Międzynarodowa Konferencja Naukowo‐Szkoleniowa Państwowej

Testy aglutynacji lateksowej w
diagnostyce medycznej
Co łączy klasyczną hemaglutynację i nowoczesną immunodiagnostykę?
Otóż ta druga w erze przeciwciał monoklonalnych sięgnęła po pomysł
podpatrzony w samej naturze- okrągłe cząstki opłaszczone przeciwciałem
(antygenem) zlepiają się (aglutynują) w obecności antygenu
(przeciwciała), a efekt jest widoczny gołym okiem lub przy użyciu
nefelometru- zupełnie jak podczas hemaglutynacji niezgodnych grupowo
krwinek.
Zasada działania testów lateksowych
Nośnikiem szeroko używanym w diagnostyce medycznej jest lateks. Kulki lateksu
łatwo opłaszcza się białkami, zaś średnica kulek jest na tyle mała, że zachowują
się one w wodzie jak jednorodna zawiesina. Można zatem przyłączać do cząstek
lateksu antygeny (podczas wykrywania przeciwciał) lub przeciwciała (przy
screeningu antygenów). Powinowactwo antygen-przeciwciało zbliża do siebie
cząstki lateksu, sieciuje je między sobą (aglutynacja) i strąca największe
kompleksy z roztworu, co widać gołym okiem jako osad lub nagle powstałą
heterogenność mieszaniny (patrz rycina).
Screeningowe testy aglutynacji lateksowej (wizualne)
Aglutynacja cząsteczek lateksu jest świetnym sposobem na szybki screening np.w
diagnostyce mikrobiologicznej. Rutynowo wykonuje się dziś oznaczanie koagulazy
związanej rodzaju Staphylococccus (tzw. clumping factor), która jest czynnikiem
zjadliwości szczepów S. aureus. Także rutynowo prowadzi się wstępne
szeregowanie paciorkowców do grup serologicznych na podstawie obecności
antygenów grupowych na powierzchni tych bakterii. Taki test przesiewowy
pozwala odróżnić paciorkowce chorobotwórcze od flory fizjologicznej i jest
wstępem do dalszej identyfikacji tych drobnoustrojów. Testów tego typu jest
więcej, są to metody jakościowe, zgrubne, do których wykonania wystarczy kilka
minut. Nie są to metody czułe, ale wystarczające przy wstępnym screeningu.
Wykonuje się je dziecinnie prosto: na okrągłe pole testowe nakrapia się kroplę
zawiesiny lateksu, dodaje się pojedynczą, czystą kolonię bakteryjną i miesza,
czekając na aglutynację w postaci widocznego strątu.
Testy lateksowe do ilościowej oceny nefelometrycznej
Testy immunoaglutynacyjne można wykorzystać także w czułej analizie ilościowej
antygenów lub przeciwciał w surowicy czy moczu. Dzięki
nefelometrii (pomiar światła rozproszonego przez zmętnienie mieszaniny) możliwe
jest wykrycie nawet niewielkiej aglutynacji oraz oszacowanie ilościowe na
podstawie krzywej wzorcowej stężenia badanego czynnika. Takie testy stosowane
są m.in w diagnostyce hsCRP (białko C-reaktywne, oznaczenie wysokiej czułości),
przy poszukiwaniu autoprzeciwciał (reumatoidalne zapalenie stawów, toczeń
układowy i inne) czy też w diagnostyce chorób bakteryjnych i wirusowych (np.
antygen streptolizyna-O, przeciwciała przeciwko H. pylori i wiele innych)
Marzena Pieronkiwicz
Zdjęcie testu Slidex pobrano ze strony reklamowej producenta.
Testy aglutynacji latekswej
Niezastąpione w nowoczesnej diagnostyce laboratoryjnej
Przechowywanie
próbek
w
biotechnologii: „jak”, „gdzie”, i
„jak długo”? (I)
Temat archiwizacji próbek jest istotny zarówno dla naukowców, jak i dla
klinicystów. Czy to podczas realizacji projektu badawczego, czy to do
późniejszego wykorzystania, wreszcie- dla celów terapeutycznych. Dla
niektórych typów materiałów istnieje consensus co do sposobu
przechowywania, natomiast dla innych nie ma żadnych konkretnych
wytycznych i tylko od załogi laboratorium i posiadanego sprzętu zależy,
jak i czy w ogóle jest on bankowany.
W części pierwszej zajmiemy się materiałami tkankowymi i komórkowymi.
Żywotne hodowle komórkowe eukariotyczne, gamety i komórki
macierzyste
Zachowanie w dobrej kondycji wrażliwych, osłoniętych jedynie błoną
plazmatyczną komórek zwierzęcych jest nie lada wyzwaniem. Oczywiście
zatrzymanie ich metabolizmu jest możliwe jedynie poprzez zamrożenie, jednak
woda podczas mrożenia tworzy kryształy, które niczym włócznie przebijają na
wskroś mrożone komórki. Dlatego procedura mrożenia jest bardzo ściśle
określona i wymaga specjalistycznej aparatury.
Komórki przed mrożeniem są delikatnie traktowane, odpłukiwane z medium
hodowlanego, zastępowanego roztworem zawierającym krioprezerwant
(najszerzej używanym jest DMSO, chociaż wybór środka zależy od typu komórek).
Jego funkcją jest nie dopuścić do tworzenia się kryształów i do nadmiernego
obkurczania się komórek w stanie zamrożenia.
Samo zamrażanie musi być na tyle szybkie, żeby komórki nadmiernie się nie
obkurczyły, ale na tyle wolne, by nie doprowadzić do ich lizy. Komórki ssacze
najczęściej poddaje się mrożeniu z szybkością 1-3 stopni Celcjusza na minutę,
schładzając je docelowo do temperatury poniżej -130 stopni.
Jest jeszcze druga technika zamrażania, zwana witryfikacją, czyli zeszkleniem.
Polega ona na tak szybkim zamrożeniu komórek, by ich roztwór zamienił się nie w
kryształy lodu, ale w amorficzne ciało stałe podobne do szkła. Odbywa się to
poprzez nagłe włożenie do ciekłego azotu i nadanie ruchu próbce podczas
zamrażania, tak by ciekły azot maksymalnie szybko odbierał jej ciepło.
Testy aglutynacji latekswej
Niezastąpione w nowoczesnej diagnostyce laboratoryjnej
Przechowywanie po zamrożeniu odbywa się albo nad ciekłym azotem, w jego
parach (-140 do -180 stopni), albo w cieczy (-196).
Rozmrażanie komórek polega najczęściej na raptownym rozgrzaniu do 37 stopni i
szybkim odpłukaniu środka konserwującego, by nie dopuścić do zatrucia komórek
i szoku osmotycznego.
Materiał roślinny pochodzący z zawiesin komórkowych mrozi się w podobny
sposób.
Żywotne linie bakteryjne i drożdżowe
Bakterie i drożdże, z racji mniej skomplikowanego metabolizmu, naturalnych
przystosowań do trudnych warunków środowiska i posiadania ściany komórkowej,
łatwiej jest zachować przy życiu w stanie zamrożenia. Oczywiście są mikroby
wrażliwe, wymagające odpowiedniego przygotowania przed krioprezerwacją,
jednak poczciwa E. coli, czy S. cerevisiae, jak ii wiele innych gatunków nie
wymagają skomplikowanych procedur.
Kolonie w fazie wzrostu logarytmicznego (nigdy w fazie stacjonarnej ani
obumierania!) zawirowuje się i zawiesza w 15% roztworze glicerolu. Voila, teraz
po prostu nasze bakterie przechowujemy w -20 stopniach.
Do krótkotrwałego przechowywania (kilkudniowego) można wykorzystać
schładzane w lodówce szalki lub skosy agarowe, czasami także podłoża płynne.
Istnieje także możliwość wysuszenia naszych mikroogranizmów z zachowaniem
częściowej żywotności (nawet >50%) przy użyciu specjalnej aparatury do
sublimacji. W zamrożeniu z kultur odparowywana jest woda, dzięki czemu
otrzymujemy liofilizat, który może być przechowywany przez długi czas w
zamrożeniu czy też nawet w temperaturze pokojowej bez dostępu wody. Tą
technologią suszone są dobrej jakości drożdże piekarskie i winiarskie, które
kupujemy w saszetkach w sklepach spożywczych.
Ekstrakty komórkowe
Ekstrakty komórkowe nie muszą być utrzymane przy życiu, dlatego istnieje wiele
sposobów na ich przechowywanie.
Jeżeli zależy nam jedynie na materiale DNA lub plazmidowym, można po prostu
zawiesinę lub tkankę zamrozić w buforze. Mniej kłopotliwe w transporcie są
liofilizaty, które bez dostępu wody można przechowywać w temperaturze
pokojowej lub w lodówce.
Do otrzymania lizatów o jakości wystarczającej do badań białek należy się bardziej
przyłożyć. Jeżeli nasze eksperymenty zakładają użycie zdenaturowanych
polipeptydów- nie ma większego problemu, wystarczy inhibicja proteolizy i
zamrożenie lizatu. Jeżeli natomiast potrzebne nam są białka natywne,
postępujemy z reguły tak, jak z hodowlami komórkowymi- zawieszamy lizat w
odpowiednim buforze (zawiera inhibitory proteaz, chelatory i/lub krioprotektanty),
następnie zanurzamy w ciekłym azocie i przechowujemy w co najmniej -70
stopniach. Jeżeli białka które badamy są stabilne (np. kolageny) lub występują w
dużych ilościach w komórce (albuminy, kazeina), możemy spróbować liofilizacji
jako tańszej i mniej kłopotliwej alternatywy.
Przechowywanie krótkoterminowe w lodówce, od kilku dni do nawet miesiąca
czasu jest możliwe przy zastosowaniu buforów zawierających substancje
bakteriobójcze i inhibitory proteaz.
Wycinki tkankowe i bioptaty
Konserwacja skrawków do badań histopatologicznych jest standardowo
wykonywana w pracowniach patologii i polega na maceracji wycinka tkankowego
w zbuforowanym roztworze 10% formaliny, następnie zaś zatopieniu skrawka w
kostce parafiny. Tzw. „bloczki” parafinowe można przechowywać latami bez dużej
straty właściwości biologicznych. O ile RNA w takich kostkach ulega szybkiej lizie,
o tyle chromatyna jądrowa i większość białek (aczkolwiek te częściowo
denaturują) pozostaje nietknięta. Możliwe jest więc prowadzenie analiz
retrospektywnych na DNA (techniki biologii molekularnej i FISH) oraz badań
immunohistochemicznych i histochemicznych. By przygotować preparat
mikroskopowy i wybarwić tkankę należy z bloczka odciąć na mikrotomie
odpowiednie skrawki, „odparafinować” je i wybarwić.
Krótkotrwałe (kilka dni lub tygodni) przechowywanie preparatów tkankowych
możliwe jest w zbuforowanym roztworze formaliny.
Rozmazy cytologiczne
W zależności od typu rozmazu (szpik i krew obwodowa, materiał z biopsji
aspiracyjnych BAC, cytologia ginekologiczna, rozmazy płynów wysiękowych itd.)
stosuje się różne techniki wykonywania rozmazów i różne barwienia.
Przechowywanie takich rozmazów polega w dużym uogólnieniu na przygotowaniu
niebarwionych szkiełek z naniesionym odpowiednio materiałem w kilku (co
najmniej 2) powtórzeniach, dobrym osuszeniu szkiełek, a następnie archiwizacji
ich w suchym i ciemnym pomieszczeniu. Materiał utrwalony na szkiełkach zwykle
nadaje się do barwień cytochemicznych, czasami możliwe jest otrzymanie małych
ilości DNA z takich próbek do badań molekularnych, ale jest ono znacznie gorszej
jakości (i w mniejszej ilości) niż z bloczków parafinowych. Różnie bywa z
oznaczeniami białek: są one często mocno zdenaturowane i mogą nie wykazywać
właściwości antygenowych niezbędnych np. do immunolokalizacji przeciwciałami
mono, a nawet poliklonalnymi.
Preparaty barwione niektórymi barwnikami strąceniowymi można przechowywać
w ciemnym pomieszczeniu przez dłuższy czas, jednak część barwień bleknie już
po kilku dniach (np. FAG) lub tygodniach (barwienia immunofluorescencyjne, np.
FISH)
Jądra komórkowe do techniki FISH
Do badań cytogenetycznych wykorzystuje się bioptaty tkankowe lub świeże
zawiesiny komórkowe. Gdy nie jest możliwe wykonanie badania FISH od razu, lub
gdy zaistnieje potrzeba przechowania prób pochodzących z zawiesiny komórek
(np.w onkologii), można je przechować w dwojaki sposób: albo w postaci
utrwalonych, niewybarwionych szkiełek przechowanych w < -70 stopniach, lub
jako zawiesina komórek utrwalona w mieszaninie metanol-kwas octowy,
przechowywana w zamrożeniu. Bardziej polecana jest ta druga metoda, gdyż
materiał po wykonaniu FISHa jest lepszej jakości niż po nałożeniu na gotowe,
przemrożone szkiełka.
Co do skrawków parafinowych do FISH, postępowanie nie różni się od tego
opisanego w punkcie 4.
Piśmiennictwo:
1. Riggio B. A Beginner’s Guide to Storing Biological Materials. Bitesize Bio, 30
July 2012.
2. El-Danasouri I., Selman H. Vitrification versus conventional cryopreservation
technique. MEFSJ, Bioline, 2005, 10, 3: 205-206.
3. Millipore technical publications: Cell Lysate Extracts-General Protocols, 2007.
Technika FISH — od czego zacząć?
Planujesz rozpoczęcie badań metodą FISH i nie bardzo wiesz, jak się do
tego zabrać? W krótkiej serii artykułów o technice FISH przekonamy Cię,
że metoda ta nie jest wcale trudna i że dzięki naszym wskazówkom bez
problemu zaprojektujesz eksperyment, przeprowadzisz hybrydyzację i
będziesz się cieszyć doskonałej jakości zdjęciami.
W serii tej opowiemy również o nowościach odczynnikowych, które ostatnio
ukazały się na rynku i podpowiemy Wam jakie narzędzia bioinformatyczne
ułatwią Wam pracę z tą techniką.
Od czego zacząć?
Metoda FISH (ang. Fluorescence In SituHybridization) jest dość
kosztowna (koszt przygotowania jednego preparatu to zazwyczaj 500-1200
PLN, niższe ceny proponuje wchodząca na rynek z sondami SureFISH
firma Agilent Technologies, polski dystrybutor Perlan Technologies).
Metoda FISH wymaga stosowania zarówno bardzo precyzyjnych protokołów, jak i
sprawdzonych, pewnych odczynników. Jest również narażona na błędy, które
często powodują zmarnowanie nie tylko włożonej w eksperyment pracy, ale
przede wszystkim stratę bardzo kosztownych sond. Dlatego, aby dobrze
przygotować się do pracy z tą techniką należy przygotować odpowiedni sprzęt i
odczynniki.
Potrzebne odczynniki (w zależności od protokołu i używanych sond):
potrzebne są odczynniki takie jak: ksylen do odparafinowania, etanol, bufory (w
tym bufor hybrydyzacyjny i bufory płuczące), sondy, DAPI, proteaza, woda wolna
od nukleaz, czasem formamid i SSC.
Materiał do badań: skrawek parafinowy, preparat mikroskopowy, utrwalone
chromosomy na szkiełku podstawowym. Przechowywanie przygotowanego
materiału naniesionego na szkiełko: skrawek parafinowy – temperatura pokojowa,
pozostałe: -20 °C.
Potrzebny sprzęt:
— lodówka z zamrażalnikiem
— mikroskop fluorescencyjny z kamerą
— odpowiednie filtry do mikroskopu (jeśli nie jesteś pewien, czy dana sonda
nadaje się pod konkretny rodzaj filtra, który posiadasz — skontaktuj się z
producentem sondy lub dostawcą mikroskopu). Może się zdarzyć, że filtry trzeba
dokupić— w zależności od rodzaju mikroskopu filtry kosztują od kilku do
kilkunastu tysięcy złotych.
— dwie łaźnie wodne
— hybrydyzator
— naczynia Coplina
— klej do dętek
— lakier do paznokci
— pudełko do przechowywania preparatów
— olejek immersyjny
— szkiełka nakrywkowe
Protokół:
— bardzo dokładny protokół i cenne wskazówki dotyczące techniki FISH
można znaleźć tutaj.
–
Zobacz
też
protokół
na
FISH
EGFR: http://dolinabiotechnologiczna.pl/odczynniki/protokol-fish-na-egfr/
Testy aglutynacji latekswej
Niezastąpione w nowoczesnej diagnostyce laboratoryjnej
dla
Ekspansja
powtórzeń
trójnukleotydowych jako podłoże
chorób genetycznych
Niewielu z Was zapewne słyszało nazwę grupy chorób genetycznych
“zespoły ekspansji powtórzeń trójnukleotydowych” (ang. trinucleotide
repeat expansion disorders, TREDs). Ale choroba Huntingtona na pewno
już wszystkim z Was nasuwa pewne skojarzenia. W grupie TREDs znajdują
się także takie zespoły wad wrodzonych jak zespół łamliwego chromosomu
X (Fra-X), ataksje móżdżkowo-rdzeniowe (SCA), albo dystrofia
miotoniczna. Właściwie tych zaburzeń nie łączy nic- poza etiologią
molekularną.
Żeby zrozumieć, skąd biorą się zespoły ekspansji powtórzeń trójnukleotydowych,
musimy przyjrzeć się uważnie strukturze DNA. Wiele rejonów naszego genomu,
tych kodujących i niekodujących, posiada w swoim składzie tzw. mikrosatelity,
czyli powtarzające się motywy sekwencji, złożone z kilku nukleotydów. Ilość
powtórzeń w takich mikrosatelitach jest bardzo zmienna w populacji- dzięki tej
zmienności możliwe jest np. identyfikowanie osób w genetyce sądowej.
Unikatowym wariantem powtórzeń mikrosatelitarnych są powtórzenia tripletowe,
np. CTGCTGCTGCTGCTGCTG… Sekwencje tego typu są wyjątkowe z dwóch
powodów: po pierwsze, gdy znajdują się w rejonie kodującym, zmiana ilości
powtórzeń tylko nieznacznie uszkadza białko (zwiększając bądź zmniejszając
liczbę aminokwasów, ale nie zmieniając całej C-końcowej sekwencji, czyli ramki
odczytu). Po drugie, powtórzenia trzech nukleotydów tworzą często na poziomie
pojedynczej nici DNA lub RNA motywy spinki do włosów, czyli z angielska
„hairpin” (pokazane na ryc. 1). Takie „spinki” są bardzo trwałe i mogą zaburzać
mechanizmy transkrypcji i edycji RNA, co powoduje symptomy choroby nawet bez
ingerencji na poziomie białka.
Rycina 1. Struktura spinki do włosów formowana przez serię powtórzeń
trójnukleotydowych
Tworzenie się „spinek” jest zresztą główną siłą sprawczą TREDs i w ogóle
zmienności liczby powtórzeń – na etapie replikacji jedna z nici w obrębie
sekwencji mikrosatelitarnej może „zawinąć się”, co powoduje dobudowanie do
niej przez polimerazę większej liczby kolejnych powtórzeń, niż wynikałoby to z
komplementarności DNA. Mechanizm działa też w drugim kierunku, zmniejszając
liczbę powtórzeń w kolejnych cyklach replikacji (Rycina 2).
Rycina 2. Powtórzenia w kolejnych cyklach replikacji.
Ze względu na podobieństwo mechanizmów powstawania TREDs, a nie na wspólne
geny zaangażowane w patogenezę tych chorób, manifestacja kliniczna jest bardzo
różna. Prześledzimy dwa przykłady: chorobę Huntingtona, w której powtórzenia
znajdują się w obrębie sekwencji kodującej, oraz zespół Fra-X, w którym zaburzenie
na poziomie DNA nie wpływa na strukturę białka, ale na jego ekspresję.
CHOROBA HUNTINGTONA
Choroba Huntingtona (ang. Huntington’s disease, HD) zwana jest pląsawicą ze
względu na typowe zaburzenia neurologiczne, powodujące niekontrolowane ruchy
kończyn u osoby chorej Poza postępującą niepełnosprawnością fizyczną chorzy
stopniowo doznają otępienia umysłowego i żyją przeciętnie około 20 lat od
momentu zauważenia objawów. Choroba zwykle ujawnia się w wieku dorosłym,
chociaż istnieje odwrotnie proporcjonalna zależność pomiędzy ilością
powtórzonych trójek nukleotydowych a wiekiem ujawnienia schorzenia.
W chorobie Huntingtona genem, w którym dochodzi do multiplikacji powtórzeń
CAG jest gen HTT, huntingtina. Ekspansja trójek nukleotydowych zachodzi w
sekwencji kodującej białko, powodując zwiększenie ilości powtórzeń aminokwasu
glutaminy (tzw. trakt poliQ). W prawidłowej huntingtinie znajduje się poniżej 26
powtórzeń CAG, natomiast liczba ta może przeroczyć 40, powodując
pełnoobjawową pląsawicę. HD dziedziczy się w sposób autosomalny dominujący,
wystarczy więc jedna uszkodzona kopia HTT do zainicjowania choroby.
Niestety mimo ciągłych badań,wciąż nie do końca wiadomo, dlaczego uszkodzenie
Htt powoduje neurologiczne symptomy choroby. Funkcje huntingtiny są bardzo
róznorodne, ulega ona ekspresji w wielu tkankach i jest związana funkcjonalnie z
co najmniej 100 innymi białkami. Najważniejsza w procesie neurodegeneracji
wydaje się być funkcja antyapoptotyczna tego białka- zaburzenia jego struktury
przez dodatkowe ciągi glutaminowe mogą tę funkcję osłabiać. Co jednak
istotniejsze, sama glutamina lub trakt poliQ stanowić może element najbardziej
uszkadzający neurony. Niefunkcjonalne zmutowane białko jest cięte na fragmenty
i rozkładane, ale łańcuchy poliglutaminowe zostają nietknięte. Peptydy złożone z
poliglutaminy agregują ze sobą, dając objawy typowe dla neurodegeneracyjnej
choroby spichrzeniowej. Ten sam mechanizm występuje także w innych chorobach
z ekspansją poliQ, np. w SCID.Drugą wspólną cechą HD i SCID jest antycypacja
genetyczna. To zjawisko powoduje narastanie ilości powtórzeń w kolejnych
pokoleniach i coraz młodszy wiek ujawnienia choroby.
ZESPÓŁ ŁAMLIWEGO CHROMOSOMU X
Zespół łamliwego chromosomu X (ang. fragile X, Fra-X) to najczęstsza spośród
chorób związanych z tzw. łamliwością chromosomu X. Fra-X jest pierwszą chorobą
z grupy TREDs, którą opisano w literaturze (rok 1991). Choroba objawia się
licznymi zmianami dysmorficznymi, takimi jak pociągła twarz, duże uszy,
płaskostopie, czy też duże jądra u mężczyzn. Zaburzenia intelektualne są dużo
mocniej wyrażone- chorych cechuje zespół zachowań zaliczanych do spektrum
autyzmu oraz zaburzenia funkcji poznawczych o bardzo różnym nasileniu
(zależnym od penetracji defektu w FRM1).
Zespól łamliwego chromosomu X Powodowany jest przez zwiększenie ilości
powtórzeń CGG w obrębie sekwencji 5′ UTR genu FRM1. Uszkodzony gen ulega
zmniejszonej ekspresji, powodując niedobór białka FRMP, niezbędnego do
prawidłowego rozwoju neuronów. Ze względu na występowanie tego genu na
chromosomie X, praktycznie wszyscy mężczyźni obarczeni defektem chorują,
podczas gdy za sprawą atenuacji u kobiet znacznie mniejszy odsetek wykazuje
symptomy choroby. Mimo niemendlowskiego obrazu dziedziczenia, choroba jest
uznana za autosomalną dominującą.Nazwa zespołu Fra-X jest związana z pierwszą
metodą diagnostyki genetycznej tego zaburzenia, w której poszukiwano łamliwych
miejsc w kariotypie komórek hodowanych w ubogofolianowym podłożu. Metoda
była mało wiarygodna, stąd szybko zastąpiono ją techniką PCR.
Oprócz typowego Fra-X zidentyfikowano jeszcze 3 inne zespoły wad wrodzonych,
w których dochodzi do ekspansji trójek nukleotydowych na chromosomie X
(FRAXA, FRAXE, FRAXF). Objawiają się one podobnie do Fra-X, ale z reguły mają
łagodniejszy przebieg.
Zespoły ekspansji trójek nukleotydowych są efektem zjawiska
nieprawidłowej rekombinacji i zauważono, że zachodzą nie tylko u ludzi,
ale także u bezkręgowców (muszka owocowa). Dowodzi to, że jest to
niedoskonałość systemu replikacji w ogóle, a nie ułomność gatunku
ludzkiego. Można zastanawiać się, dlaczego natura nie próbowała
udoskonalić mechanizmów rekombinacji tak, by zapobiegać ekspansji
trójek. Prawdopodobnie jednak nie byłoby to korzystne, ponieważ z tych
samych mechanizmów niehomologicznej rekombinacji korzysta ewolucja w
procesie specjacji i adaptacji. Ograniczenie swobody replikacji nie mogło
wiec mieć miejsca- chorobotwórcze błędy wpisane są w naturę organizmów
żywych i nic na to nie poradzimy.
Piśmiennictwo:
Strelnikov, V. et al. A simple multiplex FRAXA, FRAXE, and FRAXF PCR assay
convenient for wide screening programs. Human Mutations, 1999, 13, 2: 166-169.
Petruska, J. et al. Analysis of Strand Slippage in DNA Polymerase Expansions of
CAG/CTG Triplet Repeats Associated with Neurodegenerative Disease. J Biol
Chem, 1998, 273, 9: 5204-5210.
Międzynarodowa
Konferencja
Naukowo‐Szkoleniowa Państwowej
Inspekcji Sanitarnej
Państwowa
Inspekcja
Sanitarna
zaprasza
na
VI
Międzynarodową Konferencję Naukowo‐Szkoleniową dotyczącą zdrowia
publicznego i współpracy transgranicznej w zapobieganiu chorobom
zakaźnym. Konferencja odbędzie się w dniach 18‐20 maja 2015 r. w
Ostródzie. Lekarze i diagności laboratoryjni biorący udział w konferencji,
otrzymają punkty edukacyjne.
Ramowy program konferencji:
1. Żywność – suplementy, zanieczyszczenia chemiczne i mikrobiologiczne,
pozostałości leków.
2. Choroby zakaźne – nowe zagrożenia.
3. Wybrane zagadnienia onkologiczne. Pakiet onkologiczny.
4. Odnawialne źródła energii. Wpływ na zdrowie i środowisko.
5. Wymagania sanitarno‐epidemiologiczne w podmiotach wykonujących
działalność leczniczą.
Szczegółowy
program
konferencji
znajduje
się
stronie: http://konferencja.sanepid.olsztyn.pl/
Testy aglutynacji latekswej
Niezastąpione w nowoczesnej diagnostyce laboratoryjnej
Konferencja odbędzie się pod patronatem:
Głównego Inspektora Sanitarnego Marka Posobkiewicza
Głównego Lekarza Weterynarii Marka Pirsztuka
Wojewody Warmińsko‐Mazurskiego Mariana Podziewskiego
Udział w konferencji zadeklarowali przedstawiciele służb medycznych i
weterynaryjnych Litwy, Rosji, Ukrainy, Białorusi, Czech i Gruzji
Organizatorzy konferencji:
Wojewódzka Stacja Sanitarno‐Epidemiologiczna w Olsztynie
Warmińsko‐Mazurskie Stowarzyszenie Higieny i Zdrowia Publicznego w Olsztynie
Powiatowa Stacja Sanitarno‐Epidemiologiczna w Ostródzie
Wojewódzki Inspektorat Weterynaryjny w Olsztynie
Podstawy cytometrii przepływowej
– materiały do nauki
Jeżeli chcecie pogłębić Waszą znajomość podstaw cytometrii
przepływowej, zapraszamy do przeczytania naszego artykułu oraz
obejrzenia kilku bardzo fajnych filmów, które przybliżą Wam podstawy
metody oraz analizy danych. Jest to bardzo cenna pomoc przy
przygotowaniu
do
egzaminu
czy
kolokwium.
https://www.youtube.com/watch?v=2P7YsJ0Zkio
https://www.youtube.com/watch?v=sfWWxFBltpQ
https://www.youtube.com/watch?v=ccR5snuCE80
Ruszają targi Eurolab 2015
Od dzisiaj w Warszawie trwają targi Eurolab 2015 dedykowane branży
laboratoryjnej. Targi odbywają się w dn. 18-20 marca 2015 w Centrum
Targowo-Kongresowym MT Polska w Warszawie, przy ul. Marsa 56C.
Na targach zostanie przedstawiona oferta produktów i rozwiązań, które mają
zastosowanie w branży chemicznej, farmaceutycznej, kosmetycznej,
elektronicznej, spożywczej, naukach przyrodniczych czy kryminalistyce.
Producenci i dystrybutorzy wyposażenia do wszelkiego rodzaju laboratoriów,
ośrodków badawczych czy instytucji naukowych zaprezentują meble, sprzęt,
instrumenty i artykuły analityczne i laboratoryjne, materiały zużywalne,
odczynniki chemiczne i materiały odniesienia. Oferta obejmie także projekty
informatyczne i oprogramowanie, odzież ochronną, rozwiązania techniczne i
technologie niezbędne do prac badawczo-rozwojowych.
Testy aglutynacji latekswej
Niezastąpione w nowoczesnej diagnostyce laboratoryjnej
Dodatkowo wystawcy będą prowadzili wykłady i szkolenia połączone z prezentacją
produktów i urządzeń, co stanowi okazję do poznania ich szczegółowego
funkcjonowania.
Crimelab
Do profesjonalistów zajmujących się na co dzień zagadnieniami związanymi z
techniką kryminalistyczną skierowane są specjalistyczne konferencje. Słuchacze
dowiedzą się o zmianach wynikających z nowelizacji Kodeksu postępowania
karnego, zapoznają się z nowościami w zakresie badania mikrośladów, jak
również poszerzą wiedzę na temat zabezpieczania dokumentów i najczęściej
pojawiających się fałszerstw. Na szczególną uwagę zasługuje inscenizacja miejsca
zdarzenia, podczas której oględzin dokonywać będą technicy kryminalistyczni z
Polski i Wielkiej Brytanii.
Szkolenia i konferencje
Bardzo ważną częścią Targów EuroLab oraz CrimeLab są seminaria i konferencje
naukowe, podczas których poruszane są aktualne zagadnienia dla branży
analitycznej, pomiarowej i kryminalistycznej. Nad programem merytorycznym
czuwa Rada Programowa.
Diagności laboratoryjni mogą uzyskać 11 punktów edukacyjnych za udział w 4
bezpłatnych specjalistycznych spotkaniach, które odbędą się pierwszego i
drugiego dnia Targów EuroLab. Konferencje te zorganizują: Polskie Towarzystwo
Diagnostyki Laboratoryjnej (PTDL), Klub Polskich Laboratoriów Badawczych
POLLAB wraz z Polskim Komitetem Normalizacyjnym oraz Komitet Mikrobiologii
PAN wspólnie z Polskim Towarzystwem Mikrobiologów.
Organizator targów, firma MT Targi Polska, zaprasza do udziału w następujących
wydarzeniach:
„Akredytacja w obszarach regulowanych. Zasady, uwarunkowania i stan
aktualny”, Polskie Centrum Akredytacji;
„Automatyzacja, informatyzacja, integracja – medyczne laboratorium
diagnostyczne XXI wieku”, „Biologia systemów w medycynie – “omiki” w
diagnostyce laboratoryjnej”, Polskie Towarzystwo Diagnostyki
Laboratoryjnej;
„Problemy laboratoriów”, Klub Polskich Laboratoriów Badawczych
POLLAB, Polski Komitet Normalizacyjny;
„Zakażenia – problemy terapeutyczne”, Komitet Mikrobiologii PAN,
Polskie Towarzystwo Mikrobiologów;
„Polska biotechnologia: sukcesy, legislacja, perspektywy w 2015 r.”,
Komitet Biotechnologii PAN;
„Zdrowie, leki, chemia”, Wydział Chemii Uniwersytetu Warszawskiego,
Centrum Nauk Biologiczno-Chemicznych Uniwersytetu Warszawskiego,
Komitet Chemii Analitycznej PAN, Polskie Towarzystwo Chemiczne, II
Wydział Lekarski, Wydział Farmaceutyczny Warszawskiego Uniwersytetu
Medycznego;
„Bezmiar widma światłem mierzony”, Główny Urząd Miar;
„Świat technik sprzężonych”, Katedra Chemii Analitycznej Wydziału
Chemicznego Politechniki Warszawskiej;
„Mikrosonda elektronowa i jonowa – nowe kierunki badań
mikrochemicznych nie tylko dla geologii”, Państwowy Instytut
Geologiczny – PIB;
„Miejsce zdarzenia”, Centralne Laboratorium Kryminalistyczne Policji –
Instytut Badawczy, Polskie Towarzystwo Kryminalistyczne;
„Mikroślady kryminalistyczne w odtwarzaniu przebiegu zdarzenia
przestępczego”, Instytut Ekspertyz Sądowych im. Prof. dra Jana Sehna w
Krakowie;
cykl wykładów Komendy Głównej Straży Granicznej;
„Fundusze Europejskie do 2020 roku na badania i rozwój”, Ministerstwo
Infrastruktury i Rozwoju, VWR International.
Informacje organizacyjne
Wstęp na Targi EuroLab oraz CrimeLab jest bezpłatny po dokonaniu
obowiązkowej rejestracji. Oba wydarzenia będą otwarte w godzinach 9:00-17:00
w dniach 18 i 19 marca, natomiast 20 marca w godzinach 9:00-15:00. Więcej
informacji na stronie: www.targi.eurolab.pl
Dojazd
Organizator zapewnia udogodnienia w zakresie dojazdu do Centrum TargowoKongresowego. Na targi będzie można dostać się bezpłatnym autobusem
targowym z przystanku autobusowego Emilii Plater 01 naprzeciwko Pałacu
Kultury i Nauki oraz pociągiem SKM lub Kolei Mazowieckich z dworca Warszawa
Śródmieście, Warszawa Wschodnia lub Warszawa Zachodnia. Stacja docelowa
Warszawa Gocławek znajduje się w odległości około 700 metrów od Centrum MT
Polska. Czas dojazdu pociągiem z centrum Warszawy do stacji docelowej nie
powinien przekroczyć 20 minut.
Przydatność
diagnostyczna
elektroforezy białek
W ludzkiej krwi znajduje się kilkaset białek, jednak zaledwie 100 z nich
zostało scharakteryzowanych pod względem strukturalnym oraz
czynnościowym. Poziom białka całkowitego w surowicy krwi waha się w
granicach 6,6-8,7 g/dl i może ulegać zmianie w zależności od stanu
zdrowia człowieka. Obok wahań ilościowych białka całkowitego mogą
występować zmiany w proporcjach poszczególnych białek, czyli tzw.
dysproteinemia [2].
Elektroforeza białek surowicy (proteinogram) jest podstawowym badaniem
laboratoryjnym umożliwiającym wykrycie dysproteinemii, dając odpowiedzi na
często trudne zagadnienia diagnostyczne.
Proteinogram pozwala zwykle na uzyskanie 6 frakcji białkowych. Wśród nich
znajduje się największa homogenna frakcja albumin oraz pozostałe frakcje
reprezentujące globuliny: α-1, α-2, β-1, β-2 oraz γ-globuliny. Poszczególne frakcje
składają się z różnych białek specyficznych o zbliżonym ładunku i ruchliwości
elektroforetycznej, ale o odmiennej budowie i funkcji biologicznej [1, 4].
Tab. 1. Prawidłowy udział frakcji białkowych w rozdziale
elektroforetycznym [3]
Stężenia poszczególnych białek we frakcjach mogą ulec zmianie, ale procentowy
udział niektórych z nich jest tak niewielki, że nie wpływa to ani na poziom białka
całkowitego, ani na zmianę udziału odsetka danej frakcji w elektroforezie. Dlatego
poniżej zostaną omówione tylko te, które mają największe znaczenie
diagnostyczne.
ALBUMINA
Albumina (35-52 g/l) jest produkowana w wątrobie i stanowi 2/3 białek osocza.
Utrzymuje ciśnienie osmotyczne krwi oraz jest głównym białkiem transportowym,
które wiąże nieswoiście związki słabo rozpuszczalne w wodzie (np. kwasy
żółciowe, bilirubinę, miedź, wapń). W rozdziale elektroforetycznym albumina
umiejscawia się najbliżej katody [2, 3].
Obniżenie frakcji albumin może wynikać ze zwiększonej utraty białka z moczem
(np. w zespole nerczycowym) lub z układem pokarmowym (enteropatia
wysiękowa). Do hipoalbuminemii dochodzi również w przewlekłym niedożywieniu,
oparzeniach, wstrząsie oraz w ciężkiej niewydolności wątroby. Ze względu na
dużą pulę rezerwową albuminy w wątrobie, hipoalbuminemia występuje w
przypadku znacznego uszkodzenia tego narządu. Synteza albuminy jest
hamowana w reakcjach ostrej fazy, w nowotworach, szpiczaku plazmocytowym,
zespole Cushinga i chorobie Gravesa-Basedowa [2, 5, 6].
Wzrost frakcji albumin wskazuje na ostre odwodnienie i towarzyszy wzrostowi
innych białek [2].
Bisalbuminemia: uwarunkowane genetycznie występowanie dwóch odmian
albumin. W niektórych przypadkach może występować przejściowa
bisalbuminemia, która wynika ze zdolności albuminy do wiązania np. kwasów
żółciowych w ostrym zapaleniu trzustki, bilirubiny w chorobach wątroby lub
penicyliny w trakcie terapii wysokimi dawkami tego antybiotyku [4,5].
Analbuminemia: bardzo rzadko występujący, dziedziczny brak frakcji albuminowej
(ok. 0,5 g/dl). Pacjenci z analbuminemią mają niskie ciśnienie tętnicze i
umiarkowane obrzęki [1, 4].
FRAKCJA α-1-GLOBULIN
Orozomukoid, czyli α-1-kwaśna glikoproteina (0,5-1,5 g/l) jest białkiem ostrej
fazy, mającym udział w agregacji płytek i rozszerzaniu naczyń krwionośnych. α-1antytrypsyna (0,9-2,0 g/l) stanowi 90% osoczowych α-1-globulin i jest obecna w
wielu tkankach, głównie w płucach, gdzie chroni pęcherzyki płucne przed
działaniem elastazy granulocytowej [2, 3].
Testy aglutynacji latekswej
Niezastąpione w nowoczesnej diagnostyce laboratoryjnej
Zmniejszenie frakcji α-1-globulin związane jest głównie z wrodzonym niedoborem
α-1-antytrypsyny, który prowadzi do rozwoju rozedmy płuc oraz rzadziej chorób
wątroby. Zmniejszenie tej frakcji może być także następstwem niedożywienia lub
niewydolności wątroby i zazwyczaj towarzyszy mu spadek innych frakcji [1, 5, 6].
Wzrost frakcji α-1-globulin najczęściej wynika ze wzrostu białek ostrej fazy, takich
jak orozomukoid. Poziom orozomukoidu wolno wzrasta do 5 dnia odczynu
zapalnego, nie przekraczając 3-krotnie wartości referencyjnej. Największe
znaczenie kliniczne przypisuje się temu białku w rozpoznawaniu infekcji
bakteryjnych w okresie noworodkowym. Wzrost stężenia orozomukoidu u
noworodków w zakresie 6-8 g/l jest wskaźnikiem sepsy. Wzrost frakcji α-1globulin może wynikać również ze znacznego wzrostu α-fetoproteiny (AFP) w
nowotworach i u kobiet w ciąży, a także wynikać z podwyższenia stężenia α-1antytrypsyny w chorobie Crohna [1, 3, 5, 6].
FRAKCJA α-2- GLOBULIN
Haptoglobina (30-200 mg/dl) jest białkiem ostrej fazy, odpowiedzialnym za
wiązanie i transport hemoglobiny oraz miedzi. Ceruloplazmina (20-60 mg/dl)
odpowiada za 80% właściwości oksydacyjnych osocza, powodując utlenianie
żelaza i umożliwiając jego łączenie z transferryną. α-2-makroglobulina (130-300
mg/dl) stanowi 1/3 białek omawianej frakcji, jej duża masa cząsteczkowa
uniemożliwia przechodzenie tego białka poza łożysko naczyniowe.
Tyreoglobulina (9,6-18 mg/l) jest białkiem odpowiedzialnym za syntezę i
magazynowanie hormonów tarczycy [2, 5].
Zmiany w zakresie frakcji α-2-globulin:
Obniżenie frakcji α-2-globulin występuje w przypadku niewydolności wątroby,
utraty białka, np. z moczem, a także w wyniku hemolizy wewnątrznaczyniowej.
Zmniejszenie się stężenia haptoglobiny jest najczulszym i najbardziej swoistym
markerem hemolizy wewnątrznaczyniowej.
Na obniżenie frakcji α-2-globulin może mieć również wpływ niedobór
ceruloplazminy w chorobie Menkesa i Wilsona (poniżej 150 mg/l) [2, 6].
Ze wzrostem frakcji α-2-globulin mamy do czynienia w stanach zapalnych, co
wynika z 15% wzrostu haptoglobiny i ceruloplazminy oraz w zespole
nerczycowym, w którym rośnie poziom α-2-makroglobuliny. Wzrost poziomu
haptoglobiny może występować również w chłoniaku ziarniczym i w cholestazie, a
także u osób leczonych kortykosterydami, natomiast wzrost tyreoglobuliny w
nadczynności tarczycy [1,2,6].
Ryc.
1.
Ostra
faza-
podwyższenie
frakcji
globulin α-1 i α-2. Wzrost
tylko frakcji α-1 można
obserwować w przewlekłym
zapaleniu wątroby i w ostrej
fazie, której towarzyszy
hemoliza [4].
Ryc. 2. Zespół nerczycowy –
obniżenie albumin i frakcji γ
w połączeniu ze wzrostem
α-2-globulin. Obniżenie
stężenia albumin musi być
rzędu 1/3 ich prawidłowej
wartości,
aby
było
uwidocznione
w
elektroforezie [4].
Frakcja podwójna może być wynikiem użycia surowicy wykazującej ślady hemolizy
lub występującej rzadko nietypowej migracji elektroforetycznej apolipoproteiny B
[1,4].
FRAKCJA β-GLOBULIN
Frakcja β-1-globulin składa się głównie z transferyny (200-400 mg/dl), która
transportuje żelazo do szpiku kostnego. W skład β-2-globulin wchodzą βlipoproteiny, β-2-mikroglobulina, IgA, IgM, czasem IgG oraz białka
dopełniacza, z których składnik C3 (90-180 mg/dl) ma największy udział
procentowy tej frakcji [2, 3].
Zmiany w zakresie frakcji β-globulin:
Obniżenie frakcji β-globulin następuje w wyniku znacznego obniżenia stężenia
transferyny, co ma miejsce w niedożywieniu, nowotworach oraz reakcjach ostrej
fazy. Spadek tej frakcji może wynikać z obniżenia stężenia C3, co związane jest
głównie ze starzeniem się próbki i dezaktywacją dopełniacza, a także w chorobach
autoimmunologicznych, np. toczniu rumieniowatym i reumatoidalnym zapaleniu
stawów [1, 3, 6].
Wzrost frakcji β-globulin występuje w niedoborze żelaza, czego konsekwencją jest
wzrost stężenia transferyny. Wzrost udziału tej frakcji ma miejsce w chorobach
wątroby, głównie w marskości. Może być też wynikiem występowania białka
monoklonalnego a także wolnych łańcuchów kappa i lambda w przebiegu
szpiczaka mnogiego. Wzrost stężenia β-2-mikroglobuliny powyżej 35 mg/l jest
negatywnym markerem prognostycznym szpiczaka mnogiego [1, 3, 6].
FRAKCJA γ-GLOBULIN
Jest głównym miejscem lokowania się immunoglobulin.
Zmiany w zakresie frakcji γ-globulin:
Obniżenie frakcji γ-globulin jest stanem fizjologicznym u noworodków. U
dorosłych może wynikać z zaburzeń odporności spowodowanych chemio- i
radioterapią, leczeniem immunosupresyjnym oraz podawaniem kortykoidów. Jest
to również objaw charakterystyczny dla szpiczaka produkującego wolne łańcuchy
[1, 4].
Ryc. 3. Hipogammaglobulinemia –
wyraźny spadek stężenia γ-globulin [1].
Wzrost frakcji γ-globulin w postaci rozlanego prążka jest typowy dla tzw.
gammapatii poliklonalnych obserwowanych w przebiegu przewlekłego
zapalenia, a także chorób nowotworowych, AIDS i niektórych chorób o podłożu
autoimmunologicznym (np. chorobie Crohna).
W niewydolności wątroby występuje gammapatia poliklonalna z
charakterystycznym mostkiem gamma-beta między tymi dwoma strefami.
Ostry, jednorodny szczyt w rejonie γ-globulin, powodujący zniekształcenie strefy
beta i gamma, świadczy o gammapatiach monoklonalnych związanych
zazwyczaj z procesem rozrostowym, takim jak makroglobulinemia Waldenstroma,
szpiczak mnogi czy pierwotna amyloidoza. Między frakcją beta i gamma lokuje się
białko C-reaktywne, dlatego w wyniku wybitnego wzrostu tego białka ostrej fazy
może dochodzić do uwidocznienia słabego prążka we frakcji γ-globulin [1, 3, 4].
Ryc. 4. Mostek β-γ – obraz zlania frakcji
beta i gamma, charakterystyczny dla
marskości wątroby, a także
reumatoidalnego zapalenia stawów i
przewlekłych
stanów zapalnych [1].
Ryc. 5. Gammapatia monoklonalna –
ostry, jednorodny szczyt w rejonie γglobulin [1].
Proteinogram białek surowicy dostarcza istotnych informacji o stanie
klinicznym pacjenta. Największe znaczenie przypisuje się analizie
rozdziału całościowo, z ewentualnym uzupełnieniem o oznaczanie
ilościowe poszczególnych białek. Szczególnego opracowania wymaga
pojawianie się frakcji białka monoklonalnego oraz obecność białka
całkowitego powyżej 8,6 g/dl.
Piśmiennictwo:
1. Bobilewicz D. Elektroforeza w praktyce laboratoryjnej. Cz. 1 Rozdział
elektroforetyczny białek surowicy. Przegl Med Lab, 2005; 4, 2: 3-6.
2. Bobilewicz D., Jasińska A, Kowalska K. Diagnostyka medyczna. Białka w
pytaniach i odpowiedziach. Warszawa, 2010; Roche Diagnostics.
3. Dembińska-Kieć A., Naskalski W. J. Diagnostyka laboratoryjna z elementami
biochemii klinicznej. Wrocław, 2005; Elsevier Urban & Partner.
4. Giot J-F. Agarose gel electrophoresis – applications In clinical chemistry. JMB,
2010; 29:9-14.
5. Keren F. D., Protein electrophoresis in clinical diagnosis. 2003; Edward Arnold.
6. O’Connell X. T., Horita J. T., Kasravi B. Understanding and Interpreting Serum
Protein Electrophoresis. American Falimy Physician, 2005; 71, 1:105-112.
Mikrobiologia
serologii
i
genetyka
w
Serologia i transfuzjologia to szczególne działy diagnostyki laboratoryjnej.
Wykorzystują one wiedzę z zakresu mikrobiologii i genetyki.
Wielu z Was zapyta: Co ma wspólnego mikrobiologia i genetyka z serologią? Otóż
ma wiele wspólnego.
Primum non nocere.
Szeroka gama preparatów krwiopochodnych przygotowywana jest w taki sposób,
aby nie zaszkodzić biorcy. Odpowiednie testy diagnostyczne pozwalają na
wyeliminowanie krwi od dawców zakażonych HIV, HBV, HCV.
W przypadku osocza i krioprecypitatu stosuje się karencję. Zabieg ten zmniejsza
możliwości przeniesienia zakażeń wirusowych poprzez ich przetoczenie.
Karencjonowanie polega na sprawdzeniu wyników wirusologicznych (HIV, WZW
typu B, WZW typu C, kiła) u dawcy w dniu pobrania materiału oraz po
przynajmniej 16 tygodniach przechowywania składnika krwi. Karencjonowanie ma
na celu eliminację tzw.„okienka serologicznego” u dawcy.
Niektórzy pacjenci z obniżoną odpornością powinni otrzymać preparaty
krwiopochodne nie zawierające CMV. Należą do nich biorcy przeszczepów,
pacjenci z ciężkim niedoborem odporności, kobiety ciężarne nie posiadające p/c
anty-CMV, wcześniaki o małej wadze urodzeniowej oraz płody. Ze względu na
fakt, ze CMV namnaża się wewnątrzkomórkowo, tworząc charakterystyczne
wtręty w jądrze i cytoplazmie komórek, ryzyko przeniesienia wirusa podczas
przetaczania świeżych składników krwi, zawierających mono- i wielojądrzaste
leukocyty, jest bardzo duże
Kontrola mikrobiologiczna składników krwi sięga jeszcze głębiej..
Pracownie, w których przygotowywane są składniki krwi, poddawane preparatyce
otwartej, są systematycznie kontrolowane pod względem sterylności używanej
komory z laminarnym przepływem powietrza.
Każdy koncentrat krwinek płytkowych (KKP), podlega kontroli bakteriologicznej,
w przypadku, gdy jego czas przechowywania został przedłużony do 7 dni.
Jakie infekcje mogą zostać przekazane drogą transfuzji?
Potencjalnym niebezpieczeństwem jest HBV, HCV, HIV, HTLV i CMV.
Nosicielstwo oraz okres latencji wirusa zwiększają prawdopodobieństwo jego
niewykrycia. Dlatego też ciągle udoskonala się testy oraz schematy postępowania
diagnostycznego.
W Wielkiej Brytanii problemem stał się wariant choroby Creutzfeldta-Jakoba
(vCJD). Choroba dotyczy ośrodkowego układu nerwowego. Wywołana jest przez
tzw. priony czyli infekcyjne białka, występujące powszechnie w każdym
organizmie i całkowicie niegroźne. Dopiero w sytuacji, gdy zmieniają one swoją
naturalną konformację, stają się białkiem prionowym infekcyjnym. Białko to jest
nierozpuszczalne, zaczyna odkładać się na neuronach i powoduje zaburzenia w
pracy układu nerwowego. Priony są zazwyczaj odporne na standardowe warunki
sterylizacji, co zwiększa ryzyko zakażenia. Wirus vCJD często nie daje objawów
swojej obecności przez wiele lat. Testy wykrywające vCJD są drogie i
niespecyficzne. Istnieje potencjalne ryzyko zakażenia poprzez składniki krwi –
odnotowano 4 przypadki przeniesienia vCJD [1]. Poszukuje się skutecznego
sposobu usuwania infekcyjności prionów we krwi. Teoretycznie można do tego
celu wykorzystać leukoredukcję, która jest z powodzeniem stosowana w
przypadku obniżania możliwości transmisji CMV, ludzkiego wirusa Tlimfotropowego (HTLV I) oraz wirusa Epsteina-Barra(EBV). Naukowcy jednak nie
są zgodni co do wpływu leukoredukcji na vCJD [2].
W Ameryce kilku biorców zostało zakażonych Wirusem Zachodniego Nilu
(WNV) drogą transplantacji [3]. W Stanach Zjednoczonych zanotowano ponad 60
możliwych transfuzjologicznych zakażeń WNV, z czego koło 20 potwierdziło się
[4]. Kilkanaście przypadków rozwinęło objawy ostrego zapalenia opon mózgowych
, kilka zakończyło się zgonem. Wszyscy badani biorcy dali wynik pozytywny w
PCR [5].
Dziedziczenie grup krwi
W układzie ABO istnieją 4 antygeny: A, A1, B, AB. Różna kombinacja tych
antygenów prowadzi do powstania jednej z grup: A, B, AB, O. Antygeny A i B są
kontrolowane przez geny trzech oddzielnych loci: ABO, H h, Se se. Allele A, B i O
umiejscowione są na długim ramieniu chromosomu 9 w locus ABO.
Podczas, gdy gen O jest genem amorficznym, geny A i B kodują swoiste
glikozylotransferazy. Antygen A jest wynikiem przyłączenia Nacetylogalaktozaminy do łańcucha H za pomocą swoistej transferazy wytwarzanej
przez gen A. Antygen B powstaje poprzez przyłączenie D-galaktozy do łańcucha H
dzięki aktywności transferazy produkowanej przez gen B. Białko kodowane przez
gen O nie ma aktywności transferazy, stąd też osoby z grupą krwi O posiadają nie
przekształcony antygen H.
Antygeny układu ABO powstają bardzo wcześnie w życiu płodowym, a zmienna
liczba determinant antygenowych może prowadzić do powstania różnych odmian
antygenów A i B.
Dziedziczenie głównych grup krwi podlega prawom Mendla. W układzie ABO
związek między fenotypem a genotypem jest następujący:
Fenotyp A – genotyp AA lub AO
Fenotyp B – genotyp BB lub BO
Fenotyp AB – genotyp AB
Fenotyp O- genotyp OO
Tabela 1. Dziedziczenie grup krwi w układzie ABO
Oprócz układu ABO istotną częścią immunologii transfuzjologicznej jest
układ Rh. Antygeny układu Rh kodowane są przez dwie pary genów sprzężonych,
leżące na krótkim ramieniu chromosomu 1. Jeden gen koduje polipeptyd RhD,
drugi polipeptydy RhCc/Ee i posiada 4 allele: RhCe, Rhce, RhcE, RhCE.
Elementem niezbędnym do syntezy układu Rh jest glikoproteina RhAG
(chromosom 6). W układzie Rh występowanie genotypu DD oraz Dd wiąże się z
Rh+, natomiast genotypu dd z Rh-. Antygen d nie istnieje, ale oznacza brak
antygenu D. Genotyp układu Rh można ustalić tylko na podstawie
wielopokoleniowych badań rodzinnych.
Tabela 2. Dziedziczenie czynnika Rh przez potomstwo
Bada się możliwość enzymatycznej konwersji grup in vitro poprzez degradację
antygenu A i B [6]. W celu wytwarzania krwi uniwersalnej, prowadzono badania
nad konwersją grup A1, A2, B, A1B do grupy O. Do usunięcia antygenów z
powierzchni krwinek użyto bakteryjnych glikozydaz [7] oraz rekombinowanej
endo-beta-galaktozydazy [8].
Serologia grup krwi wykazuje istotny związek nie tylko z mikrobiologią i
genetyką, ale także ze zwiększonym ryzykiem niektórych stanów, w zależności
od posiadanej grupy krwi.
Testy aglutynacji latekswej
Niezastąpione w nowoczesnej diagnostyce laboratoryjnej
Osobnicy z grupą krwi O posiadają podwyższone ryzyko rozwoju niektórych
infekcji wirusowych [9] oraz zaburzeń krzepnięcia, podczas gdy osobnicy z inną
niż O grupą krwi wykazują większą zapadalność na niektóre nowotwory [9, 10, 11
, 12]. Ponadto należy przypomnieć o związku grupy krwi O z malarią. Nie chroni
ona przed chorobą, ale liczne badania sugerują, że osoby z grupą krwi O łagodniej
przechodzą malarię [13]. Mechanizm infekcyjny Plasmodium opiera się o
wnikanieparazyta do krwinek czerwonych, na skutek czego może dojść do
tworzenia rozet. Sklejone erytrocyty blokują przepływ krwi i uszkadzają tkanki, co
wiąże się z cięższym przebiegiem choroby. Plasmodium wykorzystuje do
tworzenia rozet antygeny obecne na powierzchni erytrocytów grup A i B.
Erytrocyty osób grupy O, u których ww. antygeny nie występują, tworzą małe
rozety, które łatwiej się rozpadają [14]. Na podstawie powyższych obserwacji
można wnioskować, że grupa O utrzymuje się w populacji, ponieważ chroni przed
malarią.
Mikrobiologia i genetyka odgrywają ogromną rolę w serologii i
transfuzjologii. Odpowiednio przygotowane preparaty krwiopochodne
minimalizują niebezpieczeństwo transferu transfuzjologicznego wielu
wirusów, a zaawansowane techniki biologii molekularnej pozwalają na
rozwiązanie wielu problemów diagnostycznych. Nasuwa się więc pytanie:
Czy w przyszłości metody biologii molekularnej zastąpią serologiczne metody
oznaczania grup krwi?
Odpowiedź brzmi: TAK, w niektórych krajach, dla niektórych testów, ale
nie dla rutynowego oznaczenia ABO, ponieważ antygeny układu ABO są
łatwe do oznaczenia metodami serologicznymi, lecz złożone genetycznie.
mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny
Piśmiennictwo:
1. Health Protection Report. Fourth case of transfusion-associated variant-CJD
infection. News, 2007, 1, 3.
2. Sher GD. Leukoreduction of the blood supply. Canadian Blood Services, 1999.
3. CDC. West Nile Virus Infections in Organ Transplant Recipients. MMWR, 2005;
54: 1-3.
4. Brown R. Transfusion associated West Nile virus infection: implications for
Europe. Eurosurveillance, 2003, 7, 34: 2278.
5. de Oliveira AM., Beecham BD., Montgomery SP. et al. West Nile Virus Blood
Transfusion-Related Infection Despite Nucleic Acid Testing. Public Health
Resources, 2004.
6. Olsson ML., Hill CA., de la Vega H. et al. Universal red blood cells–enzymatic
conversion of blood group A and B antigens. Transfus Clin Biol, 2004; 11, 1:
33-39.
7. Liu QP., Sulzenbacher G., Yuan H. et al. Bacterial glycosidases for the
production of universal red blood cells. Nat Biotechnol, 2007; 25, 4: 454-464.
8. Kobayashi T., Liu D., Ogawa H. et al. Removal of blood group A/B antigen in
organs by ex vivo and in vivo administration of endo-beta-galactosidase (ABase)
for ABO-incompatible transplantation. Transpl Immunol, 2009; 20, 3: 132-138.
9. Harris JB., Khan AI., LaRocque RC. Blood Group, Immunity, and Risk of
Infection withVibrio cholerae in an Area of Endemicity. Infect Immun, 2005; 73,
11: 7422-7427.
10. Dabelsteen E., Gao S. ABO blood-group antigens in oral cancer. J Dent Res,
2005; 84, 1: 21-28.
11. Wolpin BM. ,Chan AT., Hartge P. et al. ABO Blood Group and the Risk of
Pancreatic Cancer. JNCI J Natl Cancer Inst, 2009; 101, 6: 424-431.
12. Tursen U., Tiftik EN., Unal S. et al. Relationship between ABO blood groups
and skin cancers. Dermatology Online Journal, 11, 3.
13. Cserti CM., Dzik WH. The ABO blood group system andPlasmodium
falciparum malaria. Blood, 2007; 110,7: 2250-2258.
14. Rowe JA., Handel IG., Thera MA. et al. Blood group O protects against
severe Plasmodium falciparum malaria through the mechanism of reduced
rosetting. PNAS, 2007; 104, 44: 17471–17476.
Receptory Toll-podobne oraz
helikazy RNA, czyli „molekularne
sensory” inwazji wirusowej
Na co dzień nikt z nas nie zdaje sobie sprawy, od jak wielu mechanizmów
zachodzących w naszych komórkach zależy zdrowie całego organizmu.
Oczywiście pokłony bić musimy naszemu niezawodnemu układowi
immunologicznemu, dzięki któremu jesteśmy w stanie zwalczyć większość
infekcji wirusowych i przeżyć bez większego szwanku zwykłe
przeziębienie; lecz aby nasz system odpornościowy zadziałał jak należy,
komórki mające kontakt z wirusem muszą w jakiś sposób „poinformować”
o obecności intruza. Tym właśnie zajmują się receptory Toll-podobne typu
7/8 oraz 3 (Toll-like receptors, TLRs) oraz specyficzne helikazy RNA:
RIG-1 (retinoic acid inducible gene 1) oraz MDA-5 (melanoma
differentiation-associated gene 5), które choć działają niezależnie i nieco
odmiennie to w efekcie dają ten sam wynik — organizm przygotowuje się
na starcie z niepożądanym patogenem.
Te dwa sposoby rozpoznawania wirusowego materiału genetycznego już od kilku
lat cieszą się dużym zainteresowaniem wśród naukowców — wykazano, że są
wspólne dla wszystkich komórek eukariotycznych i rozróżniane są głównie
poprzez subkomórkową lokalizację białek kluczowych dla tych mechanizmów.
Receptory Toll-podobne typu 7/8 i 3 wchodzą w skład białek błony komórkowej i
endosomalnej, natomiast helikazy RIG-1 oraz MDA-5 występują w przestrzeni
cytoplazmatycznej. Białka te są odpowiedzialne za wykrywanie oraz wiązanie
dwuniciowego RNA (double stranded RNA, dsRNA), co inicjuje kaskadę
sygnałową prowadzącą do sekrecji szeregu cytokin prozapalnych, w tym
interferonów (IFNs). Inicjowanie podobnej odpowiedzi immunologicznej nie
oznacza jednak, że molekuły te działają identycznie — poszczególne receptory
posiadają „ulubiony” wzór rozpoznawania patogenu wirusowego: RIG-1
preferencyjnie rozpoznaje krótkie (poniżej 1kb) dsRNA z grupą fosforanową na 5’
końcu, za to MDA-5 najczęściej wykrywa długie cząsteczki (1-5 kb). Synteza
dsRNA w zakażonych komórkach jest konieczna do replikacji wirusów o materiale
genetycznym w postaci pojedynczej nici kwasu rybonukleinowego (single
stranded RNA, ssRNA), dzięki czemu takie wirusowe dsRNA może być rozpoznane
przez komórkę jako obce. W istocie, stanowi ono jedno z ważniejszych wirusowych
„wzorów” należących do grupy czynników określanych jako PAMPs (ang. patogen
associated molecular patterns).
Badania nad konkretnymi wirusami wykazały, że białko RIG-1 jest odpowiedzialne
za detekcję m.in. wirusa grypy, wirusa RS (ang. respiratory syncytial virus, RSV)
oraz niektórych paramyksowirusów, a więc patogenów posiadających
jednoniciowe RNA o ujemnej polarności — ss(-) RNA, natomiast MDA-5
uczestniczy w rozpoznaniu szeregu pikornawirusów — mikrobów, których
materiał genetyczny stanowi jednoniciowe RNA o dodatniej polarności — ss(+)
RNA. Pomimo tych różnic, obydwie helikazy przekazują sygnał w ten sam sposób –
poprzez swoje domeny CARD (ang. caspase recruitment domains) do
zlokalizowanego na zewnętrznej błonie mitochondrialnej białka MAVS (ang.
mitochondria antiviral signaling protein), który następnie umożliwia aktywację
kinaz TBK-1 (ang. TANK binding kinase 1) oraz kinazy IκB, prowadząc do
zaktywowania czynników transkrypcyjnych IRF3 (ang. interferon regulatory factor
3) oraz NFκB (ang. nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B
cells). Cała ta kaskada sygnału ma na celu pobudzenie komórek do wydzielania
interferonów typu I (głównie α i β).
Receptory Toll-podobne, z kolei, rozpoznają zarówno dwuniciowe (TLR3), jak i
jednoniciowe RNA (TLR7/8). Ich działanie uzależnione jest od kilku białek
pośredniczących, wśród których najważniejsze są dwa adaptory: MyD88 (ang.
myeloid differentiation primary response protein) oraz TRAF6 (ang. TNF receptorassociated factor 6), dzięki którym możliwe jest przekazanie sygnału do jądra
komórkowego, w których zachodzi aktywacja czynnika transkrypcyjnego NFκB —
kluczowego pośrednika w uruchomieniu transkrypcji genów szeregu prozapalnych
białek.
Wszystkie te reakcje mają na celu rozwój procesu zapalenia, któremu jak wszyscy
wiedzą zwykle towarzyszy ból, lokalny obrzęk i zaczerwienienie. Objawy te są
wynikiem zmian zachodzących w naczyniach krwionośnych — rozszerzenie ścian
powoduje uczucie gorąca, komórki śródbłonka wykazując ekspresję cząsteczek
adhezyjnych promują wiązanie się leukocytów, które następnie migrują do
przylegających tkanek, a zwiększenie przepuszczalności powoduje przeciek
płynów i białek z krwi oraz ich akumulację, co powoduje uczucie bólu. To jednak
dopiero początek zmian, jakich doświadczają nasze tkanki podczas infekcji
wirusowej, a do całkowitego zwalczenia choroby potrzebne jest współgranie wielu
typów komórek układu immunologicznego.
Receptory TLR3 i TLR7/8, jak również RNA-specyficzne helikazy RIG-1 i MDA-5
określane są mianem receptorów rozpoznających wzorzec — w skrócie PRRs
(pattern recognition receptors) i stanowią pierwszą linię obrony przez
rozprzestrzenianiem się infekcji wirusowej. Są one obecnie przedmiotem
intensywnych badań mikrobiologów oraz immunologów, a przyszłe lata mogą
przynieść nowe dane odnośnie ich interakcji z ludzkimi patogenami wirusowymi.
AM
Testy aglutynacji latekswej
Niezastąpione w nowoczesnej diagnostyce laboratoryjnej
Piśmiennictwo:
Slater L., Bartlett NW., Haas JJ. et al. Co-ordinated Role of TLR3, RIG-I and
MDA5 in the Innate Response to Rhinovirus in Bronchial Epithelium. PLoS
Pathog, 2010; 6, 11: e1001178.
Flür K., Allam R., Zecher D. et al. Viral RNA induces type I interferon-dependent
cytokine release and cell death in mesangial cells via melanoma-differentiationassociated gene-5: Implications for viral infection-associated glomerulonephritis.
Am J Pathol, 2009; 175, 5: 2014-2022.
Takeuchi O., Akira S. Innate immunity to virus infection. Immunol Rev, 2009; 227,
1: 75-86.
Schlee M., Barchet W., Hornung V. et al. Beyond double-stranded RNA-type I IFN
induction by 3pRNA and other viral nucleic acids. Curr Top Microbiol Immunol.
2007; 316: 207-230.
Kawai T., Akira S. Antiviral signaling through pattern recognition receptors. J
Biochem, 2007; 141, 2: 137-145.
Ishii KJ., Coban C., Kato H. et al. A Toll-like receptor-independent antiviral
response induced by double-stranded B-form DNA. Nat Immunol, 2006; 7, 1:
40-48.