Zestaw do izolacji plazmidowego DNA

Nr kat. EM01
Wersja zestawu: 1.2012
Zestaw do izolacji
plazmidowego DNA
www.dnagdansk.com
Nr kat. EM01
I.
PRZEZNACZENIE ZESTAWU
Zestaw EXTRACTME PLASMID DNA przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji
plazmidowego DNA o wysokiej czystości z rekombinantowych szczepów Escherichia
coli. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia
wysokiej wydajności i czystości izolowanego DNA. Produkt przeznaczony jest
wyłącznie do zastosowań badawczo-rozwojowych.
II.
SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU
*Przed pierwszym
50
150
250
3 izolacje
izolacji
izolacji
izolacji
(DEMO)
EM01-050
EM01-150
EM01-250
EM01-D
12,5 ml
37,5 ml
62,5 ml
0,75 ml
Lysis Buffer
12,5 ml
37,5 ml
62,5 ml
0,75 ml
Neutralization Buffer
17,5 ml
52,5 ml
87,5 ml
1,05 ml
Wash Buffer (conc.)*
13 ml
39 ml
65 ml
3,6 ml**
oznaczenie butelki.
Elution Buffer
10 ml
3 x 10 ml
5 x 10 ml
0,6 ml
**Uwaga: w zestawie
DNA Purification Columns
50 szt.
3 x 50 szt.
5 x 50 szt.
3 szt.
Collection Tubes (2 ml)
50 szt.
3 x 50 szt.
5 x 50 szt.
3 szt.
Liczba izolacji
Nr katalogowy
Resuspension Buffer
Wash Buffer należy
dodać odpowiednią
ilość 96–100%
etanolu (informacja
na etykietach oraz
Resuspension Buffer należy przechowywać w temperaturze +4°C. Pozostałe
składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15–25°C). Wszystkie
roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany
stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany zestaw zachowuje
stabilność przez okres minimum 12 miesięcy.
50
150
250
izolacji
izolacji
izolacji
Nr katalogowy
EM01-050
EM01-150
EM01-250
Wash Buffer
13 ml
39 ml
65 ml
Etanol 96–100%
52 ml
156 ml
260 ml
Całkowita objętość
65 ml
195 ml
325 ml
Liczba izolacji
użyciem do roztworu
w poniższej tabeli).
Po dodaniu etanolu
zalecane jest
DEMO (EM01-D)
Wash Buffer zawiera
już etanol.
III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT
pp
pp
pp
pp
pp
pp
pp
etanol 96–100% cz.d.a.
jałowe próbówki wirownicze typu Eppendorf (1,5–2 ml)
pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet
rękawiczki jednorazowe
mikrowirówka z rotorem na probówki o obj. 1,5–2 ml (> 10 tys. rpm)
termoblok lub łaźnia wodna (do 70°C)
worteks
IV. ZASADA IZOLACJI
Procedura oczyszczania plazmidowego DNA przeprowadzana jest z wykorzystaniem
minikolumn wirowniczych, zawierających odpowiednie złoże wydajnie i selektywnie
wiążące kwasy nukleinowe. W procesie izolacji plazmidowe DNA zostaje
uwolnione z komórek bakteryjnych na zasadzie lizy alkalicznej. Następnie lizat
jest neutralizowany, a pozostałości komórkowe wraz z białkami i genomowym
DNA zostają usunięte podczas wirowania. Supernatant zawierający plazmidowe
DNA przenoszony jest do minikolumny ze złożem. Dwuetapowe przemywanie DNA
związanego do złoża minikolumny ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń
i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Oczyszczone DNA eluowane jest
z minikolumny buforem o niskiej sile jonowej (Elution Buffer) lub wodą (pH 7,0–9,0)
i gotowe jest do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii molekularnej
(takich jak PCR, QPCR, sekwencjonowanie DNA, trawienie enzymami restrykcyjnymi,
ligacja DNA itp.) lub może być przechowywane do późniejszego użycia.
V.
KONTROLA JAKOŚCI
Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME PLASMID DNA testowana
jest według wewnętrznych procedur. Wydajność, czystość oraz stabilność
wyizolowanego DNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi
oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego
DNA sprawdzana jest w reakcji PCR, QPCR oraz reakcji trawienia enzymami
restrykcyjnymi.
www.dnagdansk.com
Nr kat. EM01
VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU
Materiał wyjściowy
bakteryjna hodowla płynna
Pojemność złoża
ok. 25 µg DNA
Czas izolacji
ok. 25 minut
Czystość DNA
A 260/A280 = 1,8–2,0
VII. środki ostrożności
pp
pp
pp
pp
pp
Hodowla bakteryjna jest biologicznym materiałem niebezpiecznym
ze względu na zawartość mikroorganizmów potencjalnie patogennych
lub substancji zagrażających zdrowiu, bądź życiu człowieka. Przy pracy
z hodowlami mikroorganizmów należy stosować się do wymogów
dotyczących biologicznych materiałów niebezpiecznych.
Zaleca się przeprowadzać całą procedurę izolacji w komorze II klasy
bezpieczeństwa biologicznego lub przy palniku laboratoryjnym, używać
ochronnej odzieży laboratoryjnej oraz rękawiczek jednorazowych.
Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić
śladów DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami.
Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne
związki w połączeniu z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania
buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem.
W przypadku rozlania cieczy zawierającej mikroorganizmy, zanieczyszczoną
powierzchnię zmyć roztworem detergentu.
VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI
Materiał
Wydajność izolacji i jakość wyizolowanego DNA mogą zależeć od: ilości kopii
(kopijności) plazmidu, ilości komórek w materiale wyjściowym, rodzaju pożywki,
fazy wzrostu, wieku i stanu komórek bakteryjnych. Zaleca się prowadzenie izolacji
DNA ze świeżej, odpowiednio przygotowanej hodowli bakteryjnej, co gwarantuje
najlepsze parametry izolacji. Możliwa jest także ekstrakcja plazmidowego DNA
z mrożonych osadów bakteryjnych. Należy unikać wielokrotnego zamrażania
i rozmrażania materiału przed izolacją. Użycie starej hodowli bądź wielokrotnie
rozmrażanego materiału może skutkować niską wydajnością izolacji oraz słabą
jakością DNA .
Przygotowanie hodowli bakteryjnej
Użycie kolonii ze świeżej hodowli jest istotne w celu uzyskania wydajnej
izolacji plazmidów bez zanieczyszczeń genomowym DNA . Hodowlę bakteryjną
należy odmłodzić poprzez wykonanie posiewu redukcyjnego na podłożu
stałym Luria-Bertani (LB) Agar zawierającym odpowiednie antybiotyki. Po
zakończeniu inkubacji należy pobrać z płytki pojedynczą kolonię bakteryjną,
przenieść do płynnego podłoża LB (z dodatkiem odpowiednich antybiotyków)
i inkubować w 37°C z intensywnym wytrząsaniem (ok. 200 rpm). Inkubację
należy zakończyć, gdy gęstość hodowli osiąga wartość A600 w granicach 2,0–5,0
(12–16 godzin). By zapewnić optymalne warunki mieszania i napowietrzania należy
użyć naczynia o objętości co najmniej 4 razy większej niż objętość hodowli. Można
użyć kolby z przegrodami zwiększającymi mieszanie i napowietrzanie.
Elucja DNA ze złoża
Optymalną objętość buforu elucyjnego (Elution Buffer) należy dobrać w zależności
od ilości materiału użytego do izolacji oraz od wymaganego poziomu stężenia DNA
w eluacie. Zaleca się stosowanie 50–100 μl Elution Buffer. Jeśli pożądane jest otrzymanie
DNA o wysokim stężeniu, objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć nawet do 20 μl.
Należy mieć jednak na uwadze, że obniży to wydajność odzysku DNA . Istotne w tym
przypadku jest dodanie buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża.
W celu uzyskania maksymalnej wydajności elucji DNA , bufor elucyjny należy podgrzać
do 80°C i wydłużyć czas inkubacji złoża z buforem do 10 minut.
Jeśli istotne jest odzyskanie całkowitego DNA z minikolumny można prowadzić elucję
w objętości 200 µl lub większej, spowoduje to jednak znaczne rozcieńczenie próby.
Można także przeprowadzić dodatkową elucję (100 µl). W tym przypadku należy
powtórzyć punkty 12–14 Protokołu izolacji (sekcja XI), umieszczając minikolumnę
w nowej probówce 1,5 ml typu Eppendorf. Elution Buffer nie zawiera EDTA , którego
obecność może przeszkadzać w niektórych reakcjach enzymatycznych.
www.dnagdansk.com
Nr kat. EM01
IX. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
Optymalne parametry izolacji otrzymuje się dla osadów bakteryjnych sporządzonych
z 1,5–3 ml hodowli. W niektórych przypadkach (np. niska gęstość hodowli bakteryjnej,
plazmidy średnio- i niskokopijne) może zaistnieć konieczność zwiększenia objętości
hodowli bakteryjnej.
Izolacja plazmidów wysokokopijnych
(np. pUC, pBluescript®, pGEM®, pJET, pTZ i ich pochodne)
Do izolacji plazmidów wysokokopijnych można stosować osad z hodowli bakteryjnej
o objętości z zakresu 0,5–5 ml. Nie należy przekraczać 5 ml, ponieważ może to
spowodować zatkanie złoża minikolumny, a nie wpłynie na wzrost wydajności.
Izolacja plazmidów średnio- i niskokopijnych
(np. pBR322, pET, pACYC, pSC101 i ich pochodne, kosmidy)
Do izolacji plazmidów średnio- i niskokopijnych można zwiększyć objętości hodowli
bakteryjnej nawet do 10 ml w celu zwiększenia wydajności izolacji. Nie jest
konieczna zmiana objętości buforów stosowanych do izolacji DNA . Uwaga: użycie
większej objętości hodowli (> 10 ml) może spowodować zatkanie złoża minikolumny
i obniżenie wydajności izolacji.
X.
1.
PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI
Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. Nie należy mieszać zbyt
intensywnie buforu Lysis Buffer.
2.
Należy upewnić się czy do Wash Buffer został dodany etanol. Jeśli nie, należy
dodać odpowiednią ilość 96–100% etanolu (ilości podane są na etykietach
oraz w tabeli w sekcji II).
3.
W przypadku wytrącenia osadu w buforach Lysis Buffer, Binding Buffer lub Wash
Buffer, butelkę z roztworem należy ogrzać do temp. 50–60°C (Neutralization
Buffer) lub 37°C (Lysis Buffer, Wash Buffer) i inkubować, aż do całkowitego
rozpuszczenia osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do
temp. pokojowej.
4.
5.
Ogrzać odpowiednią ilość buforu elucyjnego do temp. 70°C.
Należy pamiętać, żeby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp.
pokojowej, jeśli nie zalecono inaczej.
6.
Wszystkie etapy wirowania zostały optymalizowane z wykorzystaniem
mikrowirówki Eppendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach
rpm odnoszą się do tej mikrowirówki.
XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI
1. Zwirować 1,5–3 ml hodowli bakteryjnej przy 5–6 tys. rpm
(3–4 tys. x g) przez 5 min.
Możliwa jest zmiana objętości hodowli bakteryjnej w zakresie 0,5–10
ml. Więcej wskazówek znajduje się w sekcji IX. Przygotowanie próbki.
2. Supernatant zdekantować, a osad bakteryjny dokładnie
zawiesić w 250 µl Resuspension Buffer przez pipetowanie
lub worteksowanie.
Niedokładne zawieszenie osadu może spowodować znaczne obniżenie
wydajności izolacji.
3. Dodać 250 µl Lysis Buffer i wymieszać delikatnie poprzez
kilkukrotne odwracanie probówki.
Należy delikatnie wymieszać zawartość probówki, aby zapobiec
fragmentacji chromosomalnego DNA. Nie worteksować! Po dodaniu Lysis Buffer próbka powinna być całkowicie klarowna,
w przeciwnym razie należy inkubować próbkę w temp. pokojowej 1–2 min.
Nie należy inkubować próbki dłużej niż 5 minut w celu uniknięcia uszkodzenia
superzwiniętej formy CCC plazmidu.
4. Dodać 350 µl Neutralization Buffer i wymieszać delikatnie
poprzez kilkukrotne odwracanie probówki.
Należy delikatnie mieszać próbkę. Nie worteksować!
Zmętnienie roztworu lub wytrącenie białego osadu jest efektem
precypitacji białek i chromosomalnego DNA .
5. Wirować 10 min przy 12–14 tys. rpm (15–21 tys. x g).
6. Ostrożnie przenieść supernatant do minikolumny
umieszczonej w probówce odbierającej. Wirować 1 min
przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g).
Należy uważać, aby przenieść do minikolumny jedynie supernatant
zawierający plazmidowe DNA i nie naruszyć osadu zawierającego
chromosomalne DNA i pozostałości komórkowe.
www.dnagdansk.com
Nr kat. EM01
7. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml).
8. Dodać do minikolumny 600 μl Wash Buffer i wirować 30 s przy
10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g).
9. Wylać przesącz z probówki odbierającej i ponownie umieścić
w niej minikolumnę.
10. Powtórzyć etapy 8–9.
11. Wirować 2 min przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g).
Etap „wirowania na sucho” ma na celu całkowite usunięcie resztek etanolu,
który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych.
12. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej
i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eppendorf.
13. Nanieść 50–100 μl Elution Buffer uprzednio podgrzanego do
temp. 70°C centralnie na złoże w minikolumnie.
Inkubować przez 2 min.
Możliwa jest zmiana objętości buforu elucyjnego w zakresie 20–100 µl.
Więcej wskazówek na temat elucji znajduje się w sekcji VIII. Szczególne
zalecenia i uwagi.
14. Wirować 1 min przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g).
15. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA przechowywać
w temp. +4°C lub -20°C do czasu dalszych analiz.
XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE
Problem
Prawdopodobna
przyczyna
Rozwiązanie
Niska wydajność
izolacji
plazmidowego
DNA.
Materiał
o niskiej zawartości
komórek bakteryjnych.
Zwiększyć objętość hodowli użytej do izolacji. Patrz sekcja
IX. Przygotowanie próbki.
Niecałkowita liza
komórek bakteryjnych.
Patrz Problem „Niecałkowita liza komórek bakteryjnych”.
Do izolacji użyto starej
hodowli bakteryjnej.
Prowadzić hodowlę w podłożu płynnym zawierającym
odpowiednie antybiotyki nie dłużej niż 16 godzin.
Niedodany etanol do
buforu płuczącego.
Upewnić się, że 96–100% etanol został dodany
w odpowiedniej ilości do Wash Buffer.
Niedokładne
zdekantowanie
supernatantu znad
osadu bakteryjnego.
Dokładnie usunąć odwirowaną pożywkę znad osadu
bakteryjnego przy pomocy pipety.
Komórki bakteryjne nie
zawierają plazmidu.
Należy pamiętać o użyciu odpowiednich antybiotyków,
zarówno do hodowli na podłożu stałym, jak i płynnym.
Niecałkowite
przeniesienie lizatu
do minikolumny.
Klarowny supernatant może zostać przelany do
minikolumny, jednak najlepszą wydajność uzyskuje się
przenosząc lizat za pomocą pipety.
Niewłaściwe pH buforu
elucyjnego lub wody
(pH <7,0).
Do elucji użyć Elution Buffer.
Niedokładnie zawieszony
osad bakteryjny
w Resuspension Buffer.
Po dodaniu Resuspension Buffer próbkę należy
worteksować lub pipetować do momentu całkowitego
rozbicia osadu.
Wytrącił się osad
w Lysis Buffer.
W temperaturze poniżej 20°C może wytrącać się osad.
Należy podgrzać bufor w temp. 37°C do momentu
rozpuszczenia osadu, a następnie delikatnie wymieszać
i schłodzić do temp. pokojowej.
Lizat nie jest klarowny.
Należy inkubować próbkę w temp. pokojowej 1–2 min.
Nie należy inkubować próbki dłużej niż 5 min
w celu uniknięcia uszkodzenia superzwiniętej formy
CCC plazmidu.
Do izolacji użyto za dużą
liczbę komórek.
Użyć hodowli o gęstości A600 ≤ 5,0. Do izolacji należy
stosować rekomendowane ilości hodowli bakteryjnej
opisane w sekcji IX. Przygotowanie próbki.
Niecałkowita liza
komórek
bakteryjnych.
www.dnagdansk.com
Nr kat. EM01
Obecność RNA
w próbce.
Nieodpowiednie warunki
przechowywania
Resuspension Buffer.
Resuspension Buffer zawiera RNazę, dlatego powinien być
przechowywany w temp. +4°C.
Obecność
genomowego
DNA w próbce.
Doszło do fragmentacji
genomowego
DNA w trakcie lizy
komórek bakteryjnych.
Nie worteksować próbki po dodaniu Lysis Buffer.
Worteksowanie, a nawet gwałtowne mieszanie
może spowodować fragmentację genomowego DNA
i kontaminację oczyszczanego plazmidowego DNA .
Do izolacji użyto starej
hodowli bakteryjnej.
Prowadzić hodowlę w podłożu płynnym zawierającym
odpowiednie antybiotyki nie dłużej niż 16 godzin.
Zdenaturowane
plazmidowe DNA.
Zbyt długa inkubacja
z Lysis Buffer.
Nie należy inkubować próbki z Lysis Buffer dłużej niż 5 min
przed dodaniem Neutralization Buffer.
Niskie stężenie
DNA w eluacie.
Za duża objętość
Elution Buffer.
Objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć
(sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi).
Wyizolowane
DNA jest
niskiej czystości.
Pominięto jeden z dwóch
etapów płukania.
Izolację należy powtórzyć, pamiętając o obu
etapach płukania.
Niecałkowite wysuszenie
minikolumny z resztek
buforu płuczącego.
Należy zwrócić szczególną uwagę, aby po etapie
„wirowania na sucho” (pkt.11 Protokołu izolacji) nie
pozostały w minikolumnie resztki buforu płuczącego.
Do izolacji użyto starej
hodowli bakteryjnej.
Prowadzić hodowlę w podłożu płynnym zawierającym
odpowiednie antybiotyki nie dłużej niż 16 godzin.
Niedokładne
zdekantowanie
supernatantu znad
osadu bakteryjnego.
Niektóre podłoża zawierają składniki, które mogą
obniżać czystość izolowanego DNA . Do izolacji
plazmidowego DNA polecamy podłoże LB. W przypadku
użycia innych podłoży należy osad zawiesić w buforze
TE lub wodzie przed przystąpieniem do izolacji.
Należy pamiętać o dokładnym usunięciu pożywki znad
osadu bakteryjnego.
Obecność etanolu
w próbce.
Upewnić się, że po etapie „wirowania na sucho” nie
pozostały w minikolumnie resztki buforu płuczącego,
w przeciwnym wypadku należy powtórzyć wirowanie
(pkt. 11 Protokołu izolacji).
Plazmidowe DNA
uległo denaturacji.
Patrz Problem „Zdenaturowane plazmidowe DNA”.
Inhibicja
enzymatycznej
obróbki
wyizolowanego
DNA.
XIII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM
RESUSPENSION BUFFER
Uwaga
H315, H319, H335
P261, P305+P351+P338
NEUTRALIZATION BUFFER
Uwaga
H302, H315, H319
P305+P351+P338
LYSIS BUFFER
Niebezpieczeństwo
H314, H315, H319
P280, P305+P351+P338, P310
BLIRT S.A ., ul. Trzy Lipy 3/1.38, 80–172 Gdańsk, www.dnagdansk.com
T: +48 58 739 61 50 F: +48 58 739 61 51 E: [email protected]
WASH BUFFER
Niebezpieczeństwo
H225
P210
H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu.
H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H335 Może
powodować podrażnienie dróg oddechowych. H336 Może wywoływać uczucie
senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła/
iskrzenia/ otwartego ognia/ gorących powierzchni. Palenie wzbronione. P261
Unikać wdychania pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/ rozpylonej cieczy. P280
Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu /ochronę twarzy.
P305 + P351 + P338. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać
wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo
usunąć. Nadal płukać.
www.dnagdansk.com