docKamila KLAMECKA
download 
Reklamacja Transkrypt
Kamila KLAMECKA
Optymalizacja real-time PCR Kamila KLAMECKA Plan • • • • • • istota PCR Real-time PCR Stosowane metody Sprzęt Problemy Część eksperymentalna PCR – Polymerase Chain Reaction • Dwuniciowa cząsteczka DNA ulega rozpleceniu • Na matrycy kaŜdej nici powstaje komplementarna ⇒Podczas jednego cyklu ilość DNA podwaja się Rys. z: members.aol.com Real-time PCR • CT – (cycle at threshold) określa moment, w którym aparatura wykrywa produkt • Real-time PCR pozwala śledzić akumulację produktu na bieŜąco Rys. z www.rt-pcr.com Wizualizacja ilości produktu TaqMan Jedno miejsce wiązania sondy dla całej cząstecki DNA Rys. z www.hgbiochip.com SYBR Green SG wiąŜe się niespecyficznie z kaŜdym dwuniciowym fragmentem DNA Porównanie SG i TM • SYBR Green: tani, prosty, niespecyficzny względem sekwencji, ale siła sygnału zaleŜna od długości fragmentu DNA (nie od liczby kopii) • TM – sonda reaguje z DNA ilościowo (sygnał powiązany z liczbą kopii), konieczne projektowanie nowych sond dla kaŜdego produktu => wysoki koszt • tTM – łączy zalety obu powyŜszych: niski koszt i specyficzność tailed-TaqMan Miejsce wiązania sondy przesunięte na „ogon” (poza powielaną sekwencją) umoŜliwia uŜycie uniwersalnej sondy przy amplifikacji róŜnych fragmentów DNA (za: Multiplexed Real-Time PCR Using Universal Reporters,Andreas M. Rickert, Hans Lehrach, and Silke Sperling) Cel pracy • Uzyskanie w małej objętości (200nl) wyników porównywalnych do duŜej (10µl) • Redukcja niespecyficznego sygnału µPCR chip – wymiary pojedynczej studzienki Miniaturyzacja – platforma sprzętowa SciClone - robot Termocykler - schemat Problemy • Dimeryzacja starterów (SYBR Green, tailed TaqMan) ATTCGCTTCTAATG ACGTGGTATAACA • Ciemne brzegi zdjęć Czas ekspozycji 7000 fluorescence intensity 6000 5000 central 4000 edge 3000 peripheral 2000 1000 0 0,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 exposure time Porównanie intensywności fluorescencji dla trzech losowo wybranych punktów w zaleŜności od czasu naświetlania. Czas ekspozycji - c.d. signal ratio central/edge 1,4 1,3 1,2 1,1 1 Dla 5-6 sekund naświetlania znikome róŜnice w jakości sygnału w porównaniu z dłuŜszym czasem. Jest to optymalny czas dla uŜywanej aparatury. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 exposure time [s] signal ratio peripheral/central 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0 1 2 3 4 5 6 7 8 exposure time [s] 9 10 11 Wyniki - 200 nl TM Wyniki – 10 µl TM Wyniki Porównanie wartości CT dla TM w duŜej i malej objętości: Dil1 Dil2 Dil3 Dil4 Dil5 10ul 19 22,6 26,2 30 - 200nl 18 20,7 23,9 27,8 30 Osłabienie sygnału na brzegach 0deg_s12.txt S1 0deg_s12.txt S3 S4 S5 S6 S7 S8 45000-50000 40000-45000 35000-40000 S9 S10 30000-35000 S11 S12 S13 fluorescence intensity S2 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 0 50 100 150 200 well no S14 1 2 3 4 5 6 7 8 S15 9 10 11 12 13 14 15 Intensywność sygnału dla całego chipa – sygnał słabnie w kierunku obrzeŜy 15 łuków odpowiada 15 rzędom studzienek na chipie 250 Osłabienie sygnału na brzegach 45000 1 2 3 4 5 6 7 8 43000 S2 41000 S3 40000-45000 S4 35000-40000 S5 30000-35000 fluorescence intensity S1 39000 37000 35000 S6 33000 S7 31000 29000 0 10 20 30 40 50 60 well number Przezroczysty chip (7x8); 0,5µM FAM; czas naświetlania: 0,5sec. Ten sam wzór sygnału => spadek intensywności nie jest spowodowany zacienianiem Podsumowanie • Obiecujące wyniki w 200 nl • Platforma sprzętowa wymaga dalszej optymalizacji • Zwieńczona sukcesem optymalizacja pozwoli na ponad 22-krotne zmniejszenie kosztów analizy metodą PCR
