1 METODY OZNACZANIA AKTYWNOŚCI ANTYBIOTYKÓW

Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM
Biotechnologia leków 2016/17
METODY OZNACZANIA AKTYWNOŚCI ANTYBIOTYKÓW
Podstawowe pojęcia:
Antybiotyk
–
substancja
o
aktywności
przeciwdrobnoustrojowej,
wytwarzana
przez
mikroorganizmy, uzyskana na drodze półsyntetycznej lub syntetycznej lecz mająca naturalny
wzorzec.
Chemioterapeutyk – substancja o aktywności przeciwdrobnoustrojowej, uzyskana na drodze
syntetycznej, nie posiadająca naturalnego wzorca.
Oporność:

mikrobiologiczna – oznacza, że dany szczep posiada mechanizm oporności

farmakologiczna – zdolność przeżycia w obecności antybiotyku w stężeniu wyższym niż
jest możliwe do osiągnięcia w warunkach in vivo

kliniczna – pomimo osiągnięcia maksymalnych dawek leku zabicie drobnoustrojów
nie jest możliwe.

krzyżowa – niewrażliwość na wszystkie bądź niektóre antybiotyki należące do tej samej
grupy chemicznej lub grupy niespokrewnionej, gdy miejsca uchwytu dla antybiotyków
znajdują się blisko siebie (np. oporność na linkozamidy i makrolidy)

skojarzona – mechanizmy oporności wynikające z braku przepuszczalności błony
komórkowej lub aktywnego wypompowania leku z komórki, powodujące oporność
na więcej niż jedną grupę chemiczną.
Oporność nabyta - nowa cecha szczepu, która wynika ze zmian w jego materiale genetycznym.
Oporność naturalna jest cechą danego gatunku czy szczepu mikroorganizmów. Może wynikać z:
a) braku w komórce celu (np. receptora) dla danego antybiotyku lub niskiego powinowactwa
do niego, np. oporność Mycoplasma pneumoniae czy Chlamydia pneumoniae na antybiotyki
β-laktamowe
b) wytworzenia alternatywnego szlaku metabolicznego (mechanizm by-pass), np. oporność
na sulfonamidy
c) braku lub utrudnionego transportu antybiotyku przez ścianę komórkową, np. oporność
na makrolidy u Enterobacteriaceae
d) aktywnego usuwania antybiotyku z komórki przez białka transbłonowe do przestrzeni
periplazmatycznej
1
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM
Biotechnologia leków 2016/17
e) wytwarzania enzymów unieczynniających antybiotyk w wyniku jego hydrolizy,
np. β-laktamazy rozszczepiające pierścień β-laktamowy
f) wytwarzania enzymów wprowadzających do cząsteczki antybiotyku podstawniki,
które zmieniają swoistość jego działania, np. O-fosforylacja, N-acetylacja, O-adenylacja
odpowiednich pozycji w cząsteczce anminoglikozydów przez enzymy (kodowane
w
plazmidowym
DNA)
powoduje
inaktywację
antybiotyku,
uniemożliwiając
jego oddziaływanie z rybosomami
MIC (ang. minimal inhibitory concentration) – wartość określająca najmniejsze stężenie leku,
(wyrażone w mg/l), które w warunkach in vitro hamuje wzrost bakterii przy określonej gęstości
inokulum i w określonym czasie.
MBC (ang. minima bactericidial concentration) – wartość określająca najmniejsze stężenie leku,
(wyrażone w mg/l), które w warunkach in vitro powoduje zabicie 99,9% komórek bakteryjnych,
przy określonej gęstości inokulum i w określonym czasie.
Antybiogram – wynik oceny wrażliwości danego gatunku drobnoustroju na działanie określonych
antybiotyków, przeprowadzonej w laboratorium (na szalce Petriego).
Metody określania wrażliwości:
1. Metoda rozcieńczeń (probówkowa) – antybiotyk rozcieńcza się w dowolnym stosunku
z podłożem bulionowym o odpowiednim składzie (przygotowuje się serię rozcieńczeń
antybiotyku),
które
następnie
zaszczepia
się
badanym
szczepem.
Zmętnienie
lub osad w pożywce świadczy o wzroście bakterii. Największe rozcieńczenie antybiotyku (czyli
najmniejsze stężenie), w którym nie wystąpił wzrost przyjmuje się jako MIC. Im mniejsze są
różnice pomiędzy wartościami stężeń antybiotyku w szeregu rozcieńczeń, tym uzyskana
wartość MIC jest bardziej zbliżona do rzeczywistej. Oznaczenie wykonuje się w probówkach
(objętość podłoża wynosi min. 2 ml) lub w płytkach titracyjnych (100 µl).
2. Metoda rozcieńczeń (płytkowa) – antybiotyk rozcieńcza się w upłynnionym podłożu
agarowym, które po zestaleniu zaszczepia się badanymi drobnoustrojami (jedna płytka = jedno
rozcieńczenie antybiotyku). Z użyciem tej samej serii płytek możliwe jest oznaczenie
wrażliwości kilkunastu szczepów jednocześnie.
3. Metoda dyfuzyjna (krążkowa) – dyfuzja antybiotyku z bibułowego krążka do podłoża
agarowego i jego działanie na posiane drobnoustroje. Na płytce ze stałym podłożem metodą
murawkową posiewa się badany szczep, a następnie umieszcza się kilka krążków zawierających
2
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM
Biotechnologia leków 2016/17
antybiotyk. Po inkubacji odczytuje się średnicę stref zahamowania wzrostu wokół krążka,
będącą miarą wrażliwości szczepów na badaną substancję.
Możliwe reakcje oraz typy stref powstających wokół krążka przedstawia poniższa ilustracja:

Oporność – brak sfery zahamowania: bakterie rosną przy samym krążku.

Oporność pośrednia – wąska strefa braku wzrostu wokół krążka.

Wrażliwość – szeroka strefa wokół krążka wolna od wzrostu.

Inaktywacja enzymatyczna – wąska strefa braku wzrostu wokół krążka. W przeciwieństwie
do strefy „pośredniej”, brzeg strefy jest ostro zarysowany i składa się na niego nieco silniejszy
wzrost w postaci pewnych kolonii normalnej wielkości lub większych niż pozostałe.

Działanie selektywne – taki wynik otrzymuje się, gdy inokulum zawiera dwa szczepy różniące się
podatnością na dany antybiotyk. W pobliżu krążka stężenie antybiotyku jest na tyle duże,
że hamuje wzrost obydwu szczepów (wąska strefa wolna od wzrostu). W dalszej odległości
od krążka (mniejsze stężenie antybiotyku) wzrost jednego ze szczepów zostaje zahamowany,
podczas gdy drugi rośnie.

Porównanie z kontrolą – „półstrefa” otrzymana ze szczepem kontrolnym (po jednej stronie krążka)
jest
naprzeciwko
„półstrefy”
dla
szczepu
badanego
(po
przeciwnej
stronie
krążka).
By to uzyskać, szczepy badany i kontrolny wysiewa się na odrębne połówki szalki, a krążek kładzie
się między nimi.

Mutanty oporne – inokulum zawierało niewielki procent komórek zmutowanych zdolnych
do tworzenia kolonii w warunkach hamujących wzrost komórek dzikich. Mutanty zwykle
charakteryzują się opornością na antybiotyk. Istnieje jednak pewien typ mutantów rosnących
jedynie w obecności danego antybiotyku i mutanty te będą również tworzyć kolonie w strefie
wolnej od wzrostu innych komórek bakteryjnych. Przykładem są mutanty zależne od
streptomycyny, które mają takie zmiany w rybosomach, że dopiero w obecności streptomycyny
następują przemiany konformacyjne pozwalające na ich prawidłowe funkcjonowanie.

Zakażenia – inokulum składa się z mieszaniny organizmów, z których przynajmniej jeden jest
oporny na badany antybiotyk.
3
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM
Biotechnologia leków 2016/17

Synergizm – dwa krążki zawierają różne antybiotyki. Strefa zahamowania wzrostu jest większa
niż suma efektów każdego z antybiotyków z osobna. Inaczej mówiąc, działanie tych antybiotyków
jest synergiczne.

Antagonizm – dwa krążki zawierają różne antybiotyki. W tym przypadku jeden z antybiotyków
hamuje aktywność drugiego.
4. Metoda dyfuzyjna (cylinderkowa) – metalowe, szklane lub porcelanowe cylinderki (bez dna) o
znormalizowanych wymiarach (10 mm wysokości, 8 mm średnicy) umieszcza się
na pożywce agarowej z powierzchniowo posianym szczepem wzorcowym i napełnia
roztworami antybiotyku o znanych odpowiednich stężeniach. W czasie inkubacji antybiotyk,
dyfundując do pożywki, powoduje zahamowanie wzrostu drobnoustroju. Wielkość stref
zahamowania
wzrostu
jest
proporcjonalna
do
stężenia
antybiotyku
umieszczonego
w cylinderku.
Czas i temperatura inkubacji płytek z cylinderkami zależne są od właściwości
drobnoustrojów i antybiotyku. Jeżeli mamy do czynienia z antybiotykiem szybko
dyfundującym, płytki umieszcza się w cieplarce tuż po napełnieniu cylinderków.
W warunkach powolnej dyfuzji związku, przygotowane płytki z wypełnionymi cylinderkami
powinny pozostać przez określony czas w niskiej temperaturze.
5. E-testy (ang. Epsilometer tests) – antybiotyk dyfunduje z plastikowego paska, w którym
stopniowo
(gradientowo)
zmienia
się
stężenie
antybiotyku
do
gdzie powierzchniowo posiany został wzorcowy szczep drobnoustroju.
4
pożywki
agarowej,
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM
Biotechnologia leków 2016/17
6. Genotypowanie – kontrola obecności/nabycia genu warunkującego oporność na dany
antybiotyk (PCR), analiza mutacji w obrębie genu oporności (PCR, SSCP, sekwencjonowanie,
hybrydyzacja).
Literatura:
1. Hryniewicz W., Sulikowska A., Szczypa K., Krzysztoń-Russjan J., Gniadkowski M.:
Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i
chemioterapeutyki. Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów.
Centralne Laboratorium Surowic i Szczepionek w Warszawie.
2. Markiewicz Z., Kwiatkowski Z.A.: Bakterie antybiotyki lekooporność. Wydawnictwo Naukowe
PWN, Warszawa 2001.
3. Kędzia W.: Materiały do ćwiczeń z mikrobiologii farmaceutycznej. PZWL, Warszawa 1984.
5