Ludzkie topoizomerazy jako cel komórkowy współczesnej

&ARM0RZEGL.AUK†
,UDZKIETOPOIZOMERAZYJAKOCELKOMÌRKOWY
WSP̌CZESNEJCHEMIOTERAPII
(UMANTOPOISOMERASESASACELLULARTARGETOFCURRENTCHEMOTHERAPY
$OROTA-AÊKOWSKA
)NSTYTUT0ODSTAW#HEMIIˆYWNOuCI
7YDZIAŒ"IOTECHNOLOGIII.AUKOˆYWNOuCI
0OLITECHNIKA|ÌDZKA
Streszczenie
Doświadczalne określenie związku pomiędzy cytotoksycznym działaniem najstarszego chemioterapeutyku
– kamptotecyny, z zablokowaniem aktywności enzymatycznej topoizomerazy I okazało się punktem zwrotnym
w poszukiwaniu skutecznej broni przeciw nowotworom
Od tego momentu obserwuje się gwałtowny wzrost zainteresowania badaczy udoskonalaniem znanych już leków,
wprowadzanie do klinik ich nowych, skuteczniejszych
analogów, a także syntetyzowanie całkowicie nowych
cząsteczek o odmiennych od dotychczasowych mechanizmach działania. Odkrycie nowych sposobów walki
z rakiem, choćby terapii celowanej, teoretycznie mogłoby
spowodować zmniejszenie zainteresowania naukowców
topoizomerazami, jednak w praktyce klinicznej to inhibitory tych właśnie enzymów nadal pozostają głównym orężem w walce z nowotworami, zarówno w monoterapii jak i
w terapii wielolekowej.
Abstract
Experimental determination of the connection between cytotoxic way of action of the oldest chemotherapeutic agent
– camptothecin, with blocking of the enzymatic activity of
topoisomerase I, turned out to be a turning point in quest
for the effective weapon against cancers. From this moment
a significant increase in the interest of researchers in the
improvement of the already known medicines is being observed, introduction of their new, more effective analogues
into clinics, as well as synthesis of completely new molecules with different from previous mechanisms of action. The
discoveries of new ways to the fight against the cancer, for
instance targeted therapy, theoretically could cause a reduction of interest of scientists in topoisomerases, however in
clinical practice these inhibitors of the very enzymes still
remain the main weapon in the fight against cancers, both
in the monotherapy and in combination therapy.
Słowa kluczowe: topoizomeraza I, topoizomeraza II, mechanizm działania topoizomeraz, inhibitory topoizomeraz
Key words: topoisomerase I, topoisomerase II, mode of
action of topoisomerases, inhibitors of topoisomerases
|p-ql®-Ao-ŸlŸ\¥ypAoRŸªŸp|u}–AR
Topoizomerazy to enzymy komórkowe występujące
w dużej ilości w jądrze komórkowym (w szczególności
w jąderku) oraz w mitochondriach. Odpowiadają one za
usuwanie napięcia torsyjnego powstającego w strukturze
DNA podczas transkrypcji i replikacji, umożliwiając w ten
sposób bezpośredni dostęp polimerazom do kodu genetycznego komórki [4, 5].
Podczas podziałów komórkowych funkcja topoizomeraz polega na rozplątywaniu i fizycznym oddzieleniu od
matrycy nowo zreplikowanej nici DNA, poprzez umożliwienie przejścia nietkniętej nici DNA przez pęknięcie
w podwójnym heliksie [6]. W przypadku braku topoizomeraz, nagromadzenie silnie skręconego i splątanego materiału
genetycznego uniemożliwiłoby zachodzenie niezbędnych
do życia procesów komórkowych, ostatecznie doprowadzając do przedwczesnej śmierci komórki.
Działanie wszystkich rodzajów topoizomeraz oparte jest
na przejściowym przecinaniu jednej lub dwóch nici DNA
poprzez tworzenie kowalencyjnego wiązania fosfodiestrowego pomiędzy resztą tyrozyny z centrum aktywnego enzymu i grupą fosforanową jednego z końców nici DNA [4].
q-˜¬]p-Ao-Ÿ |‚|l®|uR–-®
Opierając się na różnicach w budowie i funkcji, w rodzinie topoizomeraz wyróżnia się dwie główne grupy białek
[5]:
- topoizomerazy typu I,
- topoizomerazy typu II.
Topoizomerazy typu I generują pęknięcie tylko w jednej
nici podwójnego heliksu, tworząc kowalencyjne wiązanie
z grupą fosforanową końca 5’ lub 3’ DNA, w zależności od
tego czy mamy do czynienia odpowiednio z podgrupą IA
czy IB enzymu [4, 7]. Stąd też niekiedy spotkać się można z nazewnictwem I-5’ lub I-3’, tożsamym odpowiednio
z IA lub IB [4]. Głównym zadaniem topoizomeraz typu I jest
relaksacja silnie skręconych cząsteczek DNA, przy czym
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
białka typu IA usuwają napięcie torsyjne z negatywnych superzojów, natomiast enzymy typu IB
– bardzo efektywnie relaksują zarówno pozytywnie jak i negatywnie skręcone cząsteczki DNA [5].
W odróżnieniu od topoizomeraz typu I, które
do swojej aktywności enzymatycznej nie potrzebują zewnętrznego źródła energii, enzymy typu
II do pracy potrzebują energii z hydrolizy ATP.
Topoizomerazy typu II generują przejściowe pęknięcie jednocześnie w obu niciach DNA. Również
tę grupę topoizomeraz podzielono na dwie podgrupy – typ IIA i IIB, wykazujące pewne różnice
w strukturze łańcucha aminokwasowego [4].
RAi-yl®uŸJ®l-t-yl-Ÿ
|‚|l®|uR–-®
W cyklu katalitycznym ludzkiej topoizomerazy I (EC 5.99.1.2.) wyróżnia się pięć etapów
[7]:
1) wiązanie DNA,
2) rozcinanie jednej nici,
3) usuwanie napięcia torsyjnego,
Rys.1. Struktura krystaliczna fragmentu centrum aktywnego ludzkiej topoizo4) religacja (odtworzenie ciągłości nici),
5) odłączenie białka od DNA i przemieszcze- merazy I w kompleksie rozszczepialnym topo I–DNA (cytozyna w pozycji -1)
otrzymana przez Champoux [4], dostępna w Protein Data Bank (ID 1EJ9); zienie na inną cząsteczkę substratu.
lona przerywana linia obrazuje wiązania wodorowe; długość wiązań podano
Topoizomeraza I wiąże się wyłącznie z dwu- w angstremach (Å).
niciowym DNA, co więcej znacznie łatwiej
Ludzka topoizomeraza II (EC 5.99.1.3) posiada dwie
z DNA superhelikalnym, niż z cząsteczką liniową [8]. Rozcięcie jednej nici DNA następuje poprzez atak izoformy – α i β, różniące się między sobą przede wszystnukleofilowy tlenu z grupy hydroksylowej reszty tyrozyny kim poziomem ekspresji w zależności od stanu fizjologiczz centrum aktywnego enzymu (Tyr723) na grupę fosfora- nego komórki, typem oddziaływania z DNA oraz nieznacznową jednego z końców ciętej nici. W przypadku ludzkiej nie masą cząsteczkową [4, 10]. Ekspresja topoizomerazy IIβ
topoizomerazy IB jest to koniec 3’ łańcucha DNA. W skutek jest względnie stała w całym cyklu komórkowym. W przytego ataku powstaje wiązanie fosfodiestrowe pomiędzy resz- padku topoizomerazy IIα obserwuje się gwałtowny wzrost
tą tyrozyny i fosforanem końca 3’ podwójnej helisy – tworzy stężenia tego białka w komórkach aktywnie dzielących się
się tzw. „kompleks rozszczepialny” (ang. cleavable/cleava- – dwa do trzech razy podczas fazy G2/M [10]. Ta właścige complex). Kompleks ten dodatkowo stabilizują wiązania wość topoizomerazy IIα została wykorzystana w projektowodorowe, utworzone pomiędzy resztami aminokwasowy- waniu leków cytotoksycznych.
Mechanizm działania topoizomeraz typu II jest w dużym
mi z centrum aktywnego enzymu (Arg488, Arg590, His632,
Lys532) i wolnymi atomami tlenu grupy 3’ fosforanowej stopniu zbliżony do opisanego wcześniej cyklu katalitycznego topoizomeraz typu I. Homodimery topoizomerazy II
przyłączonej do Tyr723 (Rys. 1.) [4, 9].
Usuwanie napięcia torsyjnego następuję prawdopodob- wiążą się z obiema nićmi DNA (zamiast z jedną, jak w przynie według jednego z dwóch mechanizmów. Jeden z zapro- padku topo I), tworząc kompleks rozszczepialny i generuponowanych modeli zakłada, że koniec nici DNA z wolną jąc podwójne pęknięcie w helisie. Proces wiązania enzymu
grupą 5’-hydroksylową ulega rotacji wokół drugiej nietknię- do DNA również nie wymaga dostarczenia energii z zetej nici DNA (mechanizm wolnej rotacji) [8]. Natomiast we- wnątrz. Zaobserwowano natomiast, że obecność kationów
dług drugiego modelu nienaruszona nic DNA przechodzi dwuwartościowych (zwłaszcza Mg2+) działa pobudzająco
przez rodzaj mostu utworzonego przez topoizomerazę po- na przyłączanie się białka do DNA [10]. Podczas tworzełączoną kowalencyjnie z końcem 3’ i równocześnie nieko- nia kompleksu rozszczepialnego najważniejszą funkcję i tu
walencyjnie z końcem 5’ przeciętej nici DNA (mechanizm pełni katalityczna reszta tyrozyny, a dokładnie dwie reszty
tego aminokwasu – po jednej z obu podjednostek enzymu.
kontrolowanej rotacji) [9].
W kolejnym etapie cyklu katalitycznego ludzkiej topo- Podczas przecinania podwójnego heliksu następuje kowaizomerazy IB następuje religacja DNA. Cykl zamyka odłą- lencyjne przyłączenie obu podjednostek topoizomerazy II
czenie się białka od DNA i przemieszczenie na inną czą- do końca 5’ DNA poprzez utworzenie wiązania fosfotyrozynowego, analogicznie jak w przypadku topoizomerazy I
steczkę substratu [8].
Podobny mechanizm działania prezentują ludzkie topo- [11]. Powstałe zmiany konformacyjne w cząsteczce DNA
izomerazy z podgrupy IA, z tym że rozcinanie jednej nici powodują fizyczne oddalenie od siebie obu nici przecinanej
DNA następuje na skutek przyłączenia enzymu do końca 5’, helisy, formując ten fragment DNA w rodzaj bramy (ang.
G-segment), przez którą „przeciągany” jest (transportowaa nie 3’ jak w przypadku enzymów z podgrupy IB [4].
&ARM0RZEGL.AUK
jące w fazie S mają od 100 do 1000 razy większą
wrażliwość na kamptotecynę niż komórki w fazie
G1 lub G2 [16]. Co więcej okazało się, że stężenie
topoizomerazy I w komórkach nowotworowych
jest o wiele wyższe niż w komórkach zdrowych
[17], nawet 14-16 razy wyższe w komórkach raka
okrężnicy niż w sąsiadujących prawidłowych komórkach śluzówki [18].
Drugą grupę cytostatyków fazowo swoistych
stanowią inhibitory topoizomerazy II, a ściślej
Rys. 2. Schemat wyjaśniający mechanizm przechodzenia fragmentu jednej cząjej izoformy IIα [3, 19].
steczki DNA (T-segment) przez fragment drugiej cząsteczki DNA (G-segment)
Jak już wspomniano wcześniej, stężenie tow cyklu katalitycznym topoizomerazy II, zaproponowany przez Wanga [5]; miejsca wiązania ATP oznaczono gwiazdkami.
poizomerazy IIα zmienia się w trakcie cyklu komórkowego. Podczas podziałów komórkowych,
ny) drugi nietknięty fragment tej samej lub innej cząsteczki
a zwłaszcza w fazie G2 i M, ekspresja topoizomeDNA (ang. T-segment) (Rys. 2.). Ten etap cyklu katalitycz- razy IIα osiąga maksymalne wartości. W komórkach pozonego topoizomerazy II wymaga dostarczenia energii z hy- stających w fazie spoczynkowej (G0) stężenie tego białka
drolizy ATP. Cykl kończy ponowne łączenie wolnych koń- jest nawet 2-3 razy niższe niż w przypadku aktywnych proliców uprzednio uszkodzonego DNA w jedną, dwuniciową feracyjnie komórek [19]. Zatem zdolność topoizomerazy IIα
cząsteczkę [4, 5].
do rozdzielania dwóch splątanych cząsteczek DNA wskaZarówno topoizomerazy I jak i II typu mogą usuwać napięcie zuje jak ważną rolę pełni to białko w organizacji materiału
torsyjne z pozytywnych i negatywnych superzwoi DNA. Nie- genetycznego, a zwłaszcza w segregacji chromosomów.
mniej jednak tylko topoizomerazy II typu potrafią relaksować
Aktywność topoizomerazy IIα wzrasta szczególnie wyzwinięte ze sobą na kształt łańcucha dwie cząsteczki DNA [6].
raźnie w komórkach zmienionych nowotworowo i jest związana z postępującą agresywnością oraz powiększaniem się
yil7l |–¬Ÿ |‚|l®|uR–-®
guza [19]. Dlatego też ta izoforma topoizomerazy II stała się
jednym z najważniejszych, obok ludzkiej topoizomerazy I,
W odpowiedzi na odkrycie, iż celem ataku najstarszego celem współczesnych chemioterapeutyków.
z chemioterapeutyków (kamptotecyny) jest topoizomeraza
Kompleksy rozszczepialne topo IIα – DNA są punktem
I [1] nastąpił gwałtowny wzrost zainteresowania badaczy uchwytu dla leków z grupy antracyklin, aminoakrydyn oraz
tą grupą białek. Prowadzone badania skupiły się wokół po- epipodofilotoksyn (etopozyd, tenipozyd) [3].Mechanizm dziaszukiwań nowych, skuteczniejszych inhibitorów topoizo- łania tych cytostatyków jest w dużej mierze podobny do opisameraz.
nego wyżej mechanizmu działania kamptotecyny i jej pochodNajlepiej poznanymi inhibitorami topoizomerazy I nych. Leki te stabilizują kompleksy rozszczepialne tworzone
jest kamptotecyna i jej analogi, a wśród nich powszechniej przez topoizomerazę IIα i DNA, uniemożliwiając religację nici
stosowane w chemioterapii – topotekan i irinotekan [12- DNA, dochodzi do zatrzymania komórki w fazie G2 i ostatecz14]. Mechanizm cytotoksycznego działania kamptotecyny nie śmierci komórki. Niemniej jednak komórki nowotworowe
i wszystkich jej analogów polega na stabilizacji kompleksu coraz częściej potrafią ominąć problemy związane z zablokorozszczepialnego topo I–DNA. Prowadzi to do zderzenia waniem przez selektywne cytostatyki topo IIα, zwiększając
widełek replikacyjnych z unieruchomionym przez inhibitor ekspresję drugiej izoformy – topoizomerazy IIβ [19].
kompleksem rozszczepialnym i zahamowania dalszej replikacji. Powstanie kompleksu topo I–DNA–lek doprowadza
Poszukiwanie nowych sposobów walki z nowotworami,
do zerwania ciągłości nici, zatrzymania komórek w fazie G2 m. in. wprowadzenie do klinik terapii celowanej, być może
i w konsekwencji apoptotycznej śmierci [15]. Kamptotecy- pociągnie za sobą spadek zainteresowania topoizomerazana i jej analogi wiążą się swoiście w kompleks zarówno z mi. Jednak w praktyce to inhibitory tych właśnie enzymów
topoizomerazą I, poprzez interakcje z katalityczną tyrozyną, nadal pozostają głównym orężem w walce z rakiem, zarówjak i z DNA, ale nie mają powinowactwa do wolnego enzy- no w monoterapii (cytostatyki selektywne) jak i w terapii
mu (nie związanego z DNA), ani też do wolnego DNA [8].
wielolekowej [2, 3]. Dowodem czego są prowadzone na
Drugi, równoległy efekt działania tej grupy leków za- szeroką skalę badania przedkliniczne jak i kliniczne nowych
chodzi w czasie transkrypcji i dotyczy przesuwających się inhibitorów topoizomeraz, takich jak gimatecan, diflomotecząsteczek polimerazy RNA oraz stabilizowanych przez can, edotecarin czy ARC-111 [14, 20].
nie kompleksów rozszczepialnych zlokalizowanych na matrycowym DNA w obrębie rejonu, który aktualnie podlega Piśmiennictwo
transkrypcji. Dochodzi do zatrzymania proliferacji komórek w fazie G1 i uruchomienia aparatu apoptozy, głównie 1. Hsiang YH i wsp. Camptothecin induces protein-linked
w fazie S. Ponieważ stężenie i aktywność topoizomerazy I
DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase I. J
w jądrze jest najwyższa w fazie S cyklu komórkowego, inBiol Chem 1985; 260: 14873-14878.
hibitory topo I określa się jako cytostatyki fazowo swoiste 2. Omyła-Staszewska J, Deptała A. Inhibitory topoizome(ang. S-phase specific), blokujące kompleksy rozszczepialne
razy I – unikalna grupa leków przeciwnowotworowych.
w tej właśnie fazie [2]. Udowodniono, że komórki pozostaWspółczesna Onkologia 2003; 7: 45-53.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
3. Liu WM, te Poele RH. Recent advances and developments in the inhibitors of DNA topoisomerases. Curr
Enzyme Inhib 2007; 3: 161-174.
4. Champoux JJ. DNA topoisomerases: structure, function, and mechanizm. Annu Rev Biochem 2001; 70:
369-413.
5. Wang JC. Cellular roles of DNA topoisomerases: A
molecular perspective. Nat Rev Mol Cell Biol 2002; 3:
430-440.
6. Nitiss JL. Investigating the biological functions of DNA
topoisomerases in eukaryotic cells. Biochim Biophys
Acta 1998; 1400: 63-81.
7. Derlacz R. Informacja genetyczna pod kontrolą – rola
eukariotycznej topoizomerazy I. Postępy Biochem 2001,
47: 243-252.
8. Pommier Y i wsp. Mechanism of action of eukaryotic
DNA topoisomerase I and drugs targeted to the enzyme.
Biochim Biophys Acta 1998; 1400: 83-106.
9. Stewart L i wsp. A model for the mechanism of human
topoisomerase I. Science 1998; 279: 1534-1541.
10. Burden DA, Osheroff N. Mechanism of action of eukaryotic topoisomerase II and drugs targeted to the enzyme. Biochim Biophys Acta 1998; 1400: 139-154.
11. Berger JM, Wang JC. Recent developments in DNA
topoisomerase II structure and mechanism. Curr Opin
Struct Biol 1996; 6: 84-90.
12. Pizzolato JF, Saltz LB. The camptothecins. Lancet 2003;
361: 2235-2242.
13. Li QY i wsp. Review camptothecin: current perspectives. Curr Med Chem 2006; 13: 2021-2039.
14. Teicher BA. Next generation topoisomerase I inhibitors:
Rationale and biomarker strategies. Biochem Pharmacol
2008; 75: 1262-1271.
15. Hsiang YH, Lihou MG, Liu LF. Arrest of replication
forks by drug-stabilized topoisomerase I-DNA cleavable
complexes as a mechanism of cell killing by camptothecin. Cancer Res 1989; 49: 5077-5082.
16. Li LH i wsp. Action of camptothecin on mammalian
cells in culture. Cancer Res 1972; 32: 2643-2650.
17. Husain I i wsp. Elevation of topoisomerase I messenger
RNA, protein, and catalytic activity in human tumors:
demonstration of tumor-type specificity and implications for cancer chemotherapy. Cancer Res 1994; 54:
539-546.
18. Giovanella BC. DNA topoisomerase I-targeted chemotherapy of human colon cancer in Xenografts. Science
1989; 246: 1046-1048.
19. Kellner U. Culprit and victim – DNA topoisomerase II.
Lancet Oncol 2002; 3: 235-243.
20. Basili S, Moro S. Novel camptothecin derivatives as topoisomerase I inhibitors. Expert Opin Ther Pat 2009; 19:
555-574.
Adres do korespondencji:
dr inż. Dorota Mańkowska
Instytut Podstaw Chemii Żywności
Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzka
ul. Stefanowskiego 4/10
90-924 Łódź
tel.: 42 631 34 14
e-mail: [email protected]