--DRUK 07 Dzieciątkowski str. 485-491

Acta Haematologica Polonica 2008, 39, Nr 3, str. 485–491
PRACA ORYGINALNA – Original Article
TOMASZ DZIECIĄTKOWSKI1,2, MACIEJ PRZYBYLSKI1,2,
AGNIESZKA TOMASZEWSKA3,4, TIGRAN TOROSIAN3,
WIESŁAW WIKTOR JĘDRZEJCZAK3, MIROSŁAW ŁUCZAK1,2
Porównanie dwóch metod ilościowego monitorowania
zakaŜenia wirusem cytomegalii u pacjenta po allogenicznym
przeszczepieniu szpiku z powodu ostrej białaczki szpikowej
Comparison of two qualitative methods used for monitoring of
cytomegalovirus infection in a patient after unrelated bone marrow
transplantation due to acute myeloid leukaemia
1
Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Mirosław Łuczak
Zakład Mikrobiologii, Samodzielny Publiczny Centralny Szpital Kliniczny
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Mirosław Łuczak
3
Klinika Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych, Warszawski Uniwersytet Medyczny
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Wiesław Wiktor Jędrzejczak
4
Klinika Transplantacji Komórek Krwiotwórczych, IHiT w Warszawie
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. BoŜena Mariańska
2
STRESZCZENIE
Objawowe zakaŜenia wywoływane przez CMV dotyczą głównie dzieci i osób z niedoborami
immunologicznymi, u których przebieg infekcji jest często zagraŜający Ŝyciu. Celem pracy było
porównanie dwóch komercyjnych metod biologii molekularnej uŜywanych do ilościowego oznaczania DNA cytomegalowirusa w próbkach surowicy pochodzących od pacjenta poddanego allogenicznemu przeszczepieniu szpiku z powodu ostrej białaczki szpikowej. Uzyskane wyniki
wskazują, Ŝe celowe jest zastosowanie techniki real-time PCR w rutynowej diagnostyce zakaŜeń
CMV. Jej czułość i specyficzność znacząco ułatwiają wykrywanie infekcji o niskim poziomie
wiremii oraz pozwalają na monitorowanie skuteczności leczenia przeciwwirusowego.
SŁOWA KLUCZOWE: Ludzki herpeswirus typu 5 – Przeszczepienie allogenicznego szpiku –
Ostra białaczka szpikowa – Real-time PCR
SUMMARY
Detection of human cytomegalovirus (CMV, HHV-5) DNA in clinical specimens is considered a
base method in current diagnosis of HHV-5 disease. The present study compared two quantitative methods used for diagnosing cytomegalovirus infection in plasma samples of a 28-year-old
man with acute myeloid leukemia after unrelated bone marrow transplantation. Specimens were
tested for the presence of HHV-5 DNA using the real-time PCR CMV Quant Kit and also with
CMV Monitor Test, based on PCR/hybridization/colorimetric detection of the product. Results
from samples containing a low cytomegalovirus load were more accurate with the LightCycler
system than those obtained with the COBAS Amplicor instrument, which underestimated the vi-
486 T. DZIECIĄTKOWSKI i wsp.
ral load of samples containing low DNA copy numbers. These findings underline the value of
novel real-time PCR methods used in the detection of HHV-5 in clinical specimens and monitoring of antiviral therapy.
KEY WORDS: Human herpesvirus 5 – Allogeneic bone marrow transplantation – Acute myeloid
leukaemia – Real-time PCR
ZakaŜenia ludzkim herpeswirusem typu 5 (Human Herpesvirus 5; HHV-5 – znanym powszechnie pod nazwą CMV) są niezwykle często spotykane w populacji (1, 2).
Z tego teŜ powodu zakaŜenia nim stanowią istotny problem dla pacjentów z niedoborami immunologicznymi (2). Do najczęściej obserwowanych objawów klinicznych
wynikających z pierwotnego zakaŜenia lub teŜ reaktywacji endogennego HHV-5 zaliczane są: cytomegalowirusowe zapalenie płuc, zespół mielosupresyjny, nasilenie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD) oraz ułatwianie wtórnych zakaŜeń
bakteryjnych i grzybiczych (2).
Zabieg przeszczepienia allogenicznych komórek krwiotwórczych jest terapią
z wyboru w przypadku wielu chorób rozrostowych układu krwiotwórczego, chorób
limfoproliferacyjnych czy zespołów niewydolności szpiku (3). Jednymi z najpowaŜniejszych powikłań zabiegów przeszczepiania komórek krwiotwórczych są oportunistyczne zakaŜenia wirusowe (4) oraz grzybicze (5).
W prezentowanej pracy przedstawiamy porównanie metod zastosowanych w monitorowaniu potransplantacyjnego zakaŜenia wirusem cytomegalii u pacjenta z ostrą
białaczką szpikową poddanego przeszczepieniu komórek krwiotwórczych uzyskanych
ze szpiku dawcy niespokrewnionego.
OPIS PRZYPADKU
U 28-letniego męŜczyzny na podstawie badania cytologicznego, cytochemicznego
i immunofenotypowego komórek szpiku w dniu 04.02.2005 rozpoznano ostrą białaczkę szpikową typ M4 wg klasyfikacji FAB. Zastosowano chemioterapię indukcyjną
zgodnie z protokołem PALG - 2002 (wg. schematu DA7: daunorubicyna + arabinozyd
cytozyny), uzyskując całkowitą remisję choroby (CR1-18.03.2005). Następnie kontynuowano chemioterapię zgodnie ze standardami leczenia ostrych białaczek (3 cykle
leczenia konsolidującego: jeden cykl HAM i w celu intensyfikacji terapii dwukrotnie:
HD-ARA-C oraz 1 cykl leczenia podtrzymującego). Ze względu na brak zgodnego
spokrewnionego dawcy komórek krwiotwórczych pacjent został zakwalifikowany do
przeszczepienia szpiku od dawcy niespokrewnionego. Badanie immunologiczne biorcy
przed przeszczepieniem wykazało IgG anty-HHV-5 dodatnie, IgM ujemne, natomiast
u dawcy: IgG i IgM anty-HHV-5 ujemne. Po kondycjonowaniu wg schematu BuCy4 +
ATG-Fresenius w dniu 17.11.2005 pacjentowi przeszczepiono w sumie: komórki NC –
1.4 × 108/kg m.c., w tym CD34+ – 2.1 × 106/kg m.c. Jako profilaktykę choroby przeszczep przeciw gospodarzowi stosowano cyklosporynę A od dnia –1 oraz metotreksat
w dniach +1, +3, +6. Okres okołoprzeszczepowy był powikłany zakaŜeniem przewodu
pokarmowego Clostridium difficile i Candida glabrata. Regeneracja układu krwio-
Porównanie dwóch metod zakaŜenia wywoływane przez CMV
487
twórczego przebiegała następująco: WBC > 1.0 × 109/L, w tym ANC > 0.5 × 109/L
osiągnięto w +18 dniu po przeszczepieniu, PLT > 20 × 109/L w +26 dniu, a PLT
>50 × 109/L w +31 dniu po przeszczepieniu. Pacjent został wypisany do domu w +32
dobie po zabiegu przeszczepienia szpiku. Przez cały okres hospitalizacji w rutynowo
wykonywanych badaniach PCR w kierunku wirusa cytomegalii uzyskiwano wyniki
ujemne. Jako profilaktykę przeciwwirusową stosowano acyklowir (6).
W +49 dobie po przeszczepieniu z powodu objawów ostrej choroby przeszczep
przeciw gospodarzowi III° pacjent został ponownie hospitalizowany. Zgodnie ze standardami EBMT zastosowano leczenie metylprednizolonem w dawce 2 mg/kg m.c.
uzyskując ustąpienie objawów GvHD. W kolejnych dobach hospitalizacji u chorego
pojawił się suchy nieefektywny kaszel. W badaniu tomografii komputerowej narządów
klatki piersiowej stwierdzono w dolnych polach obu płuc zagęszczenia miąŜszowe o
charakterze śródmiąŜszowym (09.01.2006), a w kolejnym badaniu o typie szkła
mlecznego mogące odpowiadać etiologii cytomegalowirusowej. Do dnia 10.01.2006
badania PCR w kierunku HHV-5 były ujemne, natomiast wynik dodatni uzyskano po
raz pierwszy w dniu 16.01.2006. Ze względu na współistniejące zapalenie płuc zastosowano leczenie jak w chorobie cytomegalowirusowej za pomocą gancycklowiru w
dawce 5 mg/kg m.c. co 12 godz. i.v. oraz IVIG w dawce 0,4 g/kg m.c./24 h – w sumie
90 g przez cały okres hospitalizacji (6). Z powodu objawów mielotoksyczności (cięŜka
pancytopenia) w dniu 01.02.2006 gancyklowir zastąpiono foskarnetem (6). W dniu
20.02.2006 uzyskano negatywizację wyników badania PCR w kierunku cytomegalowirusa. Po poprawie parametrów morfologii krwi obwodowej i normalizacji obrazu narządów klatki piersiowej w badaniu tomografii komputerowej, pacjenta wypisano do
domu w stanie ogólnym dobrym w +112 dobie po transplantacji. W dniu 20.03.2006
Ryc. 1. Zmiany w obrazie klinicznym u pacjenta po zabiegu allogenicznego przeszczepienia szpiku
Fig. 1. Changes in a patient clinical status over the time after alloBMT
488 T. DZIECIĄTKOWSKI i wsp.
w rutynowo wykonywanych badaniach kontrolnych ponownie stwierdzono reaktywację zakaŜenia cytomegalowirusem – dodatni wynik PCR w kierunku HHV-5 – bez
manifestacji klinicznej. Zastosowano leczenie wyprzedzające foskarnetem (6) uzyskując negatywizację wyników badań po 10 dniach terapii.
Zmiany zachodzące w obrazie klinicznym u pacjenta po zabiegu allogenicznego
przeszczepienia szpiku w okresie okołoprzeszczepowym ukazuje rycina 1 (Rycina 1).
MATERIAŁY I METODY
Do badań wirusologicznych w kierunku HHV-5 otrzymywano surowicę krwi w
odstępach tygodniowych, poczynając od drugiego dnia po przeszczepieniu. Wyniki
były ujemne, aŜ do 61 dnia po przeszczepieniu, gdy metodą PCR otrzymano pierwszy
wynik dodatni. Wykrywalny poziom wirusa utrzymywał się do 91 dnia oraz od 123 do
130 dnia po przeszczepieniu. Do reakcji PCR w kierunku identyfikacji HHV-5 uŜywano po 10 µl całkowitego DNA wyizolowanego przy uŜyciu zestawu High Pure Viral
Nucleic Acid Kit (Roche), zgodnie z procedurą dostarczoną przez producenta. Obecność wirusa oraz ilość jego kopii/ml krwi w próbkach dodatnich określano za pomocą
techniki real-time PCR na aparacie LightCycler 2.0 z uŜyciem nowego testu CMV
Quant Kit (Roche) oraz dodatkowo zestawem CMV Monitor Test (Roche) na aparacie
COBAS Amplicor.
Wszystkie oznaczenia prowadzono w dwukrotnych, niezaleŜnych powtórzeniach.
WYNIKI I OMÓWIENIE
W wyniku amplifikacji DNA izolowanego z surowicy krwi metodą PCR stwierdzono obecność produktów specyficznych dla HHV-5 w próbkach od 61 do 91 oraz od
123 do 130 dnia po przeszczepieniu. Wyniki ilościowe uzyskane za pomocą testów
real-time PCR wskazywały na powolne namnaŜanie się wirusa i wzrost jego miana,
a następnie na spadek liczby kopii wywołany prawdopodobnie zastosowaniem skutecznej terapii przeciwwirusowej (Tabela 1). Podobne rezultaty otrzymano metodą
Tabela 1. Porównanie oznaczeń ilości kopii wirusowego DNA wykonanych za pomocą aparatów
LightCycler 2.0 i COBAS Amplicor
Table 1. Comparison of HHV-5 viral load changes measured with LightCycler 2.0 and COBAS Amplicor
instruments
Doba po przeszczepie/liczba
kopi wirusa na ml krwi
61
68
70
75
78
COBAS Amplicor
(CMV Monitor Test®)
670
1280
1290
1720
1270
LightCycler 2.0
(CMV Quant Kit®)
390
2200
2630
3680
2430
Porównanie dwóch metod zakaŜenia wywoływane przez CMV
82
85
89
91
95
98
102
109
111
117
123
130
133
6700
600
1520
1570
–
–
–
–
–
–
640
670
–
489
9200
450
3350
3840
–
–
–
–
–
–
210
370
–
CMV Monitor, choć w tym przypadku czułość testu była mniejsza, zwłaszcza przy
niskim poziomie wiremii (Tabela 1). Dane te są zgodne ze światowym piśmiennictwem, które uznaje przedział od 50 do 90 dnia po transplantacji za okres największego
zagroŜenia reaktywacją herpeswirusa typu 5 (6, 7).
Uzyskane wyniki wskazują, iŜ obie uŜyte metody ilościowego oznaczania poziomu
HHV-5 mają zbliŜoną wartość diagnostyczną. JednakŜe istotną przewagą real-time
PCR jest jej znacznie mniejsza czasochłonność, podatność na błędy laboratoryjne oraz
koszt wykonania pojedynczego oznaczenia. Diagnostyka z uŜyciem CMV Quant Kit,
poczynając od momentu izolacji DNA do uzyskania wyniku, trwa około 3 godzin, gdy
podobne badanie wykorzystujące aparat COBAS Amplicor i test CMV Monitor zajmuje ponad dzień roboczy.
Badania nad zastosowaniem techniki real-time PCR w diagnostyce zakaŜeń HHV5 prowadzone były od dawna, takŜe i w Polsce. Wykazano w nich uŜyteczność tej
techniki, zarówno w badaniu przesiewowym pacjentów hematologicznych (8), jak i u
biorców przeszczepów komórek krwiotwórczych (9, 10). Pewnym ograniczeniem dotychczas wykonanych badań krajowych było uŜycie testów zaprojektowanych indywidualnie w laboratoriach, zamiast zestawów komercyjnych o pełnej certyfikacji i walidacji zewnętrznej.
Ze względu na wysoką częstotliwość występowania reaktywacji latentnego HHV5 u pacjentów poddanych immunosupresji niezbędne jest stosowanie w rutynowej diagnostyce poprzeszczepowej technik biologii molekularnej. Wykorzystanie w badaniach
laboratoryjnych techniki real-time PCR gwarantuje wykrycie nawet niewielkiej wiremii (7), co umoŜliwia wczesne zastosowanie odpowiedniego leczenia przeciwwirusowego. Jednak decyzja o wdroŜeniu terapii anty-HHV-5 powinna być kaŜdorazowo
podejmowana indywidualnie, zarówno w oparciu o uzyskane dane laboratoryjne, jak i
na podstawie objawów klinicznych występujących u chorego w trakcie wykrywalnej
wiremii. Skuteczność leczenia przeciwko herpeswirusom zaleŜy głównie od nasilenia
replikacji wirusa we krwi (11) i znacząco spada wraz z upływem czasu od początku
zakaŜenia. Wstępne leczenie gancyklowirem powinno trwać minimum 2 tygodnie,
dopiero po tym czasie moŜna rozwaŜać oporność wirusa na stosowany preparat i uŜy-
490 T. DZIECIĄTKOWSKI i wsp.
cie foskarnetu (12). Niezbędne jest więc opracowanie i wdroŜenie skutecznej metody,
która umoŜliwi wykrywanie zmutowanych szczepów cytomegalowirusa wykazujących
zmniejszoną wraŜliwość na stosowane rutynowo analogi nukleozydów.
WNIOSKI
1. Ilościowe badanie DNA HHV-5 jest bardzo przydatne w monitorowaniu i ocenie skuteczności terapii przeciwwirusowej u biorców alogenicznych przeszczepów
komórek krwiotwórczych.
2. Obie porównywane metody słuŜące do ilościowego określania ilości kopii cytomegalowirusa w surowicy krwi mają zbliŜoną wartość diagnostyczną, choć technika
real-time PCR charakteryzuje się większą czułością przy niskim poziomie wiremii.
3. Zastosowanie techniki real-time PCR w rutynowym badaniu HHV-5 u biorców
komórek krwiotwórczych umoŜliwia istotne skrócenie czasu oczekiwania na wynik
oraz ogranicza ryzyko wystąpienia błędów laboratoryjnych.
PIŚMIENNICTWO
1. Davison A, Eberle R, Hayward GS et al: Rozdział: Herpesviruses; w Virus taxonomy - classification and nomenclature of viruses. Eighth report of ICTV. Red. Faquet CM, Mayo MA, Maniloff J,
Desselberger U, Ball LA. Wyd: Elsevier Academic Press, San Diego 2005; 193-212.
2. Boeckh M, Nichols WG: Immunosuppressive effects of beta-herpesviruses. Herpes 2003; 10:
12-16.
3. Ljungman P, Urbano-Ispizua A, Cavazzana-Calvo M at al: Allogeneic and autologous transplantation for haematological disaeses, solid tumours and immune disorders: definitions and current practice in
Europe. Bone Marrow Transplant 2006; 37: 439-449.
4. Parody R, Martino R, Rovira M et al: Severe infections after unrelated donor allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in adults: comparison of cord blood transplantation with peripheral blood
and bone marrow transplantation. Biol Blood Marrow Transplant 2006; 12: 734-748.
5. Saavedra S, Jarque I, Sanz GF et al: Infectious complications in patients undergoing unrelated
donor bone marrow transplantation: experience from a single institution. Clin Microbiol Infect 2002; 8:
725-733.
6. Ljungman P, Reusser P, de la Camara R et al: Management of CMV infections: recommendations from the infectious diseases working party of the EBMT. Bone Marrow Transplant 2004; 33: 10751081.
7. Emery VC: Investigation of CMV disease in immunocompromised patients. J Clin Pathol 2001;
54: 84-88.
8. Grabarczyk P, Brojer E, Nasiłowska B: Ilościowe badanie DNA CMV techniką real-time PCR:
standaryzacja metody i wstępne wyniki u chorych hematologicznych. Acta Haemat Pol 2003; 34: 447457.
9. Grabarczyk P, Brojer E, Nasiłowska B i wsp. UŜyteczność ilościowego badania techniką realtime PCR do wykrywania i monitorowania zakaŜenia cytomegalowirusem po przeszczepieniu allogenicznych komórek krwiotwórczych. Pol Merk Lek 2006; 123: 227-231.
10. Chabros Ł, Przybylski M, Dzieciątkowski T i wsp.: Modyfikacja i optymalizacja metod PCR do
wykrywania regionu MIE ludzkiego herpeswirusa typu 5. Med Dośw Mikrobiol 2008; 60: 79-86.
Porównanie dwóch metod zakaŜenia wywoływane przez CMV
491
11. Garrigue I, Boucher S, Couzi L et al: Whole blood real-time quantitative PCR for cytomegalovirus infection follow-up in transplant recipients. J Clin Virol 2006; 36: 72-75.
12. Niederwieser D: Rozdział: Chronic disorders; w Haemopoetic stem cell transplantation. The
EBMT Handbook 2004. Red. Apperley J, Carreras E, Gluckman E, Gratwohl A, Masszi T. Wyd: Forum
Service Editore, Genoa 2004; 257-268.
Praca wpłynęła do Redakcji 16.01.2008 r. i została zakwalifikowana do druku 26.08.2008 r.
Adres Autora:
dr n. wet. Tomasz Dzieciatkowski
Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny
ul. Chałubińskiego 5
02-004 Warszawa
fax: 022 599 17 78
e-mail: [email protected]