Prof. dr hab. inż. Bogusław Król - Wydział Nauk Biomedycznych i

Łódź, 15 lipca 2013r.
Prof. dr hab. inż. Bogusław Król
Zakład Analizy i Technologii Żywności
Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności
Politechniki Łódzkiej
R e c n z j a r oz p r a w y d o k t o r s k i e j
Recenzja, przedłożonej rozprawy doktorskiej Pani Mgr AGATY SARNIAK
pt ,, Badanie wybuchu oddechowego i mitochondrialnej produkcji reaktywnych
form tlenu metodą chemiluminescencji’’, wykonanej w Zakładzie Fizjologii Ogólnej,
Katedry Fizjologii Doświadczalnej i Klinicznej, Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
składa się z oceny poniższych elementów:
1.Wybór i znaczenie tematu rozprawy
2.Bibliogafia i znajomości literatury
3.Uklad pracy i wymagania formalne
4. Zastosowana metodyka badań
5.Sposób rozwiązania problemu naukowego i wnioskowanie
6. Ocena końcowa
Ad 1.Temat rozprawy jest związany z dwoma uniwersalnymi zagadnieniami: po pierwsze
funkcjonowaniem organizmów żywych jako samoutrzymujących się układów, w których w
sposób ciągły zachodzi złożony proces przekształcania różnych postaci energii. Drugim
powszechnym zagadnieniem jest rola analityki chemicznej w opisaniu i poznaniu materii i
przyrodniczych zjawisk, a w tym homeostazy oraz znaczenia reaktywnych form tlenu, jako
niestabilnych indywiduów chemicznych uczestniczących w reakcjach chemicznych
wpływających na metabolizm, funkcjonowanie oraz starzenie się organizmów żywych.
Badania ostatniego trzydziestolecia dostarczyły wiele danych o właściwościach RFT,
możliwości śledzenia ich przemian , powstawania wtórnych produktów reakcji oraz
wpływie RFT na destrukcyjne i obronne procesy w organizmach ludzi i zwierząt . Autorka
w rozprawie doktorskiej podjęła zadanie weryfikacji wykorzystania testu lumiforozależnej
chemiluminescencji krwi pełnej do monitorowania powstawania RTF w trakcie wybuchu
oddechowego oraz do monitorowania mitochondrialnej produkcji RFT, uzależnionej od
zastosowanych inhibitorów łańcucha oddechowego .Zaplanowane badania doświadczalne
miały na celu poszerzenie wiedzy o wykorzystaniu zjawiska chemiluminescencji jako
narzędzia metodycznego w prognostycznych badaniach laboratoryjnych , opartych na
zmienności intensywności produkcji RTF, w szczególności, przez granulocyty
obojętnochlonne w trakcie wybuchu oddechowego. W badaniach wykorzystano
Luminometr 1251, firmy Bio-Orbit Oy z Finlandii i zastosowano zaplanowane procedury
biomedyczne, oparte na wykorzystaniu do badań próbek krwi , osocza i granulocytów oraz
luminolu i lucygeniny , jako luminoforów chemiluminescencji spoczynkowej , a także fMLP
i PMA jako aktywatorów (stymulatorów) produkcji RFT w pomiarach chemiluminescencji
wymuszonej. Praca ma dużą wartość poznawczą i praktyczną w zakresie analityki
biomedycznej a w szczególności w odniesieniu do uwarunkowań pomiarów intensywności
powstawania RFT w granulocytach obojętnochłonnych. Doktorantka podjęła się bardzo
trudnego i ważnego zagadnienia naukowego.
Ad 2.Ocena bibliografii i znajomości literatury
Bibliografia pracy liczy 205 pozycji literaturowych, związanych ściśle z tematyką badań, w
tym 203 cytowanych prac naukowych , opublikowanych w języku angielskim i dwie polskie
pozycje książkowe, w tym monografia Prof. G. Bartosza pt ,, Druga twarz tlenu. Wolne
rodniki w przyrodzie’’, opublikowana przez wydawnictwo PWN w roku 2008.Wiekszość
artykułów została opublikowana w ostatnim piętnastoleciu. Nadto dziesięć pozycji pochodzi z
lat 2012 -2013, a dwanaście z przed roku 1990 .Świadczy to o znacznej atrakcyjności,
aktualności i wagi podjętego tematu. Wykorzystanie cytowanych pozycji literaturowych w
części teoretycznej i dyskusji wyników jest należyte. Jednak autorka nie ustrzegła się wady
jaką jest przypisywanie wielu odsyłaczy do złożonej kwestii poruszonej w jednym zdaniu.
Ad.3.Układ pracy i wymagania formalne
Praca przedłożona do recenzji zawiera 145 stron tekstu łącznie ze spisem literatury. Układ
pracy jest zgodny z wymaganiami pisania rozpraw , opartych na podziale rzeczowym. Praca
składa się z wstępu wraz z przeglądem piśmiennictwa (30 stron), uzasadnienia podjęcia badań
i celu pracy, materiałów i metod (17stron), wyników (45 stron), omówienia wyników i
dyskusji (20stron), wniosków, spisu rycin i tabel oraz streszczenia wraz z abstraktem w
języku angielskim 37 ( stron). Wyniki badań są zebrane w 18 tabelach i przedstawione na 34
rycinach. We wstępie Doktorantka przedstawiła podstawowe określenia i definicje oraz
opisała źródła reaktywnych form tlenu (RFT), ich powstawanie oraz rolę w wybuchu
oddechowym fagocytów. Następnie szczegółowo scharakteryzowała oksydazę NADPH i
opisała budowę mitochondrialnego łańcucha oddechowego, wraz z oddziaływaniem
inhibitorów na jego funkcjonowanie. Krótko opisane zostało zjawisko chemiluminescencji,
zaś szerzej przestawiono mechanizm działania i zastosowanie luminolu i lucygeniny w
pomiarze RFT uwalnianych w wybuchu oddechowym. Szkoda, że Autorka nie opisała
alternatywnych metod pomiaru stężenia uwalnianych RFT, a zwłaszcza anionorodnika
ponadtlenkowego, oznaczanego np. metodą elektronowego rezonansu paramagnetycznego
(EPA) lub metodą sonoluminescencji. W tej części pracy są nieścisłości i drobne błędy,
wskazane w pracy. Dla przykładu Doktorantka we wprowadzeniu, na stronie 1 przedstawiła
nie zbyt udaną charakterystykę RFT. Zastrzeżenie może budzić użyte pojęcie reaktywnych
molekuł zamiast indywiduów chemicznych oraz wskazanie zbyt daleko idącej koegzystencji
pomiędzy organizmami a ,, niebezpiecznymi cząsteczkami”. W miejsce ogólnych rozważań
należało wskazać najważniejsze cechy RFT i ich udział w regulacji funkcji komórki i
wpływie na przebieg procesów fizjologicznych .W dalszej teoretycznej części pracy
zagadnienie powstawania RFT , ich roli w organizmie, zwłaszcza ich produkcję i przemiany
w trakcie wybuchu oddechowego fagocytów, Autorka przedstawiła poprawnie i w
przystępny sposób. Jednakże, w tekście zbyt często występuje
manieryczne sformułowanie
,,skutkuje powstawaniem’’. W opinii recenzenta opis chemiluminescencji należało
poprzedzić wyjaśnieniem zjawiska luminescencji. Luminescencja to właściwość fizyczna
substancji do emitowania światła po wcześniejszym zaabsorbowaniu dawki energii
pochodzącej z innego źródła niż ciepło. Luminescencja jest optycznym promieniowaniem,
powstającym w trakcie przejścia z wyższego stanu wzbudzenia cząsteczki do podstawowego.
Emisja zanika natychmiast po zakończeniu wzbudzenia. Luminescencję można podzielić
m.in., na : bioluminescencję, chemiluminescencję, foto-, radioluminescencje, fluorescencję.
Bio- i chemiluminescencja są zatem zjawiskami emisji promieniowania, wytworzonego, w
wyniku, odpowiednio, niektórych procesów biologicznych lub niektórych reakcji
chemicznych. Z pośród RFT jedynie tlen singletowy osiąga nietrwały stan wzbudzenia, po
czym powraca do stanu podstawowego jako tlen tripletowy , emitując promieniowanie
świetlne. Dodanie charakterystyki zjawiska luminescencji znacznie ułatwiłoby interpretacje
uzyskanych wyników badań. Drobne uchybienia: ryc 8 brak na schemacie zapisu
uwolnionej cząsteczki azotu, oraz mieszane angielskie i polskie nazewnictwo substancji
chemicznych.
W uzasadnieniu podjęcia badań Doktorantka podkreśliła powszechność badanego
zjawiska i znaczenie stresu oksydacyjnego w diagnostyce biomedycznej zwłaszcza z
wykorzystaniem chemiluminescencji zależnej od dwóch najczęściej stosowanych
luminoforów. Wskazała także potrzebę prześledzenie mitochondrialnej produkcji RFT w
trakcie wybuchu oddechowego neutrofili z uwzględnieniem wybranych inhibitorów łańcucha
oddechowego. Zakres pracy z punktu widzenia analitycznego i specyfiki badań został
sprecyzowany w pięciu punktach opisujących sukcesywny model badania zjawiska
chemiluminescencji przed i po zastosowaniu odpowiednich bodźców w układzie
pomiarowym.
Materiały i metody zastosowane w badaniach zostały dokładnie opisane na 17 stronach.
Odczynniki i roztwory zostały przedstawione z podaniem źródła lub w powołaniu się na
odpowiednią pozycję literaturową. W przypadku substancji należało podać statusu czystości ,
a nie jedynie producenta. Sposób przeprowadzenia doświadczeń dotyczących zakresu
wymienionego w celu pracy jest dokładnie przedstawiony. Przygotowanie krwi i jej
składników do badan jest szczegółowo opisane z powołaniem się na dokument źródłowy. W
przypadku oznaczeń z użyciem krwi pełnej brakuje
opisu postępowania , który określono
jako ,,dokładne napowietrzenie’.’ Wyodrębnianie frakcji granulocytów jest żmudną
procedurą, która wydłuża znacznie czas postępowania analitycznego i uzyskania wyniku
końcowego. Można postawić pytania 1), czy taki sposób jest właściwy dla monitoringu i 2)
czy procedury izolowania granulocytów, opracowanej przed blisko 50-laty , nie należałoby
ulepszyć i skrócić? Testy chemiluminescencji pełnej krwi były wykonane według metodyki
zaczerpniętej z danych literaturowych z dopiskiem, po wprowadzeniu modyfikacji własnych.
Powstaje pytanie czego dotyczyły. Pomiary chemiluminescencji badanych próbek
prowadzono z zastosowaniem specjalistycznego luminometru z odpowiednim
oprogramowaniem i urządzeniem współpracującym, co daje podstawę do uzyskania
powtarzalnych i wiarygodnych wyników analiz. Liczba 8-12 powtórzeń pomiarów jest
typowa dla materiału biologicznego. Wyniki analiz poddano jednoczynnikowej analizie
statystycznej w oparciu o analizę wariancji ANOVA i odpowiednich testów weryfikujących.
Rozdział WYNIKI jest podzielony w logiczny sposób na podrozdziały według
zaplanowanej kolejności i zgodnie z zakresem pracy. Wyniki badań, dotyczące różnych
parametrów chemiluminescencji zależnej od luminolu lub luminolu i lucygeniny po
aktywacji ( stymulacji) fMLP , a niekiedy PMA, są przedstawione w postaci estetycznych
rysunków, prawidłowo opisanych z wyszczególnieniem stwierdzonych statystycznie istotnych
różnic dla populacji n=8-10. Rysunkom towarzyszą przykładowe wykresy ilustrujące
dynamikę pomiaru chemiluminescencji , przed i po dodaniu stymulatora produkcji RFT,
zarejestrowanej przez luminometr w czasie 10 minut w odniesieniu do konkretnej serii
doświadczeń. Wykresy kształtem przypominają krzywą Gausa i są podobne do wykresów
rejestrowanych przez fotometry w metodzie FIA ( przepływowo- nastrzykowej analizie).
Wykresy w obydwu metodach są podobnie interpretowane przez obliczenie powierzchni pod
krzywą , maksymalnej wartości sygnału oraz czasu jego wystąpienia . W pomiarach
chemiluminescencji dodatkowo występuje względnie wysoka wartość chemiluminescencji
podstawowej (spontanicznej), która utrudnia interpretacje wyniku. Z tego powodu oraz
biorąc pod uwagę dynamikę tworzenia RFT, można przypuszczać, że głównymi parametrami
różnicującymi mogą być wielkości :przyrost chemiluminescencji całkowitej (tzw.
chemiluminescencja zredukowana) oraz czas wystąpienia sygnału maksymalnego. W pracy
w odniesieniu do wykonanych serii pomiarów sporządzano tabelę porównawczą zawierającą
parametry chemiluminescencji zależnej od luminolu lub chemiluminescencji zależnej od
luminolu i lucygeniny. W przypadku badania chemiluminescencji krwi pełnej uzyskano
zadowalające wyniki dotyczące przydatności diagnostycznej pomiarów przyrostu całkowitej
chemiluminescencji zależnej od luminolu dla określonej objętości badanej próbki krwi( 30μl)
oraz czasu inkubacji 90 min. Podobnie korzystne wyniki uzyskano dla przyrostu
chemiluminescencji całkowitej zależnej od lucygeniny w przypadku neutrofilii
aktywowanych rozcieńczonym roztworem cyjanku potasu oraz w doświadczeniach z użytymi
inhibitorami łańcucha oddechowego oraz apocyniny jako inhibitora NADPH oksydazy
.Wszystkie wyniki,
zamieszczone na rycinach i w tabelach, zostały skomentowane z
uwzględnieniem występujących statystycznie istotnych różnic.
Rozdział OMÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW jest podzielony w logiczny sposób na
podrozdziały według zaplanowanej kolejności i zgodnie z zakresem pracy. Autorka w części
dotyczącej chemiluminescencji jako miernika oksydatywnej aktywności fagocytów wskazała ,
ze jest to metoda zalecana do stosowania przez WHO do kontroli stanu odporności
nieswoistej. Jednakże oznaczenie poszczególnych RFT, zwłaszcza wolnych rodników, jest
bardzo trudne ze względu na ich niezwykle krótki czas istnienia, reaktywność i podatność na
działanie niektórych enzymów .Aktualność tego zagadnienia podnoszą obecnie dość liczne
publikacje w tym względzie. Badania Doktorantki potwierdzają zalety stosowania luminolu
jako najczulszego i powszechnie stosowanego luminoforu w teście wymuszonej
chemiluminescencji zarówno krwi jak i granulocytów. Wykazane w rozprawie blisko
dwukrotnie niższe wartości wymuszonej chemiluminescencji zredukowanej, zależnej od
lucygeniny w porównaniu do luminolu mogą być rozpatrywane jako sumaryczny efekt RFT,
ze względu na zastosowany okres pomiarowy, naturę mechanizmów wzbudzenia obydwu
luminoforów, oraz utrzymywane warunki reakcji w badanym układzie- bez wykluczenia
działania dysmutazy ponadtlenkowej. Świeżo opublikowane dane wskazuję na możliwość
selektywnego oznaczenia anionorodnika ponadtlenkowego z użyciem metylocyprydyny i
zastosowaniem analizatora do ultra słabej chemiluminescencji. W tej części rozprawy w
ferworze dyskusji Doktorantka użyła sformułowań typu ,,wyniki naszych badań, co
wskazywałoby na przyzwyczajenie do realizacji badań zespołowych..
Ad 4 Ocena zastosowanej metodyki badań
Autorka wykazała się bardzo dobrym opanowaniem różnorodnych technik analitycznych ,
w tym biomedycznych, poczynając od jej analizy morfologicznej i pomiaru podstawowych
parametrów, frakcjonowanie na osocze bogato- i ubogopłytkowe po wyodrębnianie
granulocytów obojętnochłonnych. Podstawowy nurt badań dotyczył wykorzystania
luminometru do pośredniego oznaczania RFT we krewi pełnej i neutrofilach , pochodzących
od zdrowych dawców , przez zastosowanie dwóch wybranych luminoforów i dwóch
aktywatorów fagocytozy. Kolejnym doświadczeniem analitycznym było prześledzenie
mitochondrialnej produkcji RFT po zastosowaniu określonych inhibirów łańcucha
oddechowego co ma ważne znaczenie do ustalenia najkorzystniejszych warunków wykonania
testu chemiluminescencji do ewentualnego rozszerzenia jego stosowania w diagnostyce
medycznej. Zastosowane metody są wyjątkowo złożone i czasochłonne, wymagały dużego
nakładu pracy, ale pozwoliły na osiągnięcie dobrych rezultatów w doświadczeniach. Metody
analityczne były właściwie dobrane, a ich wyniki poddane należytej ocenie statystycznej.
.Część metodyczna jest wartościowym osiągnięciem analitycznym Autorki.
Ad.5.Sposób rozwiązania problemu naukowego i wnioskowanie
Przedmiotem badań zgodnie z tematem rozprawy było zbadanie wybuchu oddechowego i
mitochondrialnej produkcji RFT metodą chemiluminescencji zależnej od dwóch luminoforów
z wykorzystaniem wybranych inhibitorów łańcucha oddechowego. Krew i jej pochodne oraz
substancje pomocnicze i ich roztwory zostały prawidłowo dobrane. Na licznym materiale
doświadczalnym i wielkiej liczbie próbek Autorka wykonała badania wymuszonej
chemiluminescencji zależnej od luminolu i lucygeniny w odniesieniu do pełnej krwi i
neutrofili , wyznaczając na tej podstawie 5-6 podstawowych parametrów , przeprowadzonych
testów. W oparciu o badania statystyczne wykazano, że przyrost całkowitej
chemiluminescencji krwi pełnej, po określonym czasie inkubacji, jest najlepiej przystającym
parametrem, charakteryzującym stan oksydacyjny podwyższony przez zastosowanie fMLP,
jako stymulatora RFT. W aspekcie analitycznym badania zostały przeprowadzone
prawidłowo.
Badanie inhibitorów wybranych elementów łańcucha oddechowego granulocytów
obojętnochlonnych wykonywano głównie w celu określenia ich skuteczności oddziaływania
na aktywne centra. Wyniki oddziaływania rotenonu, inhibitora dehydrogenazy NADH, który
blokuje przepływ elektronów pomiędzy ubichinonem a centrum żelazowo-siarkowym i
powoduje zmniejszenie produkcji anionorodnika ponadtlenkowego mogą mieć inspirujące
znaczenie w badaniach bezpieczeństwa stosowania insektycydów. W badaniach Autorki
rotenon , użyty w bardzo niskim stężeniu istotnie obniżał wszystkie podstawowe parametry
chemiluminescencji zależnej od lucygeniny w porównaniu do granulocytów nie poddanych
działaniu inhibitora. Rotenon jest naturalnym insektycydem, otrzymywanym z klębianu, o
silnych właściwościach toksycznych w stosunku do ryb. W związku z z tym bywa stosowany
do ich wybijania , a mniejszych dawkach do odławiania. Ponieważ rotenon jest słabo
wchłaniany w przewodzie pokarmowym człowieka , spożywanie potrutych ryb wydawało
się względnie bezpieczne. W badaniach na zwierzętach okazało się jednak, że zaburzenia
jedynie w obrębie kompleksu oddechowego w mitochondrium mogą prowadzić do
występowania anatomicznych, neurochemicznych i behawioralnych charakterystyk choroby
Parkinsona. Duża wartość poznawcza mają badania dotyczące zbadanego wpływu
oddziaływania apocyniny (4-hydroksy-3-metoksyacetofenonu), inhibitora oksydazy NADPH
na obniżanie podstawowych parametrów spoczynkowej i wymuszonej chemiluminescencji
granulocytów obojętnochłonnych. Jest to interesujące i ważne, jeżeli weźmie się pod uwagę
oddziaływanie polifenoli pokarmowych i ich metabolitów na funkcjonowanie organizmu
człowieka. Rozprawa zawiera osiem szczegółowych wniosków, które w aspekcie
analitycznym są zgodne z celem i zakresem rozprawy. Największa wartość naukową ma
rozprawa w zakresie wykazania , że apocynina jest nie tylko inhibitorem oksydazy NADPH w
komorkach fagocytów, ale działa jako zmiatacz wolnych RFT w komórkach oraz istotnie
hamuje uwalnianie RFT z łańcucha oddechowego..