Monoclonal Mouse
Transkrypt
Monoclonal Mouse
FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin klon AE1/AE3 Ready-to-Use (Link) Nr kat. IR053 Przeznaczenie Do stosowania w diagnostyce in vitro. Przeciwciało FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin, klon AE1/AE3, Ready-to-Use, (Link), jest przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Autostainer Link. Przeciwciała te są przydatne w identyfikacji raków lub nowotworów pochodzenia nabłonkowego (1-3). Interpretacja kliniczna dodatniego lub ujemnego odczynu musi być uzupełniona przez ocenę morfologiczną, wykonanie odpowiednich prób kontrolnych i interpretowana przez doświadczonego patologa w kontekście historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych. Streszczenie i informacje ogólne Cytokeratyny stanowią rodzinę białek rozpuszczalnych w wodzie, o masie cząsteczkowej 40-70 kDa, tworzących cytoszkielet komórek nabłonkowych. Wyizolowano co najmniej 19 różnych typów cytokeratyn, które dzieli się na dwie podrodziny. W skład podrodziny A wchodzą cytokeratyny o stosunkowo kwaśnym odczynie (pH < 5,5), natomiast w skład podrodziny B – cytokeratyny o stosunkowo zasadowym odczynie (pH większe lub równe 6). Zobacz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody. Dostarczany odczynnik Gotowe do użycia mysie przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym białko stabilizujące i roztwór NaN3 o stężeniu 0,015 mol/L. Klon: AE1/AE3 Izotyp: IgG1, kappa Immunogen Ludzki naskórek modzeli (1) Swoistość W skład opisywanego zestawu AE1 i AE3 wchodzi mieszanina dwóch rodzajów przeciwciał monoklonalnych, otrzymanych na drodze immunizacji myszy keratynami ludzkiej modzeli (2). Wykazano, że mieszanina przeciwciał AE1 i AE3 pozwala na identyfikację większości ludzkich cytokeratyn, dzięki czemu może stanowić narzędzie pozytywnej identyfikacji immunocytochemicznej komórek pochodzących z nabłonka jedno- i wielowarstwowego (1,2,4). Przeciwciała AE1 wykazują reakcję z determinantą antygenową występującą na większości cytokeratyn podrodziny A, w tym cytokeratyn 10, 13, 14, 15 16 i 19 (o masach cząsteczkowych wynoszących odpowiednio 56,5, 54', 50, 50', 48 i 40 kDa) w klasyfikacji Molla. Przeciwciała nie wykazują reakcji z cytokeratynami 12, 17 i 18 (o masach cząsteczkowych wynoszących odpowiednio 55, 47 i 45 kDa) wg tej samej klasyfikacji (4). Przeciwciała AE3 wykazują reakcję z determinantą antygenową wspólną dla podrodziny B, w tym cytokeratyn 1, 2, 3, 4 5, 6, 7 i 8 (o masach cząsteczkowych wynoszących odpowiednio 65, 67, 64, 59, 58, 56, 54 i 52 kDa) (5). Środki ostrożności 1. 2. 3. 4. 5. Przechowywanie (115396-001) Odczynniki przeznaczone dla przeszkolonych Użytkowników. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. Stężenie NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN3 z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika używać dużych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej. Podobnie jak w przypadku każdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, należy stosować odpowiednie procedury postępowania. Należy stosować właściwe wyposażenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą bądź oczami. Niewykorzystany odczynnik należy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i krajowymi. Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie stosować po upływie terminu ważności podanego na opakowaniu. Jeżeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niż podane na ulotce dołączanej do opakowania, Użytkownik powinien je zweryfikować. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności tego produktu. Z tego względu jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjentów, należy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie można wyjaśnić różnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, należy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako. 307121PL_001 s. 1/3 Przygotowanie próbek oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie. Preparaty tkankowe należy pociąć na skrawki o wymiarach 4 µm. Wymagane jest poddanie preparatów cieplnemu odmaskowaniu antygenu. Optymalne wyniki uzyskuje się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy użyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (10x) (nr kat. K8000/K8004). Odparafinowane skrawki: Zaleca się wstępną obróbkę utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków tkankowych przy użyciu Dako PT (Link) (nr kat. PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja użytkownika aparatu PT Link. Postępować według procedury wstępnej obróbki tkanek zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (10x) (Link) (nr kat. K8000/K8004). Dla aparatów PT Link należy stosować następujące parametry: Temperatura wstępnego ogrzewania: 65°C; temperatura i czas odmaskowania antygenu: 97°C przez 20 (±1) minut; ochłodzić do 65°C. Przepłukać skrawki rozcieńczonym roztworem o temperaturze pokojowej EnVision FLEX Wash Buffer (10x) (Link) (nr kat. K8000). Skrawki zatapiane w parafinie: W celu odmiennego przygotowania próbek zarówno odparafinowanie, jak i odmaskowanie można wykonać w aparacie PT Link z zastosowaniem zmienionej procedury. Informacje można znaleźć w Instrukcji użytkownika aparatu PT Link. Po zakończeniu wykonywania odczynu skrawki tkankowe należy poddać odwodnieniu, oczyszczeniu i nakryć za pomocą środka do trwałego zatapiania. W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie szkiełek Dako Silanized Slides (nr kat. S3003). Wykonanie odczynu oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Zalecanym system wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH (Link) (nr kat. K8000). W oprogramowaniu Autostainer Link wstępnie zaprogramowano etapy odczynu i czasy inkubacji. Szczegółowe informacje dotyczące wkładania szkiełek mikroskopowych i odczynników przedstawiono w Instrukcji użytkownika aparatu Autostainer Link. Jeśli protokoły nie są dostępne w używanym systemie Autostainer, należy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Wszystkie procedury inkubacji należy również przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Optymalne warunki mogą się zmieniać w zależności od rodzaju materiału oraz sposobu jego przygotowania i powinny być określone indywidualnie w każdym laboratorium. Aby możliwe było wykonanie oceny przez patologów z różnym nasileniem odczynu preparatów, należy skontaktować się z działem obsługi/obsługą techniczną firmy Dako w celu uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu. Należy upewnić się, że działanie zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe — w tym celu należy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną za pomocą EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (nr kat. K8008). Zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do zatapiania. Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów należy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne z użyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować nabłonek płaski śluzówki, natomiast we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative Control, Mouse (Link) (nr kat. IR750). Interpretacja odczynu Przeciwciała dają odczyn cytoplazmatyczny. Charakterystyka wydajnościowa Tkanki prawidłowe: W wyniku badania 30 różnych, prawidłowych tkanek wykazano odczyn dodatni w cytoplazmie nabłonka płaskiego i walcowatego szyjki macicy, jelita grubego, przełyku, skóry, jelita cienkiego, żołądka i migdałków. Dodatni odczyn uzyskano również w przypadku tkanki gruczołowej (sutka, przytarczyc, stercza, gruczołów potowych i tarczycy), astrocytów, substancji białej móżdżku, włókien glejowych mózgu, cewek dystalnych i torebki Bowmana nerek, przewodu żółciowego, pneumocytów, oskrzeli, międzybłonka, przewodów międzyzrazikowych trzustki, komórek części przedniej przysadki mózgowej, przewodów międzyzrazikowych i komórek zrazikowych gruczołów ślinowych, komórek retikularnych i ciałek Hassalla grasicy oraz błony śluzowej i mięśni gładkich trzonu macicy (6). Ujemny odczyn występował w przypadku nadnerczy, szpiku kostnego, serca, osierdzia, nerwów obwodowych, mięśni szkieletowych, śledziony i jąder. Przeciwciała AE1/AE3 reagują z cytokeratyną nabłonka wielowarstwowego płaskiego rogowaciejącego (56,5/65– 67) i nabłonka rogówki (55/64), cytokeratyną nabłonka wielowarstwowego płaskiego narządów wewnętrznych (51/59), cytokeratyną nabłonka wielowarstwowego (50/58), cytokeratyną keratynocytów wykazujących nadmierną proliferację (48/56) oraz cytokeratyną komórek nabłonka jednowarstwowego (45/52 i 46/54). Keratyna o masie cząsteczkowej 40 kDa jest obecna w większości rodzajów nabłonka, z wyjątkiem dojrzałego naskórka (3, 4). Tkanki nieprawidłowe: W preparatach tkanek zmienionych chorobowo Listrom i Dalton (20) badali przydatność przeciwciał klonów AE1/AE3 wykonując testy na ponad 60 preparatach niskozróżnicowanych nowotworów nabłonkowych, chłoniaków, czerniaków i mięsaków. Z wyjątkiem dodatniego odczynu w 2 z 6 przypadków raka drobnokomórkowego i 3 z 5 przypadków raka z nabłonka dróg moczowych stwierdzono dodatni odczyn wszystkich 34 nowotworów pochodzenia nabłonkowego. W preparatach o dodatnim odczynie przeciwciała AE1/AE3 dawały jedynie słaby odczyn rozsiany cytoplazmatyczny lub okołojądrowy z komórkami raka z nabłonka przejściowego. Montag i wsp. (8) stwierdzili, że przeciwciała AE1/AE3 są czułym odczynnikiem w diagnostyce różnicowej rozsianego międzybłoniaka typu sarkomatycznego (wrzecionowatokomórkowego) (wynik dodatni w 30/30 przypadkach) i innych rodzajów nowotworów wrzecionowatokomórkowych (0/49). Pinkus i wsp. (6) porównali opisywany test z odczynem z przeciwciałami anty-EMA. Na podstawie badania 87 nowotworów, w tym 48 różnych rodzajów raków gruczołowych, stwierdzono, że w 33% przypadków odczyn przeciwciał AE1/AE3 był bardziej wiarygodny. (115396-001) 307121PL_001 s. 2/3 Wprawdzie uzyskano dodatni odczyn struniaka chrzęstniakowatego (3/3 przypadki) i chłoniaka (1/8 przypadków) z przeciwciałami anty-AE1/AE3, niemniej jednak nie obserwowano dodatniego odczynu wśród 25 nowotworów pochodzenia nienabłonkowego, w tym 4 przypadków czerniaka i glejaka wielopostaciowego (7). Test immunoblot z przeciwciałami AE1/AE3 nie pozwolił na wykrycie cytokeratyny w 8 przypadkach nowotworów pochodzenia nienabłonkowego, w tym czerniaka, chłoniaka, nerwiakowłókniaka i mięsaka (9). Niemniej jednak, zaleca się (7) stosowanie testu AE1/AE3 jako składnika panelu przeciwciał stosowanych w celu identyfikacji linii komórkowych w przypadku nowotworów drobnokomórkowych o niskim stopniu zróżnicowania. Piśmiennictwo 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Tseng SCG, Jarvinen MJ, Nelson WG, Huang JW, Woodcock-Mitchell J, Sun TTl. Correlation of specific keratins with different types of epithelial differentiation: Monoclonal antibody studies. Cell 1982; 30:361 Woodcock-Mitchell J, Eichner R, Nelson WG, Sun TT. Immunolocalization of keratin polypeptides in human epidermis using monoclonal antibodies. J Cell Biol 1982; 95:580 Moll R, Franke WW, Schiller Dl. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Cell 1982; 31:11 Sun T-T, Eichner R, Schermer A, Cooper D, Nelson WG, Weiss RA. Classification, expression and possible mechanisms of evolution of mammalian epithelial keratins: A unifying model. In: Levine A, Topp W, Vande Woude G, Watson JD (eds.). Cancer cells 1 the transformed phenotype. New York: Cold Spring Harbor Laboratory 1984 Eichner R, Bonitz P, Sun T-T. Classification of epidermal keratins according to their immunoreactivity, isoelectric point and mode of expression. J Cell Biol 1984; 98:1388 Pinkus GS, Etheridge CL, O’Connor EM. Are keratin proteins a better tumor marker than epithelial membrane antigen? Amer J Clin Pathol 1986; 85:269 Listrom MB and Dalton LW. Comparison of keratin monoclonal antibodies MAK-6, AE1:AE3 and CAM-5.2. Amer J Clin Pathol 1987; 88:297 Montag AG, Pinkus GS, Corson JM. Keratin protein immunoreactivity of sarcomatoid and mixed types of diffuse malignant mesothelioma: An immunoperoxidase study of 30 cases. Hum Pathol 1988; 19:336 Nelson WG, Battifora H, Santana H and Sun T-T. Specific keratins as molecular markers for neoplasms with a stratified epithelial origin. Canc Res 1984; 44:1600 Wydanie 09/07 (115396-001) 307121PL_001 s. 3/3