+/b

Genetyka dla (trochę)
zaawansowanych II
Komplementacja, interakcje genetyczne I
Komplementacja
Komplementacja
 
 
Wiele mutacji dających taki sam, lub podobny fenotyp
Czy są to mutacje w tym samym genie, czy w różnych
Komplementacja
trans
a
cis
b+
a+
b+
=====
======
a+ b
a
b
Test komplementacji zwany też testem cis-trans:
Tylko w układzie trans da odpowiedź – w układzie cis
zawsze fenotyp dziki
Komplementacja
Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.
Komplementacja
 
 
 
white i cherry to allele tego samego genu
white i garnet to allele w różnych genach
Ile jest genów w tym doświadczeniu? Który gen ma wiele alleli?
Test komplementacji
 
 
Dotyczy alleli recesywnych
Jeżeli heterozygota trans ma fenotyp bliższy
fenotypowi recesywnemu niż hetrozygota cis, to
mutacje są w tym samym cistronie
m1 + m1 m2
>
Silniejszy fenotyp mutanta
+ m2
+
+
 
 
Fenotyp bliższy dzikiemu
Porównanie cis i trans pozwala wykluczyć efekt podwójnej haploinsuficjencji
€ ilości produktów dwóch genów może dać fenotyp, którego nie da
(zmniejszenie
zmniejszenie ilości produktu pojedynczego genu)
Test komplementacji dotyczy funkcji genu, nie daje informacji o pozycji mutacji.
  Stwierdzenie, czy dwie mutacje, ktore nie komplementują są w różnych
miejscach – krzyżówka wewnątrzgenowa
Cistron
 
Eksperymenty Benzera na bakteriofagach
Łysinki fagowe
Cistron
 
Mutacje w obrębie tego samego cistronu nie komplementują
Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.
Mapowanie struktury genu
Delecje w mapowaniu
Mapa obszaru rII faga T4
Odkrycie liniowej struktury genu
Czy test komplementacji może kłamać
 
 
Komplementacja wewnątrzgenowa
Niekomplementacja niealleliczna (SSNC – Second
Site Non-Complementation)
Komplementacja wewnątrzgenowa
 
Dwie mutacje w tym samym genie w układzie trans
komplementują
 
Mutacje w dwóch niezależnych domenach białka
 
 
 
Komplementacja wewnątrzgenowa w genie HIS4 drożdży –
początkowo podejrzewano, że jest to operon
W istocie – kodowany 1 polipeptyd złożony z 3 niezależnych
domen
Najbardziej znany przykład
  α-komplementacja w genie β-galaktozydazy E. coli
14
Komplementacja wewnątrzgenowa
 
Dwie mutacje w tym samym genie w układzie trans
komplementują
 
Transwekcja – jedna z mutacji w elemencie regulatorowym,
który może działać w układzie cis (np. enhancer)
 
Wymaga parowania chromosomów homologicznych w komórkach
somatycznych w interfazie – nie u wszystkich organizmów.
Obserwowane głównie u Drosophila
“Advanced Genetic Analysis: Finding Meaning In A Genome” RS Hawley, MY Walker, Blackwell 2003
15
Niekomplementacja niealleliczna
 
 
 
Second-site non-complementation (SSNC)
Mutacja a jest recesywna, mutacja b w innym genie
też, ale podwójna heterozygota a/+ b/+ ma fenotyp
mutanta
Może być zaliczona do interakcji syntetycznych
16
SSNC typu I
 
Interakcja toksyczna
 
Połączenie zmutowanych produktów genów daje produkt o toksycznych (antymorf)
właściwościach, których nie mają pojedynczo
 
Specyficzne dla alleli w obu genach
 
Allele nie mogą być nullomorfami
 
Bardzo rzadko spotykana
 
Np. geny α i β tubuliny u drożdży
17
Hawley & Gilliland (2006) Genetics 174:5-15
SSNC typu II
 
 
 
 
 
 
Sekwestracja
Białka A i B działają w kompleksie. Heterozygotyczna
mutacja B (+/b) jest recesywna – powstaje
wystaczająca ilość kompleksu AB (50%)
Antymorficzna mutacja A tworzy nieaktywny kompleks
z produktem B.
W heterozygocie (a/+) z dzikimi allelami B powstaje
50% prawidłowego kompleksu
Połączenie heterozygoty (a/+) i (b/+) powoduje, że
zmutowane białko A wyłapuje połowę z pozostałej
połowy białka B- tylko 25% kompleksu aktywnego
Specyficzna dla allelu a, allel b może być null
18
SSNC typu II
 
 
 
19
Heterozygota B2t/+ dysponuje
połową potrzebnej β-tubuliny
(niezależnie od allelu B2t)
Obecność mutanta nc
sekwestruje jeszcze połowę tej
puli w nieaktywny kompleks,
zostaje 25%
Delecja genu nc nie daje tego
efektu – połowa podjednostki α i
połowa podjednostki β może bez
przeszkód się łączyć dając 50%
normalnego poziomu kompleksu
SSNC typu II
 
 
 
 
Dwugenowa retinopatia pigmentowa (retinitis
pigmentosa) u człowieka i myszy
Objawy choroby wyłącznie u złożonych (podwójnych
heterozygot) w genach ROM1 i RDS1
Pojedyncze mutacje rom1 i rds1 recesywne – bez
objawów
Przy obniżonym poziomie ROM1 zmutowane białko
RDS1 nie tworzy prawidłowych homotetramerów
SSNC typu III
 
 
 
 
 
Złożona haploinsuficjencja
Nie wymaga interakcji fizycznej produktów genów
Obniżenie aktywności genów A i B w heterozygotach
pojedynczo nie daje efektu
W podwójnej heterozygocie efekty obniżenia
aktywności obu genów się sumują i pojawia się defekt
Nie jest specyficzna wobec alleli, występuje też dla
alleli null
21
Złożona haploinsuficjencja (SSNC typu III)
 
 
Geny nod i ncd u Drosophila – w podwójnej
heterozygocie defekt mejozy
Systematyczne analizy u drożdży:
 
22
Dla szczepu heterozygotycznego pod względem delecji genu
aktyny znaleziono 208 innych heterozygotycznych delecji,
które w połączeniu dawały defekty morfologii aktyny
Interakcje genetyczne
23
Interakcja genetyczna
 
 
Fenotyp podwójnego mutanta AB nie jest sumą
fenotypów mutacji A i B
Dla ujęcia ilościowego wymagana jest liczbowa miara
fenotypu
 
 
 
Np. czas podziału (czas generacji) – czas wymagany do
podwojenia liczby komórek w hodowli
Ujęcie jakościowe wymaga dobrze zdefinowanych,
dyskretnych (0,1) fenotypów – np. letalność
Epistaza (“epistasis”, Bateson 1909) – jeden z rodzajów
interakcji
 
24
W genetyce populacji przyjęło się nazywanie “epistazą”
wszystkich typów interakcji genetycznych (Fisher, 1918 –
“epistacy”) – terminologia do dzisiaj niejednoznaczna
Interakcje
 
Łagodzące (alleviating interactions)
 
 
Fenotyp podwójnego mutanta lżejszy, niż przewidywany dla
sumowania fenotypów mutantów pojedynczych
Syntetyczne, pogarszające (synthetic, aggravating
interactions)
 
25
Fenotyp podwójnego mutanta cięższy, niż przewidywany dla
sumowania fenotypów pojedynczych mutantów
Interakcje łagodzące
 
Supresja
 
Fenotyp mutacji (a) znoszony przez mutację w innym genie
(b)
 
 
Podwójny mutant ab ma fenotyp dziki lub bliski dzikiemu
Epistaza
 
Fenotyp mutacji (a) maskowany przez mutację w innym
genie (b)
 
26
Podwójny mutant ab ma fenotyp taki sam, jak mutant b – obecność
mutacji b narzuca fenotyp niezależnie od allelu genu a
Interakcje syntetyczne
 
Syntetyczne wzmocnienie
 
 
Syntetyczna letalność
 
 
Fenotyp podwójnego mutanta silniejszy (lub nieoczekiwany)
niż suma fenotypów pojedynczych mutacji
Pojedyncze mutacje nie są letalne, podwójny mutant letalny
Niekomplementacja niealleliczna (SSNC – second-site
non-complementation)
 
27
Dwie recesywne mutacje a i b w podwójnej hetrozygocie
dają fenotyp zmutowany
Supresja
Fenotyp mutacji (a) znoszony przez mutację w innym
genie (b)
  Różne grupy mechanizmów
 
 
Informacyjne
 
 
 
 
 
np. translacyjna supresja mutacji nonsens
Ilościowe
Interakcyjne (“zamka i klucza”)
Zmieniające ten sam szlak
Zmieniające inny szlak
obejście
  zmiana środowiska komórki
  obniżenie/podwyższenie aktywności szlaku antagonistycznego
 
28
Supresja informacyjna
 
 
 
 
 
 
Supresory związane z przekazywaniem informacji
genetycznej (informational suppressors)
Najbardziej znana supresja translacyjna nonsens
Też zmiana transkrypcji, obróbki RNA, stabilizacja
RNA
Z reguły supresja jest specyficzna wobec konkretnego
allelu
Wiele supresorów informacyjnych może działać na
mutacje w różnych genach (np. supresory nonsens)
Przydatne w badaniu ekspresji genu, ale nie w
badaniu funkcji konkretnych genów
29
Supresja nonsense
 
Mutacja w antykodonie tRNA umożliwia rozpoznawanie
jednego z kodonów STOP
 
Czy supresory nonsense powodują powstawanie zbyt długich białek? I co z
oryginalym kodonem?
30
Supresja ilościowa
 
 
 
Mutacja regulatorowa zwiększa ekspresję genu,
kompensując efekt mutacji hipomorficznej
Zwiększenie ilości produktu innego genu kompensuje
brak (lub obniżoną aktywność) produktu genu
Różne mechanizmy
 
 
 
 
Aktywacja ekspresji (mutacja elementów regulatorowych cis
i trans)
Duplikacja genu
Supresja plazmidami wielokopiowymi
Często niezależna od konkretnego allelu
31
Przykład supresji wielokopiowej
 
 
 
 
mtEXO (degradosom) – kompleks 2 białek w
mitochondriach drożdży odpowiedzialny za degradację RNA
Podjednostki: RNaza (Dss1p) i helikaza RNA (Suv3p)
RNaza bez helikazy ma >10x słabszą aktywność, niż w
kompleksie
Delecja genu helikazy suprymowana przez
 
 
 
Nadekspresję (z plazmidu wielokopiowego) genu RNazy
Nadekspresję (z plazmidu wielokopiowego) genu innej helikazy
RNA (Mss116p)
Drożdże są idealnym systemem do poszukiwania tej klasy
supresorów (biblioteki genów na plazmidach
wielokopiowych)
32
Supresja przez interakcję
 
Mechanizm “zamka i klucza” – mutacja supresorowa
zmienia miejsca interakcji tak, by “pasowały” do
zmutowanego białka
 
 
 
Silnie specyficzna wobec allelu
Rzadko spotykana
Uogólniona zmiana (np. wzmocnienie) interakcji
 
 
33
Mutacja supresorowa ogólnie wzmacnia siłę interakcji tak, że
toleruje osłabienie wywołane mutacjami w drugim białku
Często wzajemne (mutacja a supresorem b, a b supresorem a)
Supresja przez interakcję
 
 
 
 
Mutacje ts (wrażliwe na wysoką temperaturę) w
genach ACT1 (aktyna) i SAC6 (fimbryna, białko
wiążące aktynę)
Zmutowane białko Sac6p silniej wiąże aktynę, zarówno
zmutowaną, jak i dziką
Powstają nowe miejsca kontaktu między białkami
Supresja wzajemna
34
Supresja w obrębie tego samego szlaku
 
W tym samym szlaku
o  Jeżeli mutacja jest nullomorfem, to
supresja możliwa tylko przez mutację
genu kodującego białko leżące
poniżej w szlaku.
o  Dla hipomorfów możliwa też
supresja w elemencie leżącym
powyżej (silniejszy sygnał powyżej
kompensuje defekt).
Mutant o podwyższonej aktywości B
35
Supresja w innym szlaku
 
Obejście (bypass)
 
 
 
 
Np. u E. coli mutanty permeazy maltozowej suprymowane przez
mutacje genu permeazy laktozowej – zmutowane białko nabiera
zdolności transportu maltozy
Mutacje odblokowujące (np. przez inaktywację represora)
alternatywną drogę
większość supresji przez nadekspresję
Zmiana środowiska komórkowego
 
Np. defekty genów zaangażowanych w wycinanie intronów w
mitochondriach drożdży suprymowane przez mutacje w genach
kodujących mitochondrialne trasportery jonów Mg2+
 
 
Mg2+ to kofaktor w reakcji splicingu, wzrost stężenia kompensuje
defekty czynników wspomagających reakcję
Przywrócenie równowagi
 
36
Mutacje osłabiające transkrypcję suprymują defekty szlaku
degradacji RNA
Supresja w innym szlaku
 
Zmiana środowiska komórkowego
 
Np. defekty genów zaangażowanych w wycinanie intronów
w mitochondriach drożdży suprymowane przez mutacje w
genach kodujących mitochondrialne trasportery jonów Mg2+
 
 
Mg2+ to kofaktor w reakcji splicingu, wzrost stężenia kompensuje
defekty czynników wspomagających reakcję
Przywrócenie równowagi
 
37
Mutacje osłabiające transkrypcję suprymują defekty szlaku
degradacji RNA
38
wild-type
suv3Δ suv3Δ, su
S e con d a ry d e g ra d a tion rou te s
Accumulation of mis-processed
RNAs and high molecular weight
precursors
De gra d ation
(S u v3p + Dss1p )
Red u c ed tra n scrip tion
(Rp o4 1p supor M tf1p sup)
RNA
S e c on d a ry d e g ra d a ti on rou te s
Normal levels of
correctly processed
transcripts
Degrad ation
(S u v3p + Dss1 p )
RNA
Tra n scrip tion
(Rp o4 1p + M tf1p )
 
S ec on d a ry d e g ra d a ti on rou te s
 
Degra d a ti on
(S u v3 p + Dss1p )
Tra n scrip ti on
(Rp o4 1p + M tf1 p )
Supresja w innym szlaku
Przywrócenie równowagi
Mutacje osłabiające transkrypcję suprymują defekty szlaku
degradacji RNA
Reduced levels of
mostly correctly
processed transcripts
RNA