone i zatopione metodą trwałego zatapiania.
Procedura barwienia
Postępować zgodnie z procedurą określoną dla wybranego systemu detekcji. Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od
pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne tkankowe próby kontrolne, a takŜe próby kontrolne z odczynnikiem do kontroli ujemnej, z
uŜyciem identycznego protokołu.
Interpretacja wybarwienia
Odczyn komórkowy przeciwciał AE1/AE3 ma charakter cytoplazmatyczny.
Ograniczenia swoiste dla opisywanego produktu
1. Wykazano reakcję z przeciwciałami skierowanymi przeciwko cytokeratynie 8 w pozagrudkowych komórkach retikularnych w węzłach
chłonnych, migdałkach i śledzionie.7
2. Obecność cytokeratyny 19 i prawdopodobnie 8 potwierdzono w komórkach mięśni gładkich macicy.8
3. Komórki niektórych czerniaków9 i mięśniakomięsaków gładkokomórkowych8 mogą w sporadycznych przypadkach wykazywać odczyn
dodatni. Jest to bardziej widoczne w tkankach zamroŜonych niŜ utrwalonych w formalinie.10 W związku z tym zaleca się
stosowanie przeciwciał AE1/AE3 w panelu z HMB45 (przy wykluczaniu czerniaka) i desminą (przy wykluczaniu mięśniakomięsaka
gładkokomórkowego), które nie wykazują swoistości względem komórek nabłonka.
4. Fałszywie dodatni odczyn w komórkach glejowych guzów zgłoszono w przypadku skrawków tkankowych utrwalonych w formalinie i
zatopionych w parafinie po obróbce wstępnej z zastosowaniem enzymów proteolitycznych. Za pomocą metod immunocytochemicznych
i biochemicznych wykazano, Ŝe te komórki i guzy nie wykazują ekspresji cytokeratyn.11
5. Pinkus i wsp.12 zauwaŜyli, Ŝe barwienie przeciwciałami AE1/AE3 skrawków tkankowych utrwalonych w formalinie musi być
poprzedzone wytrawianiem proteolitycznym. Na fotografiach przedstawiono wyniki po tym, jak pominięto wytrawianie trypsyną II,
zastosowano inne trypsyny i/lub zastosowano techniki niepełnego wytrawiania. W dwóch ostatnich przypadkach tylko 2/12 nowotworów
róŜnych typów wykazało optymalny odczyn świadczący o ekspresji cytokeratyny. Po dokonaniu przeglądu wcześniejszego
piśmiennictwa zawierającego sprzeczne dane dotyczące immunoreaktywności cytokeratyn i porównaniu ich z własnymi wynikami
Pinkus i wsp.12 uznali, Ŝe w wielu przypadkach fałszywie ujemne wyniki były spowodowane zastosowaniem niewłaściwych technik.
6. Na podstawie porównania przeciwciał AE1/AE3 z przeciwciałem skierowanym przeciwko naskórkowemu antygenowi błonowemu (ang.
epithelial membrane antigen, EMA) w immunohistochemicznej analizie 87 nowotworów, w tym 48 gruczolakoraków róŜnego typu,
Pinkus i wsp.13 doszli do wniosku, Ŝe w poddanych obróbce proteolitycznej skrawkach tkankowych utrwalonych w formalinie
cytokeratyny wybarwione przeciwciałami AE1/AE3 to wiarygodniejsze markery niŜ przeciwciała skierowane przeciwko EMA w 33%
przypadków nowotworów pochodzenia nabłonkowego. PoniewaŜ jednak odczyn dla EMA był dodatni, a dla AE1/AE3 ujemny w 9%
przypadków, zalecono stosowanie przeciwciał AE1/AE3 i przeciwciał skierowanych przeciwko EMA jako odczynników uzupełniających.
7. Choć Listrom i Dalton14 nie zaobserwowali odczynów fałszywie dodatnich, w 2/2 plazmacytom, 2/4 czerniaków i 2/7 chłoniaków wystąpił
słaby odczyn cytoplazmatyczny, uznany za wynik niespecyficznego barwienia tła.
Charakterystyka działania
Tkanki prawidłowe
W analizie 30 róŜnych tkanek prawidłowych odczyn dodatni wykazano w cytoplazmie komórek nabłonka płaskiego i walcowatego szyjki
macicy, okręŜnicy, przełyku, skóry, jelita cienkiego, Ŝołądka i migdałków. Inne tkanki o odczynie dodatnim to tkanki gruczołowe (gruczoł
mlekowy, przytarczyce, gruczoł krokowy, gruczoły potowe i tarczyca), astrocyty, istota biała móŜdŜku, filamenty glejowe mózgowia, kanaliki
dystalne i torebka Bowmana w nerkach, przewód Ŝółciowy, pneumocyty, oskrzela, międzybłonek, przewód międzyzrazikowy trzustki,
komórki przedniego płata przysadki mózgowej, przewód międzyzrazikowy i komórki groniaste gruczołu ślinowego, komórki retikularne i
ciałka Hassalla grasicy oraz endometrium i mięśnie gładkie macicy.15 Odczyn ujemny wykazano w przypadku nadnerczy, szpiku kostnego,
mięśnia sercowego, osierdzia, nerwów obwodowych, mięśni szkieletowych, śledziony i jąder.
Przeciwciała AE1/AE3 reagują ze zrogowaciałym naskórkiem (56,5/65–67) i warstwą rogową naskórka (55/64), nabłonkiem
wielowarstwowym płaskim narządów wewnętrznych (51/59), nabłonkami wielowarstwowymi (50/58), keratynocytami o przyspieszonej
proliferacji (48/56) i nabłonkami jednowarstwowymi (45/52 i 46/54). Keratyna o masie cząsteczkowej 40 kDa jest obecna w większości
nabłonków z wyjątkiem naskórka osób dorosłych.3,4
(113216-004)
303322PL_004 s. 2/3
Tkanki nieprawidłowe
Listrom i Dalton14 przetestowali klony AE1/AE3 na tkankach zmienionych chorobowo, obejmujących ponad 60 słabo zróŜnicowanych
nowotworów pochodzenia nabłonkowego, białaczek, czerniaków i mięsaków. W badaniu wybarwione zostały wszystkie 34 nowotwory
pochodzenia nabłonkowego i tylko 2/6 przypadków raka drobnokomórkowego oraz 3/5 przypadków raka przejściowokomórkowego. W
przypadkach raka przejściowokomórkowego, które zostały wybarwione przeciwciałami AE1/AE3, wystąpił słaby odczyn rozlany
cytoplazmatyczny lub okołojądrowy. Montag i wsp.16 wykazali, Ŝe przeciwciała AE1/AE3 to czuły odczynnik do stosowania w klasyfikacji
rozproszonych międzybłoniaków złośliwych rodzaju mięsakowatego (wrzecionowatokomórkowego) (odczyn dodatni w 30/30 przypadków).
Pinkus i wsp.13 porównali barwienie przeciwciałem skierowanym przeciwko EMA 87 nowotworów, w tym 48 gruczolakoraków róŜnego typu, z
barwieniem przeciwciałami AE1/AE3 i wykazali, Ŝe te drugie były bardziej wiarygodne w 33% przypadków.
Choć wykazano reaktywność przeciwciał AE1/AE3 w 3/3 przypadkach struniaka chondroidalnego i 1/8 przypadków chłoniaka, nie
zaobserwowano barwienia w 25 nowotworach pochodzenia innego niŜ nabłonkowe, włączając po 4 przypadki czerniaka i glejaka.14 Nie
wykryto cytokeratyn w 8 przypadkach nowotworów nienabłonkowych, włączając czerniaka, chłoniaka, nerwiakowłókniaka i mięsaka, po
zastosowaniu przeciwciał AE1/AE3 w metodzie immunoblot.17 Niemniej zalecono14 włączenie przeciwciał AE1/AE3 do panelu przeciwciał
słuŜącego do określania pochodzenia komórkowego słabo zróŜnicowanych nowotworów drobnokomórkowych.
Piśmiennictwo
1. Tseng SCG, Jarvinen MJ, Nelson WG, Huang JW, Woodcock-Mitchell J, Sun TTl. Correlation of specific keratins with different types of
epithelial differentiation: Monoclonal antibody studies. Cell 1982;30(2):361-72
2. Woodcock-Mitchell J, Eichner R, Nelson WG, Sun TT. Immunolocalization of keratin polypeptides in human epidermis using
monoclonal antibodies. J Cell Biol 1982;95(2 Pt 1):580-8
3. Moll R, Franke WW, Schiller Dl. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured
cells. Cell 1982;31(1):11-24
4. Sun T-T, Eichner R, Schermer A, Cooper D, Nelson WG, Weiss RA. Classification, expression and possible mechanisms of evolution of
mammalian epithelial keratins: A unifying model. In: Levine A, Topp W, Vande Woude G, Watson JD (eds.). Cancer cells 1 the
transformed phenotype. New York: Cold Spring Harbor Laboratory 1984
5. Eichner R, Bonitz P, Sun T-T. Classification of epidermal keratins according to their immunoreactivity, isoelectric point and mode of
expression. J Cell Biol 1984;98(4):1388-96
6. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures for the
decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ No. 78-127, Current 13. August 16,
1976
7. Franke WW, Moll R. Cytoskeletal components of lymphoid organs. Differentiation 1987;36(2):145-63
8. Gown AM, Boyd HC, Chang Y, Ferguson M, Reichler B, Tippens D. Smooth muscle cells can express cytokeratins of “simple”
epithelium. Amer J Pathol 1988;132(2):223-32
9. Zarbo RJ, Gown AM, Nagle RB, Visscher DW, Crissman JD. Anomalous cytokeratin expression in malignant melanoma: One- and twodimensional western blot analysis and immunohistochemical survey of 100 melanomas. Mod Pathol 1990;3(4):494-501
10. Brown DC, Theaker JM, Banks PM, Gatter KC, Mason DY. Cytokeratin expression in smooth muscle and smooth muscle tumors.
Histopathol 1987;11(5):477-86
11. Bacchi CA, Zarbo RJ, Jiang JJ, Gown AM. Do glioma cells express cytokeratin? Appl Immunohistochem 1995;3(1):45-53
12. Pinkus GS, O’Connor EM, Etheridge CL, Corson JM. Optimal immunoreactivity of keratin proteins in formalin-fixed, paraffin-embedded
tissue requires preliminary trypsinization. J Histochem Cytochem 1985(5);33:465-73
13. Pinkus GS, Etheridge CL, O’Connor EM. Are keratin proteins a better tumor marker than epithelial membrane antigen? Amer J Clin
Pathol 1986;85(3):269-77
14. Listrom MB, Dalton LW. Comparison of keratin monoclonal antibodies MAK-6, AE1:AE3 and CAM-5.2. Amer J Clin Pathol
1987;88(3):297-301
15. Report of Normal Tissue Immunohistochemical testing using DAKO Mouse Anti-Human Cytokeratin, Clone AE1/AE3. DAKO Corp June
1998
16. Montag AG, Pinkus GS, Corson JM. Keratin protein immunoreactivity of sarcomatoid and mixed types of diffuse malignant
mesothelioma: An immunoperoxidase study of 30 cases. Hum Pathol 1988;19(3):336-42
17. Nelson WG, Battifora H, Santana H and Sun T-T. Specific keratins as molecular markers for neoplasms with a stratified epithelial origin.
Canc Res 1984;44(4):1600-3
Wydanie 03/16
(113216-004)
303322PL_004 s. 3/3