Zastosowanie wybranych komercyjnych testów

PRACA ORYGINALNA
Aleksandra Safianowska, Renata Walkiewicz, Patrycja Nejman-Gryz, Hanna Grubek-Jaworska
Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego,
Kierownik: prof. dr hab. n. med. R. Chazan
Zastosowanie wybranych komercyjnych testów molekularnych
w mikrobiologicznej diagnostyce gruźlicy
Two selected commercially based nucleic acid amlification tests
for the diagnosis of tuberculosis
Abstract
Introduction: This is the retrospective study on diagnostic effectiveness of two nucleic acid amplification tests: AMPLICOR
Mycobacterium tuberculosis (MTB) and Xpert MTB/RIF. The first one was included into diagnostic procedure for tuberculosis
from 1999 to 2009 and the second one has been used from November 2009.
Material and methods: Study groups comprised 1875 samples for AMPLICOR MTB (104 were inhibited), and 213 samples
for Xpert MTB/RIF.
Results: The assay sensitivity was 81.9% for AMPLICOR MTB and 81.8% for Xpert MTB/RIF, and specificity was 97.2% and
99.5% respectively, as compared to the culture on Loewenstein-Jensen medium. However, sensitivity of each test correlated with Ziehl-Neelsen staining. For AFB+ samples, assay sensitivity was 97.8% for AMPLICOR MTB and 100% for Xpert
MTB/RIF and for AFB– samples it was 58.1% and 50% respectively.
Conclusions: The reported results show a high diagnostic usefulness of Xpert MTB/RIF test for samples, which are positive
for Ziehl-Neelsen staining.
Key words: nuclear acid amplification, tuberculosis, tests real-time PCR
Pneumonol. Alergol. Pol. 2012; 80, 1: 6–12
Streszczenie
Wstęp: W pracy, retrospektywnie oceniono test AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis (MTB) w molekularnej diagnostyce gruźlicy, na podstawie własnych oznaczeń w latach 1999–2009 oraz wstępnie oceniono system Xpert MTB/RIF, który
jest na bieżąco w użyciu.
Materiał i metody: Grupy badane obejmowały odpowiednio 1875 próbek (w tym 104 reakcje zahamowane) i 213 próbek.
Wyniki: Czułość testów AMPLICOR MTB i Xpert MTB/RIF oceniono na 81,9% i 81,8%, a swoistość wynosiła odpowiednio
97,2% i 99,5%, wobec hodowli na pożywce Loewensteina-Jensena. Obydwa testy wykazywały znaczącą różnicę w czułości,
w zależności od tego czy badane próbki były dodatnie (AFB+) czy ujemne (AFB–) w rozmazie. I tak dla próbek AFB+ czułość
wynosiła 97,8% i 100%, a dla próbek AFB– czułość była 58,1% i 50%, odpowiednio dla testów AMPLICOR MTB i Xpert MTB/RIF.
Wnioski: Przedstawione wyniki wykazują pełną przydatność testu Xpert MTB/RIF w rutynowej diagnostyce dla próbek
klinicznych, dodatnich w mikroskopowym badaniu rozmazu.
Słowa kluczowe: amplifikacja kwasów nukleinowych, gruźlica, reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym
Pneumonol. Alergol. Pol. 2012; 80, 1: 6–12
Adres do korespondencji: dr n. med. Aleksandra Safianowska, Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii WUM, ul. S. Banacha 1a,
02–097 Warszawa, tel.: (22) 599 28 56, faks: (22) 599 15 60, e-mail: [email protected]
Praca wpłynęła do Redakcji: 5.12.2011 r.
Copyright © 2011 Via Medica
ISSN 0867–7077
6
www.pneumonologia.viamedica.pl
Aleksandra Safianowska i wsp., Testy molekularne w diagnostyce gruźlicy
Wstęp
W laboratoryjnej diagnostyce gruźlicy, obok
standardowo wykonywanej bakterioskopii oraz
izolacji mykobakterii na pożywce stałej lub płynnej, coraz powszechniej w bezpośrednim badaniu próbek klinicznych stosuje się techniki amplifikacji kwasów nukleinowych (NAA, nucleic
acid amplification). W Katedrze i Klinice Chorób
Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii
Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego od
ponad 12 lat wykonywanie testów NAA jest
uwzględnione w algorytmie postępowania diagnostycznego.
W latach 1999–2009 stosowano, dopuszczony
przez European Centre for Disease Prevention and
Control (ECDC, UE), test AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis (MTB) (Roche Diagnostics,
Szwajcaria), działający na bazie łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR, polymerase chain reaction)
[1]. Od ponad półtora roku w klinice autorów stosuje się system Xpert MTB/RIF (Cepheid, Stany
Zjednoczone), w którym wykorzystano PCR z analizą przyrostu produktu w czasie rzeczywistym
(real time PCR) [2]. System ma Certyfikat Europejski od 2009 roku i dotychczas opublikowano zaledwie kilka prac dotyczących zastosowania tego
testu w diagnostyce klinicznej.
W teście AMPLICOR MTB jako sekwencję
docelową wybrano 584-nukleotydowy fragment
DNA, w obrębie większego regionu kodującego dla
16S rRNA, wspólnego dla Mycobacterium spp.
Spośród możliwych produktów amplifikacji, dzięki zastosowaniu płytki opłaszczonej swoistą
sondą, można wykryć Mtbc (M. tuberculosis complex: M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG,
M. microti, M. canetti [3] oraz M. pinnipedii [4]).
Zaletą testu AMPLICOR MTB jest zastosowanie
kontroli wewnętrznej, będącej zabezpieczeniem
przed rezultatami fałszywie ujemnymi, wynikającymi z inhibicji polimerazy. Test ma również
„wbudowany” system (uracylo-N-glikozylaza) zabezpieczający przed kontaminacją amplikonami
pochodzącymi z poprzednich oznaczeń, co w pracy rutynowej jest najczęstszą przyczyną wyników
fałszywie dodatnich.
Technika real-time PCR, zastosowana w systemie Xpert MTB/RIF, wprowadza nową jakość
do molekularnej diagnostyki gruźlicy. Pozwala
na równoczesne zastosowanie 5 sond w reakcji
amplifikacji fragmentu genu rpoB, tym samym
umożliwiając identyfikację Mtbc i jednocześnie
wykrycie większości szczepów opornych na rifampicynę (RIF) [5]. Gen rpoB jest genem wysoce konserwatywnym, kodującym podjednostkę b
polimerazy RNA. Enzym ten ulega deaktywacji
przez RIF u szczepów wrażliwych. Mutacja
w regionie rpoB nie powoduje utraty aktywności polimerazowej, ale czyni ten enzym niewrażliwym na RIF.
System Xpert MTB/RIF jest w pełni zautomatyzowany, a wszystkie procesy składające się na
technikę PCR, a więc uwalnianie DNA, właściwa
reakcja PCR oraz detekcja amplikonu, są zintegrowane w jednorazowym elemencie (kartridżu), zawierającym kilka komór reakcyjnych. Każda reakcja zachodzi w oddzielnej komorze, a zliofilizowane odczynniki są uwalniane z kapsułek w miarę
postępu procesu. Takie rozwiązanie technologiczne ogranicza do minimum możliwość kontaminacji (w tym również kontaminacji przez przeniesienie amplikonu pochodzącego z poprzednich oznaczeń), praktycznie wykluczając wyniki fałszywie
dodatnie. Zabezpieczenie przed wynikami fałszywie ujemnymi polega na kontroli stopnia dezintegracji prątków i aktywności polimerazy, co w systemie Xpert MTB/RIF rozwiązano pośrednio: dodano przetrwalniki Bacillus globigii jako kontrolę
wewnętrzną i dołączono szóstą sondę wykrywającą
DNA B. globigii. Prawdziwie ujemne są tylko te
próbki kliniczne, które przy ujemnym sygnale dla
Mtbc dają jednocześnie pozytywny sygnał dla
B. globigii.
Test Xpert MTB/RIF jest prosty w obsłudze,
a dzięki pełnej automatyzacji oznaczenia czas wykonania badania nie przekracza 2 godzin. Dodatkowym pozytywnym efektem automatyzacji jest
zminimalizowanie zagrożenia kontaminacją i maksymalne bezpieczeństwo dla personelu.
W roku 2009 test AMPLICOR MTB został wycofany z produkcji. Z oferty dostępnych na rynku, certyfikowanych testów NAA do diagnostyki
gruźlicy, autorzy niniejszej pracy wybrali system
Xpert MTB/RIF, z uwagi na możliwość równoczesnego wykrycia oporności na RIF bezpośrednio
w próbce klinicznej. Nie było jednak możliwości
porównania obu metod na tym samym materiale
klinicznym. Przedstawiana praca ma charakter retrospektywny — oceniono efektywność diagnostyczną testu AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis (MTB) (Roche Diagnostics, Szwajcaria) na
podstawie własnych oznaczeń, prowadzonych od
ponad 10 lat. Następnie, oceniano efektywność
systemu Xpert MTB/RIF (Cepheid, Stany Zjednoczone) na podstawie zebranych wyników od listopada 2009 roku, w celu wstępnego rozeznania, czy
parametry czułość i swoistość detekcji genomu
Mtbc nowym systemem dorównują, ewentualnie
przewyższają, parametry poprzednio stosowanego testu.
www.pneumonologia.viamedica.pl
7
Pneumonologia i Alergologia Polska 2012, tom 80, nr 1, strony 6–12
1.
Materiał i metody
W rutynowym postępowaniu diagnostycznym wykonywano rozmaz barwiony w kierunku
prątków kwasoopornych (AFB, acid fast bacilii)
metodą Ziehl-Neelsena i posiew na pożywce stałej Loewensteina-Jensena (L/J), po uprzednim
upłynnieniu i dekontaminacji próbki klinicznej
ługiem sodowym z N-acetylocysteiną i cytrynianem sodu, a następnie zagęszczeniu według standardowej procedury [6]. Typowanie wyhodowanych szczepów mykobakterii zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Centers for Disease
Control and Prevention (CDC, Stany Zjednoczone) [7] przez analizę kwasów mykolowych z zastosowaniem wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC, high pressure liquid chromatography), co opisano w poprzednich pracach
[8, 9]. W uzasadnionych przypadkach, wykonywano typowanie testem molekularnym, GenoType Mycobacterium CM/AS (HAIN Lifescience,
Niemcy) [10]. Testami molekularnymi, AMPLICOR MTB lub Xpert MTB/RIF badano bezpośrednio próbki kliniczne w przypadkach zleconych
przez klinicystę.
Test AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis
(MTB) wykonywano zgodnie z instrukcją producenta Roche Diagnostics (Szwajcaria). Wszystkie
odczynniki, kontrole i płytki, opłaszczone swoistymi sondami do detekcji DNA Mtbc oraz do detekcji kontroli wewnętrznej (IC, internal control), dostarczono w zestawie. Jednorazowo wykonuje się
reakcję dla co najmniej 6 próbek i 2 kontroli, pozytywnej i negatywnej. Procedura wykonania testu składa się z 3 etapów wykonywanych w oddzielnych pomieszczeniach: przygotowania próbek
oraz kontroli pozytywnej i negatywnej, właściwej
reakcji PCR i swoistej detekcji produktu reakcji
oraz kontroli. W skrócie procedura przedstawia się
następująco:
2.
3.
100 µl zagęszczonej próbki klinicznej, po przepłukaniu i odwirowaniu z 500 µl Respiratory
Specimen Wash Solution, inkubowano z 100 µl
Respiratory Specimen Lysis Reagent, w temperaturze 60°C przez 45 minut. Równolegle
z próbką badaną przygotowano kontrolę negatywną MYCO(–)C oraz kontrolę pozytywną
MYCO(+)C. Próbkę i kontrole zobojętniano
100 µl Respiratory Specimen Neutralization
Reagent. Do PCR pobierano 50 µl otrzymanej
w ten sposób matrycy DNA;
50 µl/reakcję Working Master Mix przygotowywano przez zmieszanie w proporcjach wskazanych przez producenta: MYCO IC (Mycobacterium Internal Control), AmpErase LD (Low
DNA Uracil-N-Glycosylase) oraz MYCO MMX
(Mycobacterium Master Mix), odczynnik zawierający Taq polimerazę DNA, mieszaninę nukleotydów dATP, dCTP, dGTP, dUTP, i mieszaninę biotynylowanych starterów KY18 i KY75.
Objętość końcowa PCR wynosiła 100 µl. Reakcję prowadzono według schematu: 1 cykl, 600
s 50°C// 2 cykle, 20 s 98°C, 20 s 62°C, 45 s 72°C/
/41 cykli, 20 s 94°C, 20 s 62°C, 45 s 72°C/1 cykl,
300 s 72°C// temperatura końcowa 72°C;
Natychmiast po wyjęciu z termocyklera próbki denaturowano, dodając po 100 µl Denaturation Solution. Detekcję prowadzono równolegle na płytkach MTB MWP (M. tuberculosis
Microwell Plate) i IC MWP (Internal Control
Microwell Plate) przez hybrydyzację ze swoistymi sondami. Produkt hybrydyzacji wykrywano barwną reakcją enzymatyczną, stosując
Avidin-Horseradish Peroxidase Conjugate (peroksydazę chrzanową sprzężoną z awidyną).
Wszystkie etapy procedury zostały wykonane
prawidłowo, jeśli zarówno dla MTB MWP, jak
i dla IC MWP wartości ekstynkcji wynoszą:
MYCO(–)C ≥ 0,25 i MYCO(+)C ≥ 2,0. Interpretację wyników przedstawiono w tabeli 1.
Tabela 1. AMPLICOR MTB Test (Roche Diagnostics, Szwajcaria) — interpretacja wyników
Table 1. AMPLICOR MTB Test (Roche Diagnostics, Switzerland) — interpretation of results
Mtbc A450
IC A450
Interpretacja
Interpretation
< 0,35
≥ 0,35
Wynik ujemny. Nie wykryto DNA M. tuberculosis complex w tej próbce klinicznej
Negative result. MTB DNA not detected
< 0,35
< 0,35
Reakcja zahamowana. Nie można wnioskować o potwierdzeniu/wykluczeniu obecności
DNA M. tuberculosis complex w tej próbce klinicznej
Inhibitory Specimen. MTB DNA, if present, would not be detectable
≥ 0,35
Absorbancja dowolna
Any
Wynik dodatni. DNA M. tuberculosis complex obecne w tej próbce klinicznej
Positive result. Specimen is positive for the presence of MTB
Mtbc — Mycobacterium tuberculosis complex, IC (internal control) — kontrola wewnętrzna
8
www.pneumonologia.viamedica.pl
Aleksandra Safianowska i wsp., Testy molekularne w diagnostyce gruźlicy
Tabela 2. Wyniki testu AMPLICOR MTB (Roche Diagnostics, Szwajcaria)
Table 2. Results of the AMPLICOR MTB Test (Roche Diagnostics, Switzerland)
Bakterioskopia
Microscopy
AFB(+)
AFB(–)
Nie wykonano
Not performed
Razem
Total
PCR(+)
L/J(+)
L/J(–)
91
31
33
12
3
3
127
46
173
PCR(–)
L/J(+)
L/J(–)
2
101
24
1430
2
39
28
1570
1598
Razem
Total
L/J(+)
L/J(–)
93
132
57
1442
5
42
155
1616
1771
AFB (acid fast bacilli) — prątki kwasooporne, L/J (Loewenstein-Jensen medium) — pożywka Loewensteina-Jensena, PCR (polimerase chain reaction) — łańcuchowa reakcja
polimerazy
Tabela 3. Wyniki testu Xpert MTB/RIF (Cepheid, Stany Zjednoczone)
Table 3. Results of the Xpert MTB/RIF (Cepheid, USA)
Bakterioskopia
Microscopy
AFB(+)
AFB(–)
Nie wykonano
Not performed
Razem
Total
Xpert(+)
L/J(+)
L/J(–)
14
1
4
0
0
0
18
1
19
Xpert(–)
L/J(+)
L/J(–)
0
7
4
181
0
2
4
190
194
Razem
Total
L/J(+)
L/J(–)
14
8
8
181
0
2
22
191
213
AFB (acid fast bacilli) — prątki kwasooporne, L/J (Loewenstein-Jensen medium) — pożywka Loewensteina-Jensena
Oznaczenie zajmuje około 7–8 godzin, nie licząc czasu wstępnej obróbki próbki klinicznej.
Test Xpert MTB/RIF wykonano zgodnie z instrukcją producenta Cepheid (Stany Zjednoczone), która dopuszcza oznaczanie zarówno upłynnionych, zdekontaminowanych i zagęszczonych
próbek klinicznych, jak i próbek bez obróbki
wstępnej. Jako regułę przyjęto oznaczanie próbek
po obróbce wstępnej i odstępowano od niej tylko w pojedynczych, uzasadnionych wypadkach.
Do 0,5 ml próbki dodano 1,5 ml odczynnika do
próbek (SR), zamieszano i inkubowano 15 minut
w temperaturze pokojowej, jeszcze raz mieszając pomiędzy 5. a 10. minutą inkubacji. Następnie całość przenoszono do kartridża, który
umieszczono w aparacie GeneXpert, kontrolowanym komputerowo i rozpoczęto reakcję,
trwającą około 2 godzin. Proces jest całkowicie
zautomatyzowany, a wyniki interpretowane
przez integralny software zgodnie z poniższym
algorytmem.
1. Wynik jest dodatni dla Mtbc, jeśli co najmniej
dwie z pięciu sond rpoB dają sygnał pozytywny w najpóźniej dwóch następujących po sobie cyklach;
2.
3.
4.
Wynik jest ujemny dla Mtbc, jeśli warunek nr
1 nie jest spełniony i jednocześnie sonda dla
B. globigii daje sygnał pozytywny;
Próbki ujemne zarówno dla Mtbc, jak i B. globigii są rozpoznawane jako nieoznaczalne;
RIF-oporność stwierdza się wówczas, gdy spełniony jest warunek nr 1 i z pozostałych trzech
sond rpoB co najmniej jedna jest negatywna.
Wyniki
W czasie od 12 stycznia 1999 do 16 listopada
2009 zbadano ogółem 1875 próbek klinicznych
testem AMPLICOR MTB. W 1771 przypadkach reakcja PCR nie była zahamowana, a wyniki były
istotne diagnostycznie. Dla 90,5% (1697/1875)
przebadanych próbek, otrzymano spójne wyniki
testu AMPLICOR MTB i hodowli L/J: w obu testach
było 127 próbek dodatnich i 1570 próbek ujemnych. Wyniki rozbieżne otrzymano dla 4,0% (74/
/1875) oznaczeń. Dla 46 próbek wyniki testu AMPLICOR MTB były pozytywne, lecz w hodowli nie
uzyskano wzrostu. W 28 przypadkach gruźlicę
potwierdzono wyłącznie hodowlą L/J, a wynik testu AMPLICOR MTB był ujemny. W większości
www.pneumonologia.viamedica.pl
9
Pneumonologia i Alergologia Polska 2012, tom 80, nr 1, strony 6–12
były to materiały ujemne bakterioskopowo (24 próby), ale w 2 przypadkach były to próbki dodatnie
w bakterioskopii. Wyniki przedstawiono w tabeli 2.
Na podstawie powyższych wyników obliczono czułość i swoistość testu AMPLICOR MTB, które wynosiły odpowiednio: 81,9% (127/155) i 97,2%
(1570/1616). Następnie czułość testu molekularnego analizowano w grupach. Dla 225 próbek, dla
których wynik bakterioskopii był dodatni
[AFB(+)], czułość testu AMPLICOR MTB wynosiła 97,8% (91/93). W grupie pozostałych 1546
próbek (1499 próbek AFB(–) i 47 próbek, dla których z uzasadnionych przyczyn nie wykonywano bakterioskopii, czułość tego testu wynosiła
58,1% (36/62).
W jednym przypadku z próbki AFB(+), która
pierwotnie w teście AMPLICOR MTB była dodatnia w kierunku Mtbc, wyhodowano szczep NTM,
wytypowany w HPLC jako M. chelonae. Badanie
powtórzono innym testem molekularnym, GenoType Mycobacterium CM/AS, i otrzymano wynik
zgodny z testem AMPLICOR MTB, potwierdzający obecność DNA Mtbc. Ostatecznie ustalono, że
szczep M. chelonae stanowił kontaminację.
W przebadanej grupie, reakcja PCR była zahamowana w 104 przypadkach. Hamowanie najczęściej występowało w płynie z płukania oskrzelikowo-pęcherzykowego (BALF) i w moczu. Dla 23%
zbadanych próbek BALF i 12% zbadanych próbek
moczu nie uzyskano wyniku PCR.
Test Xpert MTB/RIF jest obecnie rutynowo stosowany w laboratoryjnej diagnostyce gruźlicy
w klinice autorów niniejszej pracy. W tabeli 3 zebrano wyniki dla 213 próbek klinicznych. W 208 przypadkach (97,6%) wyniki nowego testu molekularnego i hodowli były zgodne. W 18 przypadkach
uzyskano wyniki dodatnie zarówno w Xpert MTB/
/RIF, jak i w hodowli L/J. W obu badaniach 190 próbek klinicznych było ujemnych. Spośród pozostałych 5 próbek, dla których wyniki były rozbieżne,
z 4 próbek AFB(–) wyhodowano szczepy Mtbc,
mimo że wcześniej, w badaniu molekularnym
otrzymano wyniki ujemne. Czułość testu oceniono na 81,8% (18/22), a swoistość na 99,5% (190/
/191). Uwzględniając wyniki bakterioskopii, dla
próbek dodatnich w barwieniu Z-N, czułość wynosiła 100% (14/14), a dla próbek bakterioskopowo ujemnych 50% (4/8).
W systemie Xpert MTB/RIF nie odnotowano
przypadków zahamowania reakcji: w nielicznych
przypadkach (3 próbki plwociny, 1 próbka popłuczyn oskrzelowych, 1 próbka wydzieliny oskrzelowej), badanie zostało uznane przez system jako
nieoznaczalne, ale po powtórzeniu dało wyniki
wiarygodne.
10
W badanej grupie próbek klinicznych w 7 przypadkach wyhodowano szczepy niegruźlicze —
w żadnym z tych przypadków nie stwierdzono reakcji krzyżowej. W badanej grupie nie stwierdzono oporności na RIF.
Dyskusja
Zebrane wyniki wskazują, że zarówno czułość,
jak i swoistość testu AMPLICOR MTB były bardzo
wysokie, odpowiednio: 81,9% i 97,2%. O ile jednak na swoistość testu nie miał wpływu fakt, czy
badana próbka była bogato- czy skąpoprątkowa, to
czułość testu zależała od rodzaju materiału klinicznego: była wysoka (97,8%) dla materiałów AFB(+)
i dużo niższa (58,1%) dla materiałów AFB(–). Przy
tych parametrach charakteryzujących efektywność
diagnostyczną testu AMPLICOR MTB, wynik dodatni jest potwierdzeniem procesu gruźliczego dla
próbki dodatniej w barwieniu Z-N oraz jest silną
przesłanką w kierunku gruźlicy, gdy rozmaz jest
ujemy. Pojedynczy ujemny wynik testu nie wyklucza gruźlicy, gdy próbka jest ujemna w badaniu mikroskopowym. Jeśli próbka jest dodatnia w barwieniu Z-N, to ujemny wynik testu AMPLICOR MTB
jest silną przesłanką w kierunku obecności prątków niegruźliczych. Wyniki autorów niniejszej
pracy pokrywają się z danymi w literaturze światowej [11, 12].
System Xpert MTB/RIF autorzy wprowadzili
do diagnostyki molekularnej w laboratorium prątka w listopadzie 2009 roku, pół roku po dopuszczeniu systemu do diagnostyki rutynowej w Unii
Europejskiej przez ECDC. Prawidłowe wyniki (dodatnie lub ujemne) uzyskano w 97,6% przypadków
— na nieco wyższym poziomie niż w teście
AMPLICOR MTB (90,5% wyników poprawnych).
W prezentowanym badaniu, swoistość systemu
Xpert MTB/RIF (99,5%) była nieco wyższa niż testu AMPLICOR MTB (97,2%), czułość zaś była na podobnym poziomie (81,8% v. 81,9%). Jeśli uwzględni się badanie mikroskopowe, to w grupie próbek
dodatnich czułość testu dla obu systemów była
wysoka (100% dla Xpert MTB/RIF i 97,8% dla
AMPLICOR MTB) i zdecydowanie niższa dla próbek skąpoprątkowych, ujemnych w bakterioskopii
(50% dla Xpert MTB/RIF i 58,1% dla AMPLICOR
MTB). Wydaje się jednak, że z uwagi na nieliczną
grupę 8 próbek AFB(–), które zostały zbadane przy
użyciu systemu Xpert MTB/RIF, nie jest uprawnione wnioskowanie na temat czułości tego systemu
dla materiałów skąpoprątkowych. W związku z zastosowaniem real-time PCR, można raczej spodziewać się znacznie wyższej czułości diagnostycznej
w teście Xpert MTB/RIF, w porównaniu z trady-
www.pneumonologia.viamedica.pl
Aleksandra Safianowska i wsp., Testy molekularne w diagnostyce gruźlicy
cyjnymi testami NAA. Dwa zespoły badaczy uzyskały znacznie wyższą czułość (72,5% [13]
i 71,7% [14]) dla materiałów klinicznych AFB(–)
przy badaniu pojedyńczych próbek. Czułość była
jeszcze wyższa (85,1%), jeśli badano dwie próbki
testem Xpert MTB/RIF, a przy 3 badaniach sięgała nawet 90,2% [13].
Z badania autorów prezentowanej pracy wynika, że niektóre parametry diagnostyczne systemu Xpert MTB/RIF są nieco wyższe niż dla testu
AMPLICOR MTB. Jednak biorąc pod uwagę rekomendację World Health Organization [14], w której zaleca się zastosowanie systemu Xpert MTB/RIF
w pierwszym kroku laboratoryjnej procedury
w diagnostyce gruźlicy u chorych, u których podejrzewa się MDR TB lub gruźlicę skojarzoną z infekcją
HIV oraz ewentualnie dla pozostałych chorych, jako
drugie w kolejności badanie dla próbek AFB(–)
w rozmazie, konieczne wydaje się prowadzenie dalszych badań własnych w zakresie czułości metody
w próbkach skąpoprątkowych AFB(–).
Na podstawie niniejszego badania nie można
się odnieść do swoistości systemu Xpert MTB/RIF,
w przypadku gdy w próbce obecne są szczepy mieszane prątków, bo takie przypadki nie występowały. Helb i wsp. [15] oceniają, że test Xpert MTB/
/RIF cechuje się wysoką swoistością i zdolnością
wykrycia szczepów Mtbc nawet w próbkach zanieczyszczonych prątkami niegruźliczymi. W cytowanym badaniu żaden z testowanych 22 szczepów
niegruźliczych, spośród 20 gatunków Mycobacterium spp., nie dawał reakcji krzyżowej. Test prawidłowo wykrywał Mtbc w obecności M. avium,
M. intracellulare, M. kansasii i M. malmoense.
Inną otwartą kwestią pozostaje własna ocena
testu Xpert MTB/RIF pod kątem wykrywania oporności na RIF. W regionach z dużym odsetkiem
występowania gruźlicy wielolekoopornej typu
MDR (MDR TB, multidrug resistant tuberculosis),
zdefiniowanej jako jednoczesna oporność na RIF
i izoniazyd (INH), 70–95% szczepów M. tuberculosis opornych na RIF występuje mutacja w regionie
rpoB, w jednym z 3 loci: 516, 526 lub 531 [16, 17].
Prammananan i wsp. w swojej pracy przedstawili
dyskusję dotyczącą częstości występowania różnych mutacji, warunkujących oporność RIF w zależności od regionu geograficznego [18]. Ponieważ
rozwój oporności na INH zazwyczaj poprzedza
oporność na RIF, dlatego tę ostatnią oporność często traktuje się jako zastępczy wskaźnik wielolekooporności [19]. W regionach, gdzie występowanie MDR TB nie jest tak częste, zastosowanie oporności na RIF — jako wskaźnika wielolekooporności zależy od częstości występowania monooporności na RIF w danej populacji [20]. Augustyno-
wicz-Kopeć wykazała, że w populacji polskiej,
u chorych wcześniej leczonych, genetycznie wyznaczona oporność na RIF może być zastępczym
wskaźnikiem oporności MDR TB [21]. Wydaje się
więc, że system Xpert MTB/RIF może być użyteczny do określania co najmniej wtórnej oporności
typu MDR, ale autorzy niniejszej pracy w swoich
badaniach nie mogli się odnieść do tego zagadnienia, gdyż w badanej grupie nie występowały szczepy oporne na RIF.
Podsumowanie
1.
2.
3.
4.
W przedstawionej pracy oceniono zastosowanie w molekularnej diagnostyce gruźlicy testu
AMPLICOR MTB oraz nowego systemu Xpert
MTB/RIF.
Przedstawione wyniki wykazują pełną przydatność testu Xpert MTB/RIF w rutynowej diagnostyce dla próbek klinicznych, dodatnich
w mikroskopowym badaniu rozmazu [AFB(+)].
Określenie czułości systemu Xpert MTB/RIF
dla próbek ujemnych w bezpośrednim badaniu mikroskopowym wymaga dalszych badań
z udziałem większej grupy chorych.
Konieczne jest określenie swoistości systemu
Xpert MTB/RIF dla szczepów M. tuberculosis
zanieczyszczonych prątkami środowiskowymi
oraz zbadanie efektywności systemu w wykrywaniu szczepów opornych na RIF.
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Carpenter E., Drouillard B., Dailloux M. i wsp. Diagnosis of
tuberculosis by AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis test:
a multicenter study. J. Clin. Microbiol. 1995; 33: 3106–3110.
Blakemore R., Story E., Helb D. i wsp. Evaluation of the analytical performance of the Xpert MTB/RIF Assay. J. Clin. Microbiol. 2010; 48: 2495–2501.
van Soolingen D., Hoogenboezem T., de Haas P.E.W. i wsp.
A novel pathogenic taxon of the Mycobacterium tuberculosis
complex canetti: characterization of an exceptional isolate from
Africa. Int. J. Syst. Bacteriol. 1997; 47: 1236–1245.
Cousins D.V., Bastida R., Cataldi A. i wsp. Tuberculosis in seals
caused by a novel member of the Mycobacterium tuberculosis
complex: Mycobacterium pinnipedii sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 2003; 53: 1305–1314.
Hunt J.M., Roberts G.D., Stockman I., Felmlee T.A. Detection of
a genetic locus encoding resistance to rifampin in mycobacterial cultures and in clinical specimens. Diagn. Microbiol. Infect.
Dis. 1994; 18: 219–227.
Hanna B.A. Diagnosis of Tuberculosis by Microbiologic Techniques. W: Rom W.N., Garay S. (red.). Tuberculosis. Little,
Brown and Company, Boston, New York, Toronto, London
1996; 149–159.
Standarized Method for HPLC Identification of Mycobacteria.
U.S. Departament of Heath and Human Services, CDC 1996.
http://www.cdc.gov/ncidod/publications/hplc.pdf; 14.07.2011.
Safianowska A., Walkiewicz R., Grubek-Jaworska H. i wsp. Mycolic acids analysis from various species mycobacterium by
high pressure liquid chromatography (HPLC). Pneumonol.
Alergol. Pol. 2002; 70: 130–138.
Walkiewicz R., Safianowska A., Grubek-Jaworska H. i wsp. Zastosowanie analizy kwasów mikolowych w diagnostyce gruźlicy
i mikobakterioz — 3 lata doświadczeń. Pneumonol. Alergol.
Pol. 2002; 70: 444–449.
www.pneumonologia.viamedica.pl
11
Pneumonologia i Alergologia Polska 2012, tom 80, nr 1, strony 6–12
10.
11.
12.
13.
14.
15.
12
Safianowska A., Walkiewicz R., Nejman-Gryz P. i wsp. Porównanie dwóch technik typowania prątków niegruźliczych: cieczowej chromatografii wysokociśnieniowej i molekularnego
systemu GenoType Mycobacterium CM/AS. Pneumonol. Alergol. Pol. 2010; 78: 363–368.
Centers for Disease Control and Prevention: Updated Guidelines
for the Use of Nucleic Acid Amplification Tests in the Diagnosis
of Tuberculosis. MMWR 2009; 58: 7–10. http://www.cdc.gov/
/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5801a3.htm; 14.07.2011.
Greco S., Girardi E., Navarra A., Saltini C. Current evidence on
diagnostic accuracy of commercially based nucleic acid amplification tests for the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Thorax 2006; 61: 783–790.
Boehme C.C., Nabeta P., Hillemann D. i wsp. Rapid Molecular
Detection of Tuberculosis and Rifampin Resistance. N. Engl. J.
Med. 2010; 363: 1005–1015.
Strategic and Technical Advisory Group for Tuberculosis: Report of the Tenth Meeting, 27–29 September 2010, WHO headquarters,
Geneva,
Switzerland.
http://www.who.int/tb/
/advisory_bodies/stag_tb_report_2010.pdf; 14.07.2011.
Helb D., Jones M., Story E. i wsp. Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis and rifampin resistance by use of on-demand,
near-patient technology. J. Clin. Microbiol. 2010; 48: 229–237.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
Cavusoglu C., Hilmioglu S., Guneri S., Bilgic A. Charachterization of rpoB mutations in rifampin-resistant clinical isolate from
Turkey by DNA sequencing and line probe assay. J. Clin. Microbiol. 2002; 40: 4435–4438.
Ramaswamy S.V., Musser J.M. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998
update. Tuberc. Lung Dis. 1998; 79: 3–29.
Prammananan T., Cheunoy W., Taechamahapun D. i wsp. Distribution of rpoB mutations among multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis (MDRTB) strains from Thailand and development of a rapid method for mutation detection. Clin. Microbiol. Infect. 2008; 14: 446–453.
Gillespie S.H. Evolution of drug resistance in Mycobacterium
tuberculosis: clinical and molecular perspective. Antimicrob.
Agents Chemother. 2002; 46: 267–274.
Traore H., Fissette K., Bastian I. i wsp. Detection of rifampicin
resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from diverse
countries by a commercial line probe assay as an initial indicator of multidrug resistance. Int. Tuberc. Lung Dis. 2000; 4:
481–484.
Augustynowicz-Kopeć E. Gruźlica lekooporna w Polsce. Analiza epidemiologiczna, mikrobiologiczna i genetyczna. Rozprawa
habilitacyjna, AM w Warszawie, Warszawa 2007.
www.pneumonologia.viamedica.pl