Streszczenie - BIOL-CHEM UWB

UNIWERSYTET W BIAŁYMSTOKU
WYDZIAŁ BIOLOGICZNO-CHEMICZNY
Edyta Monika Nalewajko-Sieliwoniuk
WYKORZYSTANIE ZJAWISKA CHEMILUMINESCENCJI
DO OZNACZANIA POLIFENOLI
W UKŁADACH PRZEPŁYWOWYCH
(streszczenie)
Praca doktorska wykonana
w Zakładzie Chemii Analitycznej
Instytutu Chemii Uniwersytetu w Białymstoku
Promotor pracy:
dr hab. Anatol Kojło, prof. UwB
Recenzenci pracy: prof. dr hab. Krystyna Pyrzyńska (Uniwersytet Warszawski)
dr hab. Joanna Karpińska, prof. UwB
Białystok 2009
Założenia i cel pracy
Polifenole to duża grupa organicznych związków chemicznych z grupy fenoli, posiadających
w cząsteczce przynajmniej dwie grupy hydroksylowe. Są to substancje powszechnie występujące
w świecie roślin i należą do podstawowych składników naszej diety (ich dzienne spożycie szacuje się
na poziomie około jednego grama). Polifenole roślinne ze względu na swoją budowę wykazują silne
właściwości przeciwutleniające i chronią nasz organizm przed skutkami tzw. stresu oksydacyjnego.
Są stosowane jako substancje aktywne wielu preparatów farmaceutycznych, kosmetyków
opóźniających efekty starzenia się skóry, a także jako dodatki do żywności (tzw. żywność
funkcjonalna). Część spośród polifenoli będących przedmiotem przedstawionych w rozprawie badań
to związki biogenne (katecholaminy), które w naszym organizmie pełnią rolę ważnych
neuroprzekaźników i hormonów. Zaburzenia metabolizmu tych związków prowadzą do groźnych
chorób, m.in. nadciśnienia tętniczego i hiperglikemii. Ostatnia grupa badanych związków to proste
fenole polihydroksylowe, które naturalnie występują w wodach powierzchniowych (są produktami
przemiany materii i pochodzą z rozkładu roślin). Zwiększone stężenie tych substancji w środowisku
związane jest z zanieczyszczeniem wód ściekami przemysłowymi. Zanieczyszczona woda nie nadaje
się do celów konsumpcyjnych, ma nieprzyjemny smak i zapach, a jej spożywanie może być groźne
dla zdrowia. Dlatego kontrola zawartości tych związków w środowisku jest ważnym problemem
analitycznym.
Ze względu na wyżej omówione właściwości polifenoli oraz powszechność ich występowania
i znaczenie dla zdrowia człowieka, podstawowym celem niniejszej rozprawy stało się opracowanie
nowych, odpowiednio selektywnych i czułych metod oznaczania tej grupy związków w różnych
próbkach rzeczywistych. Jest to szczególnie trudne zadanie analityczne w przypadku analizy próbek
o bardzo złożonym składzie i zawierających bardzo małe ilości oznaczanych składników.
W ostatnim czasie rosnącym zainteresowaniem analityków cieszą się metody analityczne
wykorzystujące zjawisko chemiluminescencji. Charakteryzują się one bardzo niskimi granicami
wykrywalności, szerokimi zakresami liniowości wykresów kalibracyjnych i nie wymagają
skomplikowanej aparatury. Detekcję chemiluminescencyjną zazwyczaj stosuje się łącznie z techniką
wstrzykowej analizy przepływowej (FIA), która zapewnia wysoką precyzję pomiarów, krótki czas
analizy i umożliwia mechanizację i automatyzację procedur analitycznych. Jest to jednak detekcja
niespecyficzna, w związku z czym podczas analizy materiałów o złożonym składzie łączy się ją online z takimi technikami rozdzielania jak wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)
i elektroforeza kapilarna (CE).
Podstawowym celem rozprawy doktorskiej było opracowanie nowych przepływowych metod
oznaczania substancji należących do różnych grup polifenoli (prostych fenoli polihydroksylowych,
katecholamin oraz fenoli pochodzenia roślinnego) w próbkach rzeczywistych z wykorzystaniem
2
detekcji chemiluminescencyjnej. Badania prowadzono z zastosowaniem techniki wstrzykowej
analizy przepływowej oraz wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu on-line
z przepływowym układem chemiluminescencyjnym. Polifenole oznaczano wykorzystując ich różny
wpływ (wzmacnianie lub osłabianie) na chemiluminescencję powstającą podczas reakcji utleniania
luminolu jodem i heksacyjanożelazianem(III) potasu oraz uczulaną formaldehydem reakcję redukcji
manganu(IV). Przeprowadzone badania miały również na celu wyjaśnienie wpływu analizowanych
związków na chemiluminescencję towarzyszącą reakcji utleniania luminolu oraz redukcji
manganu(IV) oraz praktyczne zastosowanie zaproponowanych metod do ilościowego oznaczenia
polifenoli w preparatach farmaceutycznych, próbkach o matrycy biologicznej (mocz, ekstrakty
roślinne, produkty spożywcze) i środowiskowej (wody naturalne).
Opracowane metody zostały scharakteryzowane pod względem parametrów analitycznych,
a otrzymane wyniki poddano ocenie statystycznej.
Badania własne i omówienie wyników
Reakcja
utleniania
luminolu
jest
jedną
z
najbardziej
wydajnych
reakcji
chemiluminescencyjnych stosowanych w analizie chemicznej. Jest ona wykorzystywana do
ilościowego oznaczania wielu substancji, które w istotny sposób wpływają na zwiększenie lub
osłabienie intensywności emitowanego promieniowania. Opracowane metody oznaczania polifenoli
opierają się na pomiarze zmian chemiluminescencji powstającej w wyniku reakcji utleniania
luminolu za pomocą heksacyjanożelazianu(III) potasu i jodu. Do tej pory opublikowano kilka prac,
w których jod został wykorzystany do utleniania luminolu, żadna z nich nie dotyczy oznaczania
polifenoli. Badania prowadzono z wykorzystaniem techniki wstrzykowej analizy przepływowej
(analiza preparatów farmaceutycznych i ekstraktów roślinnych) oraz wysokosprawnej chromatografii
cieczowej połączonej on-line z przepływowym układem chemiluminescencyjnym (analiza moczu
i wód naturalnych).
Reakcję utleniania luminolu wykorzystano między innymi do opracowania przepływowych
metod oznaczania katecholamin w preparatach farmaceutycznych. Zastosowanie jodu w charakterze
utleniacza luminolu umożliwiło uzyskanie kilkudziesięciokrotnie niższych granic wykrywalności
(0,15 – 0,34 ng/mL) w porównaniu do metody, w której luminol utleniano za pomocą
heksacyjanożelazianu(III) potasu. Obie metody charakteryzują się wysoką powtarzalnością
pomiarów (RSD ≤ 3,03 %, n = 15) i są selektywne w stosunku do związków, które obok analitów są
obecne
w preparatach farmaceutycznych.
Opracowane metody oznaczania
katecholamin
charakteryzuje wysoka dokładność, o czym świadczy ich zgodność z wynikami otrzymanymi
metodami farmakopealnymi, wysoki odzysk wzorca dodanego do preparatu farmaceutycznego oraz
wyniki testu t-Studenta. Biorąc pod uwagę prostotę stosowanych procedur, niski koszt analizy
3
i możliwość oznaczenia ponad 80 próbek w ciągu godziny, zaproponowane metody oznaczania
katecholamin są konkurencyjne w porównaniu do metod chromatograficznych i mogą być zamiast
nich stosowane w laboratoriach kontroli jakości leków.
Konieczność monitorowania śladowych stężeń katecholamin w płynach biologicznych
wymaga stosowania bardzo specyficznych i czułych metod ich oznaczania. Skomplikowany skład
matrycy organicznej powoduje, że oznaczanie katecholamin w moczu i we krwi przeprowadza się
głównie metodami chromatograficznymi stosując czułe techniki detekcji. Dotychczas opracowano
niewiele prac dotyczących zastosowania połączenia HPLC-CL do jednoczesnego oznaczania
śladowych
ilości
polifenoli.
Przyczyną
tego
są
trudności
związane
z
wygaszaniem
chemiluminescencji przez rozpuszczalniki organiczne wchodzące w skład faz ruchomych. Ponadto
z przeglądu literatury wynika, że reakcja utleniania luminolu nie była do tej pory stosowana do
pokolumnowego oznaczania katecholamin w płynach biologicznych. W związku z tym podjęto próbę
wykorzystania zoptymalizowanej wcześniej (w układzie FIA-CL) reakcji utleniania luminolu jodem
jako detekcji pokolumnowej w HPLC do oznaczania śladowych ilości katecholamin w próbkach
moczu. W celu zwiększenia selektywności opracowanej metody anality najpierw wydzielano
z moczu techniką ekstrakcji do fazy stałej, a potem rozdzielano w kolumnie RP-8 stosując elucję
w warunkach izokratycznych. Wadą dotychczas opisanych w literaturze metod HPLC-CL,
wykorzystywanych do jednoczesnego oznaczania katecholamin w próbkach biologicznych, jest
konieczność ich wstępnego przekształcania w pochodne o właściwościach luminescencyjnych.
Opracowana metoda nie wymaga przeprowadzenia procesu wstępnej derywatyzacji analitów
i umożliwia ilościowe oznaczanie katecholamin w próbkach moczu w zakresie stężeń: 5 – 48 ng/mL
(adrenalina), 5 – 72 ng/mL (noradrenalina) i 5 – 96 ng/mL (dopamina) z dobrą dokładnością
i precyzją.
Automatyzacja procedury wstępnego przygotowania próbki do analizy znajduje się w nurcie
obecnych kierunków rozwoju chemii analitycznej. Jest to związane z krótszym czasem oznaczenia
i mniejszym prawdopodobieństwem kontaminacji próbki. Wykorzystując chemiluminescencję
układu luminol-I2 opracowano nową wstrzykowo-przepływową metodę oznaczania ogólnej
zawartości prostych fenoli di- i trihydroksylowych w wodach naturalnych z etapem ich wydzielania
on-line w kolumnie ekstrakcyjnej wypełnionej sorbentem polimerowym Dowex Optipore L493.
Zastosowanie ekstrakcji do fazy stałej umożliwiło usunięcie z badanej próbki wody rzecznej
większości składników przeszkadzających i jednoczesne obniżenie granicy wykrywalności
hydrochinonu z 0,016 ng/mL do 5·10-3 ng/mL. Niestety wysokie stężenie substancji humusowych
(kilkadziesiąt mg na litr) w analizowanej wodzie rzecznej (rzeka Biała, teren miasta Białystok)
uniemożliwiło przeprowadzenie selektywnego oznaczenia sumy fenoli polihydroksylowych. Związki
te ulegały koekstrakcji wraz z fenolami, powodując zwiększenie wysokości uzyskiwanych sygnałów
4
analitycznych. W celu zwiększenia selektywności metody i wyeliminowania interferencji
pochodzących od substancji humusowych, detekcję chemiluminescencyjną w układzie FIA-CL
poprzedzono etapem rozdzielenia analitów on-line w kolumnie chromatograficznej RP-18. Jako fazę
ruchomą zastosowano układ rozpuszczalników metanol:woda (2:98, v:v) z dodatkiem 0,5% kwasu
fosforowego(V). Opracowana metoda charakteryzuje się wysoką precyzją (RSD ≤ 2,69 %)
i dokładnością (średni odzysk wzorców z próbek wody rzecznej wyniósł 97,5 – 98,6 %) oraz
najniższymi wartościami granic wykrywalności spośród dotychczas opisanych w literaturze metod
oznaczania hydrochinonu i pirokatechiny (wynoszą one odpowiednio 0,049 ng/mL i 0,36 ng/mL).
Może być zatem stosowana do jednoczesnego oznaczania śladowych stężeń obu analitów
w obecności dużego nadmiaru substancji humusowych w skomplikowanej matrycy środowiskowej.
Ze względu na wysoką zapadalność ludzi na choroby u podłoża których leży stres
oksydacyjny, obecnie intensywnie poszukuje się nowych surowców roślinnych, które mogą być
bogatym źródłem przeciwutleniaczy. Celem badań, opisanych w kolejnym rozdziale części
doświadczalnej rozprawy, było wykorzystanie zjawiska osłabiania chemiluminescencji układu
luminol-I2 przez pochodne kwasu cynamonowego (kwas kawowy i 6'-kawoiloerigerozyd) do
opracowania wstrzykowo-przepływowych metod oznaczania ogólnej zawartości związków
polifenolowych w roślinie Erigeron acris L (przymiotna ostre, rodzina Astrowate). Roślina ta
powszechnie występuje na terenie całej Polski. Do tej pory stosowana była jedynie w medycynie
ludowej w leczeniu bólu zębów i bólów artretycznych. Badaniami objęto rozfrakcjonowane wyciągi
metanolowe z korzeni, liści i koszyczków E. acris. Na podstawie otrzymanych wyników
stwierdzono, że badana roślina, a w szczególności jej liście i kwiatostany, zawiera duże ilości
polifenolowych przeciwutleniaczy. Może być zatem stosowana w profilaktyce i leczeniu chorób
o etiologii wolnorodnikowej. Ponadto zaobserwowano dodatnią korelację między ogólną zawartością
polifenoli w poszczególnych częściach E. acris a ich aktywnością przeciwutleniającą, którą
oznaczono z zastosowaniem metody spektrofotometrycznej z syntetycznym rodnikiem DPPH•.
Chemiluminescencyjna metoda oznaczania sumy polifenoli w ekstraktach roślinnych (a pośrednio
ich aktywności przeciwutleniającej) realizowana w układzie wstrzykowo-przepływowym jest
szybka, precyzyjna i dokładna. Pod względem wykrywalności i selektywności znacznie przewyższa
parametry analityczne większości dotychczas przedstawionych w literaturze metod, zwłaszcza tych
spektrofotometrycznych.
Celem podjętych w rozprawie badań było także wyjaśnienie wpływu związków
polifenolowych na chemiluminescencję towarzyszącą reakcji utleniania luminolu w środowisku
zasadowym za pomocą K3[Fe(CN)6] i I2. Na podstawie przeprowadzonych badań oraz danych
zawartych w literaturze stwierdzono, że zjawisko osłabiania chemiluminescencji przez badane
związki jest najprawdopodobniej efektem kilku różnych procesów zachodzących w mieszaninie
5
reakcyjnej: konkurencyjną reakcją analitów z zastosowanymi utleniaczami, wychwytywaniem
rodników biorących udział w reakcji utleniania luminolu lub wygaszaniem wzbudzonych jonów
3-aminoftalanu, które są emiterem promieniowania. Zjawisko wzmacniania chemiluminescencji
zaobserwowano jedynie po wprowadzeniu do mieszaniny reakcyjnej roztworów katecholamin.
Polifenole w środowisku zasadowym ulegają reakcji samorzutnego utlenienia pod wpływem tlenu
zawartego w roztworze, podczas której powstają między innymi anionorodniki nadtlenkowe.
Zjawisko wzmacniania chemiluminescencji może być więc spowodowane dodatkowymi ilościami
rodników O2•-, które są generowane w układzie i które biorą udział w chemiluminescencyjnej reakcji
utleniania luminolu. Ponadto, utlenianie katecholamin w środowisku zasadowym prowadzi do
powstawania produktów o właściwościach fluorescencyjnych (trihydroksyindoli). Mogą być one
akceptorami energii wzbudzenia, którą następnie przekazują na aniony kwasu 3-aminoftalowego.
W ostatnim rozdziale części doświadczalnej rozprawy przedstawiono badania związane
z analitycznym wykorzystaniem chemiluminescencji powstającej podczas reakcji utleniania
polifenoli roztworem manganu(IV) w środowisku kwaśnym. Badania te uznano za celowe, ze
względu
na
fakt,
że
odczynnik
ten
jest
od
niedawna
wykorzystywany
w
analizie
chemiluminescencyjnej. Zaproponowane nowe wstrzykowo-przepływowe metody oznaczania
katecholamin i kwasu galusowego, realizowane w układzie mangan(IV)-formaldehyd-analit, pod
względem czułości okazały się być porównywalne z opracowanymi wcześniej metodami oznaczania
tych związków w układzie luminol-I2. Charakteryzują się jednak znacznie szerszym zakresem
liniowości wykresu kalibracyjnego, lepszą odtwarzalnością (RSD ≤ 3,87 %) i dwukrotnie większą
ilością wykonywanych pomiarów w jednostce czasu. Użyteczność opracowanych metod została
potwierdzona w wyniku oznaczania adrenaliny i dopaminy w preparatach farmaceutycznych oraz
sumy związków polifenolowych (w przeliczeniu na kwas galusowy) w różnych produktach
spożywczych (winach, sokach owocowych, naparach różnych gatunków herbaty). Przeprowadzono
również badania, których celem było wyjaśnienie roli jaką związki polifenolowe pełnią
w chemiluminescencyjnej reakcji redukcji manganu(IV).
6