Instytut Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk

Instytut Chemii Fizycznej
Polskiej Akademii Nauk
Nanoinżynieria powierzchni do chemoi bioczujników
Zespół 4
dr hab. inż. Joanna Niedziółka-Jönsson, prof. IChF
ul. Kasprzaka 44/52, 01-224 Warszawa
Tel. +(48 22) 343 31 30
Fax +(48 22) 343 33 33
E-mail: [email protected]
07 marca 2016
Recenzja Rozprawy Doktorskiej mgr inż. Kamili Konopińskiej pt:
"Badania wybranych kompleksów porfiryn do zastosowania w roli znaczników białek"
Przedstawiona do recenzji rozprawa doktorska mgr inż. Kamili Konopińskiej dotyczy
wykorzystania porfiryn do znakowania białek oraz jednoczesnej ich detekcji przy
zastosowaniu trzech technik pomiarowych: różnicowej woltamperometrii pulsowej,
spektrofotometrii UV-Vis oraz spektrofluorymetrii. Praca wykonana została w Zakładzie
Mikrobioanalityki Wydziału Chemicznego Politechniki Warszawskiej pod kierunkiem
prof. dr hab. inż. Elżbiety Malinowskiej i promotora pomocniczego dr inż. Mariusza
Pietrzaka.
Temat pracy doskonale odzwierciedla poruszany w rozprawie problem dostępności metod
analitycznych ukierunkowanych na wykrywanie białek oraz podkreśla konieczność
stosowania cząsteczek znakowanych do śledzenia oddziaływań białko-białko. Autorka w tym
celu proponuje zastosowanie (metalo)profiryn jako znaczników białek. Na rozprawę
doktorską składają się cztery publikacje, z czego trzy z nich opublikowane są w czasopismach
z listy filadelfijskiej oraz jedna w nowopowstałym czasopiśmie typu „open access”
wydawnictwa Elsevier. Należy podkreślić, że we wszystkich pracach mgr Konopińska jest
pierwszym autorem. Seria prac poprzedzona jest krótkim, ale wyczerpującym wstępem
literaturowym uzasadniającym wybór podjętej tematyki badawczej. Autorka jasno definiuje
cel pracy oraz wyszczególnia elementy nowości naukowej podjętych przez siebie wyzwań.
Dodatkowo umieszone we wstępie schematy, lista skrótów, tabele oraz zawarte komentarze
będące uzupełnieniami do badań własnych sprawiają, że pomimo analizy wielu związków
z zastosowaniem różnorodnych technik badawczych praca jest bardzo czytelna. Poszukiwanie
nowych rozwiązań do jednoznacznego wykrywania i oznaczania białek w próbkach
o złożonych matrycach jest niezwykle istotne z punktu widzenia m.in. ochrony zdrowia, co
stanowi niezwykle ważny element diagnostyki medycznej.
www.ichf.edu.pl
Wchodzące w skład rozprawy publikacje zostały już poddane ocenie recenzentów
i edytorów podczas procesu publikacyjnego, dlatego pozwolę sobie je tylko krótko
przedstawić i skomentować.
W pierwszej pracy „Manganese porphyrins — Studies on their potential use for protein
labeling“ (Microchemical Journal 115 (2014) 1-5; K Konopińska, M. Pietrzak, E.
Malinowska) autorka opisuje właściwości elektrochemiczne i optyczne tetrafenyloporfiryny
manganowej (Mn-TPP). Doktorantka sprawdza jak rodzaj rozpuszczalnika organicznego
i elektrolitu podstawowego wpływa na odpowiedź elektrochemiczną samej porfiryny i
uwzględnia zdolność metaloporfiryn do kompleksowania anionów. Następnie dla wybranego
systemu bada zachowanie Mn-TPP w obecności białka BSA (bovine serum albumin) i CEA
(chicken egg albumin) oraz immunoglbuliny G (IgG). W kolejnym etapie przeprowadza
również
badania
nad
wpływem
stężenia
BSA,
CEA
i
IgG
na
kształt
i intensywność widm absorpcji oraz fluorescencji testowanej metaloporfiryny. Dla każdej
z metod autorka podaje dolne zakresy wykrywalności (LOD) Mn-TPP. Z przeprowadzonych
badań wnioskuje, że wybrana prze nią Mn-TPP może być zastosowana do znakowania białek
i ich wykrywania trzema wspomnianymi technikami. W omawianej pracy zabrakło mi opisu
sposobu wyznaczania LOD oraz komentarza jak uzyskane wartości odnoszą się do stężeń
badanych białek w roztworach fizjologicznych. Doktorantka stosuje do pomiarów
chlorosrebrową elektrodę odniesienia, która jest dedykowana jedynie do roztworów wodnych,
a nie do badanych przez nią rozpuszczalników organicznych jak tetrahydrofuran, czy
benzonitryl.
W drugiej publikacji „Studies on potential use of tin(IV) porphyrin in a role of proteins’
label“ (Analytical Biochemistry 470 (2015) 41–47, Kamila Konopińska, Mariusz Pietrzak,
Elżbieta Malinowska), autorka w podobny do zastosowanego w poprzedniej pracy sposób
bada wpływ rozpuszczalników organicznych, rodzaju elektrolitu podstawowego, dodatku
białek (BSA, CEA – który w tej pracy został oznaczony skrótem OVA i IgG) na odpowiedź
prądowo-napięciową oraz intensywność widm absorpcji i fluorescencji tetrafenyloporfiryny
cyny(IV) (Sn-TPP). Po skrupulatnej analizie otrzymanych przez siebie wyników doktorantka
stwierdza, że Sn-TPP nie może być używana jako znacznik białek stosując detekcję
spektrofluorymetrycną, gdyż otrzymane widmo emisji jest zależne od obecności w próbce
różnego rodzaju jonów. We wnioskach zaś podaje, że Sn-TPP spełnia wszystkie kryteria, aby
mogła
być
stosowana
jako
znacznik
zarówno
przy
podwójnym,
jak
i potrójnym systemie detekcji, co pozostaje w mojej opinii sprzeczne lub zasługuje na
bardziej wyczerpujący komentarz. Szkoda, że autorka nie zamieściła (poza widmem
fluorescencji) rezultatów dla otrzymanych koniugatów. Podobnie jak w pierwszej publikacji,
www.ichf.edu.pl
także i w tej pracy zabrakło opisu metody wyznaczania LOD oraz stosowano nieodpowiednią
do zastosowanych rozpuszczalników organicznych elektrodę odniesienia.
W kolejnej publikacji „Tetraphenylporphyrin as a protein lable for triple detection
analytical system“ (Heliyon 1 (2015) e00053, Kamila Konopińska, Mariusz Pietrzak,
Radosław Mazur, Elżbieta Malinowska) doktorantka bada przydatność tetrafenyloporfiryny
jako znacznika białek z zastosowaniem potrójnego systemu detekcji. Następnie krok po kroku
opisuje sprzęganie porfiryny z BSA oraz krótkimi peptydami, optymalizację tego procesu,
a powstanie koniugatów potwierdza odpowiednio dobranymi technikami analitycznymi.
Ostatnia praca „Analytical characterization of IgG-cTpp and IgG-Mn-cTpp conjugates“
(Journal of Porphyrins and Phtalocyanines 19 (2015) 1-8, Kamila Konopińska, Mariusz
Pietrzak,
Radosław
Mazur,
Elżbieta
Malinowska)
przedstawia
proces
sprzęgania
tetrafenyloporfiryny (cTPP) oraz tetrafenyloporfiryny manganowej z immunoglobuliną G. W
dalszej części pracy opisana jest konstrukcja immunotestu opartego o oddziaływania
powinowactwa z zastosowaniem przeciwciał znakowanych cTPP. Dodatkowo przedstawiony
został również test z przeciwciałami znakowanymi metaloporfiryną manganową (Mn-cTPP),
która została wykorzystana zarówno w drodze detekcji bezpośredniej (ocena pasma Soreta)
jak i pośredniej opartej na jej aktywności katalitycznej. We wszystkich przedstawionych
testach do detekcji zastosowano tylko techniki optyczne.
Z przykrością stwierdzam, że w żadnej z publikacji oraz w opisie do pracy nie pojawiły się
eksperyment pokazujący jakościowe i/lub ilościowe oznaczanie analitu za pomocą
wyznakowanego (metalo)porfiryną białka trzema technikami: różnicowej woltamperometrii
pulsowej, spektrofotometrii UV-Vis oraz spektrofluorymetrii.
Szerokie spektrum zbadanych związków z zastosowaniem wielu technik analitycznych,
z pewnością utrudniło bardziej ogólną ocenę użyteczności badanych systemów,
w
szczególności
z
zastosowaniem
detekcji
elektrochemicznej,
uwzględniając
ich
powtarzalność, trwałość i odtwarzalność, jak również wpływ związków przeszkadzających,
których nie brak w próbkach pochodzenia biologicznego.
Praca napisana jest starannie i nie budzi większych zastrzeżeń. Drobne uchybienia można
znaleźć w polskim streszczeniu rozprawy doktorskiej, wynikające prawdopodobnie
z dosłownego tłumaczenia wersji angielskiej oraz niewielkie błędy gramatyczne w tekście
angielskim.
www.ichf.edu.pl
Podsumowując stwierdzam, że rozprawa wnosi istotne elementy nowości o dużym
potencjale aplikacyjnym w zakresie chemii (bio)analitycznej. Potwierdzeniem tego są
publikacje stanowiące podstawę rozprawy doktorskiej. Oświadczenia współautorów
wskazują, że doktorantka wykazała ponad wszelką wątpliwość niezbędną wiedzę teoretyczną
oraz umiejętność samodzielnego prowadzenia pracy eksperymentalnej. Moje krytyczne uwagi
nie wpływają na wysoką ocenę pracy. W związku z powyższym, uważam, że rozprawa
doktorska mgr inż. Kamili Konopińskiej pt. „Badania wybranych kompleksów porfiryn do
zastosowania w roli znaczników białek” spełnia kryteria określone w art. 13 ustawy z dnia 14
marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytułach
w zakresie sztuki (Dz. U. Nr 65/2003 poz. 595 z późniejszymi zmianami) i wnoszę
o dopuszczenie mgr inż. Kamili Konopińskiej do dalszych etapów przewodu doktorskiego.
Joanna Niedziółka-Jönsson
www.ichf.edu.pl