docmarzec ok ok.indd - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy
download 
Reklamacja Transkrypt
marzec ok ok.indd - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy
!KTYWNOu¿BIOLOGICZNASYNTETYCZNYCHTIOPURYNWHODOWLACHLA BORATORYJNYCH#HLORELLAVULGARIS "IOLOGICALACTIVITYOFSYNTHETICPURINEDERIVATIVESIN#HLORELLAVULGARISLABORATORY CULTURES $RNFARM*OLANTA3OCHACKA $RNFARM!LICJA+OWALSKA :AKAD#HEMII/GÌLNEJI.IEORGANICZNEJ7YDZIA&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ gLSKI5NIWERSYTET-EDYCZNY +IEROWNIK$RHABNMED!NDRZEJ3OBCZAK +ATEDRAI:AKAD#HEMII/RGANICZNEJ 7YDZIA&ARMACEUTYCZNY Z/DDZIAEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ gLSKI5NIWERSYTET-EDYCZNY +IEROWNIK0ROFDRHABNCHEM!NDRZEJ-AuLANKIEWICZ STRESZCZENIE Celem pracy była ocena oddziaływania zsyntetyzowanych tiopochodnych puryny – 2,6 -dipodstawionych 7-metylopuryny – na wzrost eukariotycznych komórek glonu Chlorella vulgaris (C. vulgaris). Komórki glonu hodowano synchronicznie, w cyklu hodowlanym obejmującym 12-godzinną fazę jasną i 12-godzinną fazę ciemną, w płynnej pożywce Kuehla-Lorenzena oraz na pożywce zestalonej agarem. Prowadzono równolegle hodowle kontrolne, hodowle w obecności badanych substancji i hodowle z 6-Merkaptopuryną i 6-Tioguaniną, wybranymi jako modelowa substancje o działaniu cytotoksycznym. Po zakończeniu cyklu hodowlanego w hodowlach na płynnym podłożu zliczano komórki glonu w komorze Burkera i mierzono absorbancję przy λ=680 nm, a na podłożu agarowym zliczano mikrokolonie komórek podzielonych i niepodzielonych. Wyniki pomiarów absorbancji świadczyły o ilości syntetyzowanych barwników fotosyntetycznych i były miarą ogólnej biologicznej aktywności komórki, natomiast metoda zliczania komórek pozwoliła na określenie zdolności komórek do podziału. Stwierdzono, że badane substancje w różny sposób oddziaływały na wzrost hodowli C. vulgaris, obniżając ich aktywność biologiczną i hamując podziały komórkowe (w odniesieniu do hodowli kontrolnej). Mimo zachowanej w niektórych przypadkach aktywności biologicznej, po przeniesieniu na pożywkę agarową komórki macierzyste nie wytwarzały mikrokolonii komórek podzielonych. ABSTRACT In this study, a biological activity of synthesized 2,6-disubtituted 7-methylpurines and 6-Mercaptopurine (6-MP, a reference substance) was tested with unicellular green alga Chlorella vulgaris (C. vulgaris). Algal cells were cultivated during one 24-hr light-dark cycle in a Kuehl-Lorenzen liquid medium and in a solidified medium (on Petri dishes). The general biological activity of the cells was determined by absorbance at λ=680 nm. Growth multiplication factor was estimated by the direct counting of the cells in a liquid medium or with a microcolony method. In a latter method, microcolonies containing undivided cells and containing 2, 4, 8 and 16 aplanospores formed from mother cells were counted in a solid medium. It was found that the tested compounds exhibited a cytotoxic and antiproliferative activity (in relation to the control culture). Key words: purine derivatives, 6-Mercaptopurine, Chlorella vulgaris Słowa kluczowe: syntetyczne pochodne puryny, 6-Merkaptopuryna, Chlorella vulgaris COPYRIGHT'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO )33. → &ARMACEUTYCZNY 0RZEGLD.AUKOWY ¡¤°°U Syntetyczne tiopochodne naturalnych zasad purynowych (guaniny i hipoksantyny), 6-Merkaptopuryna i 6-Tioguanina, stosowane są w leczeniu chorób nowotworowych. Molekularny mechanizm ich działania nie jest ostatecznie wyjaśniony. Wiadomo, że mechanizm hamujący wzrost komórek, który jest efektem antymetabolicznym i odwracalnym [1], związany jest z inhibicją syntezy puryn de novo [2], a mechanizm cytotoksyczności wynika z inkorporacji tiopurynowych nukleotydów do kwasów nukleinowych i hamowania układów enzymatycznych w syntezie i replikacji DNA w fazie S cyklu komórkowego [3]. Antymetabolity purynowe nie wykazują selektywnego działania przeciwnowotworowego i uszkadzają nie tylko szybko proliferujące komórki nowotworowe, ale wykazują także umiarkowaną toksyczność wobec tkanek zdrowych szybko rosnących, w których często występują podziały komórkowe (szpik, gamety, immunokompetentne komórki układu chłonnego) [4]. Aktywność biologiczną otrzymanych pochodnych tiopurynowych oceniano względem jednokomórkowego glonu Chlorella vulgaris (C. vulgaris), który pod względem morfologicznym jest typową komórką eukariotyczną. Jednak w odróżnieniu do większości komórek Eukaryota w których w czasie cyklu komórkowego, ilość składników komórki wzrasta dwukrotnie i komórka dzieli się na dwie komórki potomne, w komórce Chlorella w jednym cyklu komórkowym może mieć miejsce 2, 4 i 8-krotne powielanie składników komórki w wyniku, czego komórka macierzysta dzieli się nawet na 8 komórek potomnych [5]. W cyklu życiowym C. vulgaris, stosując jako kryterium podziału czas syntezy DNA, można wyróżnić fazę G1, S, G2 i M. W fazie G1, trwającej od podziału komórki następuje gromadzenie energii chemicznej, synteza RNA, białek strukturalnych i enzymatycznych oraz węglowodanów (jeżeli komórka znajdzie się w warunkach, w których nie następuje gromadzenie energii faza G1 przechodzi w fazę G0 i następuje chwilowe zatrzymanie cyklu komórkowego). W fazie S ma miejsce replikacja DNA i synteza białek jądrowych, a w fazie G2 ma miejsce naprawa DNA i przygotowanie do podziału mitotycznego. Faza M obejmuje podział jądra komórkowego i cytokinezę oraz ostatecznie podział komórki macierzystej na aplanospory. Rozwój komórek Chlorella po uwolnieniu aplanospor w wyniku rozerwania ściany komórkowej komórki macierzystej, aż do kariokinezy włącznie, uzależniony jest od obecności światła, natomiast cytokineza i uwolnienie aplanospor mogą przebiegać w ciemności. Powstające w ciemności bezpośrednio po podziale młode aplanospory po rozpoczęciu naświetlania stają się aplanosporami aktywnymi fotosyntetycznie, zdolnymi do szybkiego wzrostu. W wyniku intensywnych przemian biochemicznych i morfologicznych przekształcają się w całkowicie dojrzałe do podziału komórki macierzyste [6]. ")") Do badań wytypowano symetryczne siarkowe pochodne puryn: 2,6-dimetylotio-7-metylopurynę 1, 2,6-dietylotio-7-metylopurynę 2 oraz 2,6-ditiokso-1,2,3,6-tetrahydro-7-metylopurynę 3. Związek o strukturze tionowej 3 otrzymano w reakcji 2,6-dichloro-7-metylopuryny z tiomocznikiem &ARMACEUTYCZNY 0RZEGLD.AUKOWY w etanolu zgodnie z danymi literaturowymi [7]. Symetryczne pochodne: 2,6-dimetylo 1 oraz 2,6-dietylotio-7-metylopurynę 2 otrzymano poprzez alkilowanie związku 3 za pomocą jodku metylu lub etylu w wodnym 4% roztworze KOH [7]. Jako substancje modelowe o działaniu cytotoksycznym stosowano 6-Merkaptopurynę i 6-Tioguaninę (Sigma Aldrich Co). W badaniach wykorzystano hodowle glonu Chlorella vulgaris (C. vulgaris, Beij, szczep 264, Boehm i Borns 1972/1, Culture Collection of Algal Laboratory, Czechoslovak Academy of Science, Trebon). Hodowle prowadzono w kolbach Erlenmeyera na płynnej pożywce Kühla-Lorenzena [8] wzbogaconej HCO3- (3,95 mmol/l) i CO2 (4% v/v), w jednym cyklu hodowlanym, który obejmował 12- ¬A ¥p ¥¬ AiRulA®yR 7-J-y¬Ai ¥7k -yAol -godzinna fazę jasną i 12-godzinną fazę ciemną. W fazie jasnej hodowle były oświetlane lampami jarzeniowymi (2500 – 3000 lx). Prowadzono równolegle hodowle kontrolne oraz hodowle z dodatkiem substancji 1, 2, 3 oraz 6-MP i 6-TG dodawanych do hodowli pojedynczo w postaci roztworów w DMSO. Roztwory substancji badanych dodawano do pożywki do osiągnięcia stężeń zbliżonych do wyznaczonych wartości efektywnego stężenia, EC50. Po 12-godzinnej fazie jasnej próbki hodowli przenoszono na pożywkę zestaloną agarem (na szalkach Petriego) i inkubowano w ciemności do zakończenia cyklu hodowlanego. Następnie zliczano pod mikroskopem mikrokolonie komórek niepodzielonych i podzielonych. Po 24-godzinnym cyklu hodowlanym, pobierano z kolb hodowlanych próbki hodowli i mierzono ich absorbancję przy λ=680 nm [9]. W tych samych próbkach hodowli zliczano komórki glonu w komorze Bürkera pod mikroskopem. Współczynnik KA określający ogólną aktywność biologiczną komórek i współczynnik podziału KN obliczano ze wzorów: N24 A24 KA = KN = A0 N0 gdzie: A24 i A0 oznacza absorbancję i N24 i N0 oznacza liczbę komórek glonu odpowiednio w czasie t24 i t0 ')' Wyznaczone wartości EC50 uzyskane dla 2,6-dipodstawionych 7-metylopuryn oraz dla 6-MP i 6-TG zamieszczono w Tabeli 1. Uzyskane wyniki wskazują, że wszystkie COPYRIGHT'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO )33. ¡¤°°U tych współczynników stwierdzono, że w wyniku ekspozycji na badane substancje w mniejszym stopniu zostaje upośledzona aktywność biologiczną komórek niż ich zdolność do podziału. Obserwacje mikroskopowe hodowli na agarze wykazały, że komórki glonu z hodowli kontrolnych zdolne były do wytwarzania mikrokolonii złożonych z 2, 4 i 8 aplanospor (średnio 4,97 aplanospor). W przypadku hodowli z badanymi substancjami mikrokolonie złożone ¬A¤|}ªy-ylRª}tA®¬yylp}ªlª¬®y-A®|y¬Aiªi|J|ªq-Aip|y |qk były głównie z komórek niezdolnych y¬Ail®J|J- plRu7-J-y¬Ai¥7 -yAol Ö¸Ryl-ª¬o²Al|ªRFklk"XzG° do podziału i w nielicznych przypaduaqGX¤UG°uaqG¤XG°uaqG¡XG°uaq kach stwierdzono obecność komórek Ö¸Ryl-ª¬o²Al|ªR|J¬p |ª-yR7¬t¬¥®¬p-y¬ulª- |²Al-ul^° podzielonych na 2 i 4 aplanospory (średnio 1,84 – 3,34). Jednocześnie obserwowano wśród komórek niepodzielonych komórki nietypowe ze względu na kształt i wielkość w porównaniu z komórkami niepodzielonymi z hodowli kontrolnej. Można przypuszczać, że mogły to być komórki zdolne do wytwarzania aplanospor, w których badane substancje hamowały podział w premitotycznej fazie G2 lub na jednym z etapów mi¬A¡lp|p||ª¬|7-®ulp|p|q|yllp|u}Rp©¥qa-lª¬l-y¬Aiy--a- tozy. Przykładowy obraz mikrosko®t¬yyRo|¸¬ªpli|J|ªql®kzG°uaq li|J|ªqlp|y |qyRolp|p|q|ylRF powy mikrokolonii uzyskanych na Xp|u}p-ylR|J®lRq|y-®i|J|ªqlp|y |qyRoG¤Xp|u}p-ylR|J®lRq|y- ® i|J|ªql ® kG ¡ X p|u}p- |J®lRq|y- y- ` -q-y||¬ ® i|J|ªql p|yk agarze przedstawiono na rycinie 3. |qyRoG¤l¡X|ªlÖp®RylR°°°°°kp| yRG¡X|ªlÖp®RylR¡°°°°°k kp| yR badane substancje były toksyczne względem C. vulgaris. Najmniej toksyczna okazała się 6-MP (EC50=105,1 mg/l), a najbardziej toksyczna substancja 2 (EC50=14,2 mg/l). Na rycinie 2 przedstawiono charakterystykę wzrostu hodowli C. vulgaris w postaci współczynników KA i KN, określających odpowiednio ogólną aktywność biologiczną i zdolność komórek do podziału, po zakończonej 24-godzinnej hodowli w pożywce płynnej. Analizując wartości +-pR Ö¸RÍ uaq ^°uaq k `UG°X``G° °^G k" `UG°X``G° ^G^ UG°X°G° ¤G` ¤ UG°X¤°G° `G¤ ¡ `G°XG° ¤¤Gz ¥7 -yAo- ' 1. Badane substancje silniej wpływały na zdolność komórek C. vulgaris do podziału niż na ich ogólną aktywność biologiczną (fotosyntetyczną). 2. Wyniki uzyskane z obserwacji komórek C. vulgaris na podłożu agarowym, mogą wskazywać, że badane substancje indukują zatrzymanie cyklu komórkowego na granicy faz G2/M lub na jednym z etapów mitozy np. cytokinezy. 3. Modyfikacja struktury 6-MP i 6-TG poprzez wprowadzenie podstawników –SMe i –SEt zwiększa toksyczność substancji 1 i 2 względem C. vulgaris. "-7Rq- '¬®y-A®|yR ª i|J|ªq-Ai ©¥qa-l ª- |²Al R\Rp ¬ªyRa| Ö¸Ryl-^°¤GkJl|J -ªl|y¬AikuR ¬q|k ¥¬yGk|-®k" ^°Xª- |²Al|J|ªl-J-oÔARª¬o²Al|ª¬u Ö¸Ryl|u¥7 -yAol ª|¸¬ªARi|J|ªqlGp }Rª¬ª|t¬ª-t¬R\Rp 7l|q|alA®y¬|pR²q-y¬ o-p|^°lyil7lAolª®| ¥i|J|ªql R |ª¬Aiª|JylRlRyl¥J|i|k J|ªqlp|y |qy¬Ai<= COPYRIGHT'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO )33. → &ARMACEUTYCZNY 0RZEGLD.AUKOWY ¡¤°°U Û"' 1. Collister R., Gilbert W., Ashton D., Wyngaarden J.: Pseudofeedback inhibition of purine synthesis by 6-mercaptopurine ribonucleotide another purine analogues; 1964, J. Biol. Chem. 239, (5), 1560-1563. 2. Polifka J., Friedman J.M.: Teratogen update: azathioprine and 6-mercaptopurine; 2002, Theratology, 56, 240-261. 3. Cara C.J.et al.: Revieving the mechanism of action of thiopurine drugs: towards a new paradigm in clinical practice. 2004, Med. Sci. Monit.; 10, (11); 247-254. 4. Danysz A., Kleinrok Z.: Podstawy farmakologii, Wydawnictwo Volumed, Wrocław 1996, 629-663. &ARMACEUTYCZNY 0RZEGLD.AUKOWY 5. Mithison J.M.: Biologia cyklu komórkowego, PWRiL, Warszawa 1978, 33-65. 6. Gierasimienko Ł.M.: Specifika morfołogiczieskich izmienienij niekotorych wodorosliej w procesie ich razwitia w sinchronnych kulturach. Praca doktorska Inst. Mikrobiologii AN ZSRR, 1974 Moskwa. 7. Prasad R.N., Robins R.K.: Potential Purine Antagonists. VII. The Preparation of Some 7- Methylpurines; 1957, J. Am. Chem. Soc., 79, 6401-6407. 8. Kühl A., Lorenzen H.: Handling and culturing of Chlorella; 1964, Methods in cell Physiology, 1, 159-187. 9. Rabinowitch E.: Fotosyntez, Wyd. Imn. Lit., Moskwa, 1953, 2, 99-132. COPYRIGHT'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO )33.
