Oznaczanie azotanów(III) i azotanów(V) w produktach mięsnych

Oznaczanie azotanów(III) i azotanów(V) w produktach mięsnych metodą
spektrofotometryczną
I. Część teoretyczna
Źródło azotanów(V) i azotanów(III) w żywnosci oraz ich działanie toksyczne
Azotany(III) i azotany(V) są solami kwasów azotowych. Związki te występują w
znacznych ilościach
w środkach spożywczych oraz w wodzie. Jest to główne źródło
narażenia człowieka na działanie tych związków. Stosowane są one w produktach
spożywczych jako substancje dodatkowe, jednak znacznie większe zagrożenie zdrowotne
dla człowieka wynika z ich obecności w warzywach. Obecność azotanów(V) w żywności,
szczególnie pochodzenia roślinnego, jest związana głównie ze stosowaniem nawozów
mineralnych, a także obecnoscią w wodach powierzchnowych na skutek wypłukiwania z
nich minerałów, zanieczyszczenia ściekami komunalnymi, przemysłowymi i odchodami
zwierzęcymi, jak również opadów atmosferycznych. Stopień kumulowania azotanów(V) w
warzywach jako składników odżywczych w postaci jonów azotanowych (NO3-) oraz
amonowych (NH4+) jest zmienny i zależy od wielu czynników tj. gatunek i odmiana rośliny,
intensywność nawożenia azotanowego, rodzaj gleby, wilgotność, warunki klimatyczne, czas
wegetacji oraz stopień dojrzałości w czasie zbioru. Duże ilości azotanów(V) zawierają
zwłaszcza te cześci roslin, które biora udział w transporcie substancji odżywczych. Dlatego
warzywa liściaste są bogatsze w azotany(V) niż warzywa korzeniowe, a te z kolei bogatsze
są niż warzywa owocowo-nasienne. Warzywa o długim okresie wegetacji gromadzą mniej
azotanów(V). Do gatunków o małej zdolności kumulacji azotanów(V) należą: bób, fasola,
groch, ogórek, pomidor. Do warzyw w znacznym stopniu magazynujacych azotany(V)
zalicza się: burak, seler, szpinak, rzodkiewkę, sałatę, marchew, kapustę. Najczęściej
zawartość azotanów w tych warzywach miesci się w granicach 250-2000 mg/kg, w
skrajnych przypadkach nawet do 7000 mg/kg. Obecność azotanów(V) w warzywach należy
1
traktować jako zanieczyszczenie, które jest najczęściej wynikiem nadmiernego stosowania
nawozów.
Azotany(III) w świezych warzywach występują w małych ilosciach, ok. kilku mg/kg,
jednak podczas przechowywaniana poprzez ograniczenie dostępu tlenu ich zawartość może
wzrosnać w skutek mikrobiologicznej redukcji azotanów(V) do azotanów(III).
Azotany(V) i azotany(III) występuja również w surowcach pochodzenia zwierzęcego,
do których dostaja się z paszą i wodą pitną.
Azotany(V) i azotany(III) są celowo stosowane w przetwórstwie mięsnym i w
serowarstwie. Nadaja one przetworom mięsnym pożądane właściwości sensoryczne:
charakterystyczna rózową barwę, peklowniczy smak i aromat. Azotany(III) działają
przeciwutleniająco, zmniejszają oporność cieplną przetrwalników bakteryjnych, hamują
rozwój patogennych drobnoustrojów, szczególnie Clostridium botulinum i Clostridium
perfingens.
Aby uniknąć przedawkowania azotanu(III), można go stosowac wyłacznie w postaci
mieszanki z NaCl zawierajacej 0,5-0,6% NaNO2. Polskie normy dopuszczaja stosowanie
azotanów(V) tylko w produkcji kiełbas typu salami, w których zawartośc azotanów(III)
wynosi ponizej 60 mg/kg, a suma zawartosci azotanów(III) i azotanów(V) nie może
przekraczać 600 mg/kg. W pozostałych wędlinach, wyrobach garmażeryjnych i
pasteryzowanych konserwach mięsnych łaczna zawartość azotanów(III) i azotanów(V) nie
może być większa od 125 mg/kg wyrobu, zgodnie z Rozporzadzeniem Ministra Zdrowia z
dnia 19 grudnia 2002 (DzU Nr 21 z dnia 8 lutego 2003, poz.21).
W przemyśle mleczarskim są stosowane azotany(V) w ilosci 20 g/100 dm3 mleka
przy wyrobie serów dojrzewających w celu niedopuszczenia do niepożądanej fermentacji
masłowej i wtórnego wzdęcia serów. W czasie procesu dojrzewania serów azotany(V) są
redukowane do azotanów(III), które powstrzymują niewłaściwą fermentację masłową.
Zgodnie z zaleceniami FAO/WHO, dla azotanów(V) ADI (Acceptable Daily Intake dopuszczalne dzienne spożycie) nie powinno przekraczać 5 mg/kg masy ciała, a dla
azotanów(III) - 0,2 mg/kg.
Azotany(V) należą do związków mało toksycznych i nie stanowią bezpośredniego
zagrożenia dla zdrowia ludzkiego. Zatrucia śmiertelne azotanami(V) są bardzo rzadkie.
Lżejsze zatrucia azotanami(V) powodują podrażnienie błony śluzowej przewodu
2
pokarmowego i w postaci niezmienionej są wydalane z moczem. Część z nich może być
redukowana przez mikroflorę przewodu pokarmowego, głównie E. Coli do azotanów(III),
tlenków azotu, a nawet amoniaku. Przy normalnej kwasowości soku żołądkowego u osób
dorosłych stopień redukcji azotanów(V) jest niewielki. Natomiast u niemowlat szybkość
redukcji azotanów(V) jest znacznie większa z powodu niższej kwasowości soku
żołądkowego (pH 4). Około 25% ogólnej ilości wchłoniętych azotanów(V) przedostaje się z
krwi do śliny, a nastepnie ulega redukcji przez mikroflorę jamy ustnej. W rezultacie 5%
azotanów(V) trafia ponownie do przewodu pokarmowego w postaci azotanów(III).
Zasadnicze toksyczne działanie azotanów(III) spowodowane jest ich właściwościami
utleniającymi prowadzącymi do methemoglobinemii, choroby krwi związanej z
powstaniem nieprawidłowej pochodnej hemoglobiny, której cząsteczka hemu zawiera
żelazo na +3 stopniu utlenienia zamiast na +2 st. utl.. Powoduje to niezdolność do
przyłączania tlenu, a więc także przenoszenia cząsteczek tlenu.
Niedotlenienie organizmu jest wyraźnie widoczne, gdy stężenie methemoglobiny
przekracza 20%, a zgon następuje przy jej zawartości wyższej niż 50%. Pierwsze objawy
zatrucia wystepują po wchłonięciu 1 g azotanów(III), natomiast dawka 4 g jest śmiertelna
dla osoby dorosłej. Objawy zatruć ostrych pojawiają się stosunkowo szybko. Już po 30 min
pojawia się ból brzucha, zaczerwienienie twarzy i skóry, zawroty głowy, sinica, duszność,
spadek ciśnienia krwi aż do wystąpienia zapaści. Krew w tym przypadku posiada barwę
brązową. Jednak ich toksyczne działanie nie ogranicza się jedynie do do zatruć ostrych. W
doswiadczeniach na zwierzętach zaobserwowano, że obecność azotanów(III) i azotanów(V)
może powodować także (i) niedokrwistość poprzez uszkadzające działanie tych związków
na krwinki czerwone i utkanie erytroblastyczne szpiku, (ii) unieczynnienie witaminy B 6,
której niedobór jest pierwotną przyczyną niedokrwistości czy także (iii) zahamowanie
przyrostu masy ciała spowodowane zmniejszonym łaknieniem. Największe zagrożenie
wynika z faktu, że zwiazki te odgrywaja istotne znaczenie w tworzeniu rakotwórczych
związków N-nitrozowych. Reakcje nitrozowania moga zachodzić zarówno w środkach
3
spożywczych jak i w organiźmie człowieka. Kwaśne środowisko żoładka jest szczególnie
sprzyjajace reakcji nitrozowania. Szczególnie wrażliwe na azotany(V) i azotany(III)
pobrane z wodą pitną i żywnością są niemowlęta. Ponadto azotany(III) mogą być w
organiźmie przekształcone w wyniku działania peroksydaz, do rodnika NO2* który jest
czynnikiem o dosyć dużej zdolności mutagennej.
Rodnik NO2* może atakować białka poprzez utlenianie i/lub nitrowanie łańcuchów
bocznych reszt aminokwasowych. Proces ten może skutkować licznymi zaburzeniami
funkcjonowania komórek, a w szerszym ujęciu liczne choroby układu krążenia, choroby
płuc i in.
Stosunkowo niedawno postawiono hipotezę że układ redoks azotyn/azotan może
być w pewnych warunkach (niedobór tlenu w tkankach, pH 7-9) układem z którego
wytwarzany jest w organiźmie tlenek azotu(II). NO jest substancją o ogromnym znaczeniu
biologicznym – jest to cząsteczka sygnałowa regulująca stan mięśni gładkich. Ten typ tkanki
4
mięśniowej znajduje się w ścianach naczyń krwionośnych, ścianach czy śluzówkach
narządów jamistych i przewodów takich jak przewód pokarmowego, oddechowy, czy
okalające pęcherz moczowego czy także drogi rodne
Metody kolorymetryczne oznaczaniaza wartości azotanów(III) i azotanów(V)
Metody kolorymetryczne opieraja się na zdolnosci jonów NO2- i NO3- do tworzenia
barwnych związków z różnymi odczynnikami i polegaja na pomiarze absorbancji
określonej długosci fali światła widzialnego w badanym roztworze. W wyniku reakcji z
kwasem sulfanilowym i N-(1-naftylo)etylenodiaminą powstaje barwnik diazoniowy.
Intensywność czerwono-różowej barwy mierzy się przy długosci fali =538 nm. Oznaczenie
zawartości azotanów(V) przeprowadza się w podobny sposób po uprzedniej redukcji
metalicznym kadmem jonów NO3- do NO2-.
II. Część doswiadczalna
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest określenie zawartości azotanów(V) i azotanów(III) w tkankach
mięsa różnych gatunków zwierząt za pomocą metod kolorymetrycznych z odczynnikiem
Griessa.
Materiał badany:

Produkty mięsne różnego pochodzenia
Szkło, sprzęt laboratoryjny i aparatura:

Kolby miarowe

Pipety automatyczne

Lejek

Kolby stożkowe

Homogenizator

Waga analityczna
5

Spektrofotometr Thermo Scientific Evolution 201
Odczynniki:

Nasycony roztwór tetraboranu sodu Na2B4O7∙10 H2O

Roztwór Carreza II (300 g siarczanu(VI) cynku ZnSO4∙7H2O w 1 dm3 H2O

Roztwór amoniaku NH3 (25% NH3 rozcieńczony 1:4 wodą destylowaną)

Roztwór kwasu solnego HCl (0,1 mol dm-3)

Odczynnik Griessa I (0,6 g kwasu sulfanilinowego i 20 ml kwasu octowego CH3COOH
rozpuszczono w wodzie w kolbie miarowej 100 ml i dodano wody destylowanej do
kreski miarowej)

Odczynnik Griessa II (0,03 g 1-naftyloaminy trzykrotnie ogrzano do wrzenia z 10 ml
wody destylowanej i przesączono)

Roztwór wzorcowy azotanu(III) sodu NaNO2 (g – 10 mg dm-3)
Przygotowanie próbki
Przygotuj 100 g dobrze zhomogenizowanej próbki. Odważ 12,5 g (±0,01 g) próbki na wadze
analitycznej. Umieść próbkę w kolbie miarowej 250 ml, dodaj 5 ml nasyconego roztworu
tetraboranu sodu Na2B4O7·10 H2O i ok. 150 ml gorącej, destylowanej wody. Dobrze
wymieszaj i ogrzewaj na łaźni wodnej (90-100°C) przez 15 minut. Po zakończeniu
ogrzewania dodaj kroplami 1 ml roztworu Carreza II energicznie mieszając. Ochłodź
zawartość kolby. Dodaj wody destylowanej do kreski miarowej. Przesącz zimny
rozcieńczony roztwór do szklanej zlewki. Za pomocą pipety przenieś 20 ml roztworu do
kolby miarowej 100 ml. Dodaj 25 ml rozcieńczonego roztworu amoniaku i 10 ml roztworu
kwasu solnego. Dopełnij zawartość kolby miarowej wodą destylowaną do kreski miarowej.
Oznaczenie azotanów(III)
Zgodnie z wytycznymi w tabeli poniżej, przygotuj roztwory do pomiarów bezpośrednio w
kuwetach. Wymieszaj delikatnie pipetą i pozostaw roztwory na 15 minut. Po upływie tego
czasu zmierz absorbancję roztworów przy długości fali =538 nm, za pomocą
spektrofotometru.
6
Roztwór
odniesienia
Roztwór
kalibracyjny 1
Roztwór
kalibracyjny 2
Roztwór
kalibracyjny 3
Roztwór
kalibracyjny 4
Roztwór
kalibracyjny 5
Roztwór
kalibracyjny 6
Roztwór
kalibracyjny 7
Roztwór
kalibracyjny 8
Roztwór
kalibracyjny 9
Roztwór
kalibracyjny 10
Próbka badana
Vpróbki
[l]
Vazot.(III)
[l]
VGriess I
[l]
250
VGriess II
[l]
250
CNaNO2
[mg dm-3]
˗
Vwody
[l]
500
˗
˗
50
450
250
250
1
˗
100
400
250
250
2
˗
150
350
250
250
3
˗
200
300
250
250
4
˗
250
250
250
250
5
˗
300
200
250
250
6
˗
350
150
250
250
7
˗
400
100
250
250
8
˗
450
50
250
250
9
˗
500
0
250
250
10
500
˗
˗
250
250
˗
A
˗
Opracowanie wyników:
Wykreśl krzywą kalibracyjną, która przedstawia zależność absorbancji od stężenia NaNO2.
Odczytaj z krzywej stężenie jonów azotanowych(III) w próbce i oblicz zawartość
azotanów(III) w wyjściowej próbce produktu mięsnego. Określ czy uzyskane zawartości
mieszczą się w polskich normach.
7