Streszczenie pracy magisterskiej „Znaczenie biologiczne i

Streszczenie pracy magisterskiej
„Znaczenie biologiczne i zastosowania agregujących syntetaz aminoacylo-tRNA”
Autor: Paweł Laskowski
Promotor: dr D. Allan Drummond (Uniwersytet w Chicago)
dr Radosław Stachowiak (Uniwersytet Warszawski)
Jedną z odpowiedzi komórek eukariotycznych na szok cieplny jest tworzenie
cytoplazmatycznych granul składających się ze zagregowanych białek i RNA. W zgłoszonej pracy
magisterskiej wyselekcjonowano grupę białek, które mogą odgrywać ważną rolę podczas
powstawania granul szoku cieplnego w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Szczególnie zgłębiono
właściwości kompleksu AME zbudowanego z metionylo- i glutamylo-tRNA syntetazy (Mes1 i Gus1)
oraz kofaktora Arc1. Kompleks AME agreguje w podwyższonej temperaturze zarówno in vivo jak i in
vitro nie tracąc przy tym swoich właściwości enzymatycznych, co sugeruje, że nie jest to klasyczna
denaturacja termiczna. Wszystkie trzy białka kompleksu składają się z dwóch domen: N-końcowa
odpowiedzialna jest za oddziaływanie z białkami kompleksu oraz C-końcowa, która wiąże tRNA i łączy
je z odpowiednim aminokwasem.
Odkryliśmy, że to N-końcowa domena białka Gus1 (Gus1N) jest w pełni odpowiedzialna za
właściwości agregacyjne Gus1. Gus1N tworzy znacznych wielkości agregaty białkowe (rzędu kilku µm),
które można łatwo oddzielić od reszty roztworu za pomocą wirowania. Bazując na tym odkryciu
zaprojektowaliśmy nową metodę oczyszczania białek o roboczej nazwie Fenex – skrótowca od trzech
niezbędnych kroków w tej metodzie: Fuse, ENtrap, EXpel (ang. połącz, zwiąż, uwolnij).
Oczyszczanie białek jest jedną z podstawowych technik biologii molekularnej. Jest kluczowe
podczas badania struktur, funkcji i innych właściwości pojedynczych białek. Technika ta polega na
oddzieleniu konkretnego białka z mieszaniny tysięcy innych wykorzystując jego właściwości
biochemiczne i specyficzne powinowactwo pomiędzy białkiem, a złożem. Najczęściej stosowaną
metodą, zwłaszcza, jako pierwszy krok oczyszczania, jest znakowanie białek sekwencjami kilku
histydyn i izolowanie ich na złożu z jonami niklu. Pomimo swojej popularności chromatografia
powinowactwa ma kilka ograniczeń: ładowanie i płukanie złoża jest czasochłonne, zwykle można
oczyszczać tylko jedno białko na złożu, natomiast zautomatyzowane systemy chromatografii cieczowej
są kosztowne.
Opracowana metoda przezwycięża te ograniczenia. Fenex opiera się na nadekspresji
oczyszczanego białka w fuzji z Gus1N. Pomiędzy tymi białkami znajduje się sekwencja cięcia dla
specyficznej proteazy – TEV. Pierwszym krokiem jest uzyskanie zwirowanego lizatu bakteryjnego,
który następnie poddaje się 10-cio minutowej inkubacji w łaźni wodnej o temperaturze 48°C. Prowadzi
to do agregacji wszystkich wrażliwych na temperaturę białek w lizacie, w tym konstruktu Gus1Noczyszczane białko. Dalej, usuwamy roztwór znad osadu, a osad zawieszamy w roztworze
zawierającym konstrukt proteaza TEV-Gus1N. Podczas tej inkubacji oczyszczane białko jest
specyficznie oddzielone od zagregowanych domen Gus1N. Następnie powtarzamy etap inkubacji w
łaźni wodnej i wirowania, co powoduje agregację proteazy TEV i ponowne zatrzymanie w osadzie
zagregowanych domen Gus1N i innych wrażliwych na temperaturę białek. W roztworze nad osadem
znajduje się czysta frakcja oczyszczanego białka, specyficznie odciętego od agregatów.
Podczas projektu magisterskiego stworzyłem osiem konstruktów genetycznych białek o różnej
funkcji i pochodzeniu dla porównania wydajności oczyszczania tychże białek dwoma metodami:
wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) na złożu niklowym oraz nowoopracowanej
metody Fenex. Wszystkie konstrukty miały sekwencję histydyn na jednym końcu, a następnie domenę
Gus1N oddzieloną od oczyszczanego białka sekwencją cięcia dla proteazy TEV. Białka były
nadprodukowane w Escherichia coli, po czym lizat bakterii był podzielony na dwie części, aby
wiarygodnie porównać efektywność oczyszczania.
Sześć z ośmiu zaprojektowanych białek udało się z sukcesem oczyścić za pomocą metody
Fenex. Najbardziej uderzająca była różnica w czasie potrzebnym do ukończenia oczyszczania. W
przypadku metody Fenex trwało to dwukrotnie krócej (3,5 godziny) niż podczas oczyszczania na
kolumnach niklowych (7 godzin). Następnie porównano wydajność oczyszczania oraz stopień
zanieczyszczenia ostatecznej frakcji. W dwóch przypadkach uzyskano wyższą wydajność oczyszczania
metodą Fenex, natomiast w czterech skuteczniejsza okazała się standardowa metoda
chromatograficzna. Czystość końcowej frakcji pięciokrotnie była wyższa dla oczyszczania na złożu
niklowym, a dla jednego białka czystszą frakcję uzyskano metodą Fenex. Różnica w stopniu
zanieczyszczenia końcowych frakcji była jednak niewielka i, poza jednym przypadkiem, nie
przekraczała 10 %.
Nie można zapominać o tym, że istotnym ograniczeniem naszej metody jest konieczność
inkubacji mieszaniny białek w 48°C. Dla wielu użytkowników będzie to zdecydowany argument
przeciwko tej technice. Jednakże, w ramach dalszych prac nad projektem, opracowano wariant tej
metody, który pozwala na ominięcie etapu szoku cieplnego na oczyszczanym białku. Mamy również
nadzieję, że prace nad poprawieniem efektywności cięcia proteazą zwiększą ogólną wydajność
oczyszczania Fenex. Warte podkreślenia jest to, że Fenex pozwala na oczyszczanie wielu białek
jednocześnie, a jedynym sprzętem laboratoryjnym niezbędnym do korzystania z tej metody jest
wirówka i łaźnia wodna.
Podsumowując, w toku projektu magisterskiego zaprojektowano metodę oczyszczania białek,
która po pół roku optymalizacji dawała zbliżone rezultaty do metody optymalizowanej na całym
świecie przez ostatnie 40 lat. Wyniki naszych badań udowadniają, że Fenex może być równie dobrą
metodą dla początkowego oczyszczania, co His-tag i złoże niklowe. Daje to nadzieję, że dalsze prace
nad tą techniką pozwolą na uzyskanie jeszcze lepszych wyników, pokonując przy tym ograniczenia
oczyszczania białek na kolumnach chromatograficznych.
Praca została wykonana podczas rocznego stypendium magisterskiego na Uniwersytecie w
Chicago, w laboratorium dr. Allana Drummonda. Część pracy opisana w pierwszym paragrafie została
opublikowana w zeszłym roku w czasopiśmie Cell, natomiast część aplikacyjna pracy jest elementem
zgłoszenia patentowego PCT. Nasze odkrycie jest obecnie w fazie testów w dwóch międzynarodowych
koncernach biotechnologicznych.