GLIKOZOAMINOGLIKANY Glikozoaminoglikany (GAG) stanowią

GLIKOZOAMINOGLIKANY
Glikozoaminoglikany (GAG) stanowią heterogenną grupę polisacharydów wchodzących
w skład substancji podstawowej (matrix) tkanki łącznej. Razem z kolagenem i elastyną
warunkują
mechaniczne
właściwości
tkanki
łącznej,
są
odkształcalne
i
względnie
nieprzepuszczlne dla wody. Ponadto GAG pełnią ważne role biologiczne jako:
1/ stabilizatory, kofaktory i/lub koreceptory dla czynników wzrostu, cytokin i chemokin;
2/ cząsteczki regulujące aktywność enzymów;
3/ cząsteczki sygnałowe w odpowiedzi komórkowej na uszkodzenia, infekcje i inicjacje
kancerogenezy;
4/ cząsteczki regulujące adhezję drobnoustrojów patogennych i funkcjonowanie układu
odpornościowego.
Łańcuchy polisacharydowe GAG zbudowane są z powtarzających się podjednostek
dwucukrowych, złożonych z heksozoaminy i kwasu uronowego. Wyjątek stanowi siarczan
keratanu,
którego
podjednostka
zbudowana
jest
z
glukozoaminy
i
galaktozy.
Charakterystycznym składnikiem chondroitynosiarczanów jest galaktozoamina. Pozostałe
związki zawierają glukozoaminę. W skład GAG wchodzi głównie kwas beta-D-glukuronowy
(Ryc. 1), jednak siarczan dermatanu (chondroitynosiarczan B) zawiera kwas alfa-L-iduronowy
(izomer kwasu glukuronowego) a siarczan heparanu i heparyna zarówno kwas glukuronowy, jak
i iduronowy.
Ryc. 1. Kwas glukuronowy
Z wyjątkiem kwasu hialuronowego i chondroityny, wszystkie GAG zawierają grupy
siarczanowe, połączone przez atom tlenu a heparyna i siarczan heparanu zawierają też grupy
siarczanowe połączone przez atom azotu. Ugrupowania te, razem z grupami N-acetylowymi,
warunkują ujemny ładunek cząsteczek GAG (Tabela 1).
2
Tabela 1. Budowa różnych klas glikozoaminoglikanów
Rodzaj GAG
Kwas hialuronowy
Disacharyd
U
GlcA( 1,3) H NAc ( 1,4)
Siarczan
U 2X (/ 1,3)
chondroityny/siarczan H NAc, 4X, 6X ( 1,4)
dermatanu
Siarczan keratanu
Gal 6X ( 1,4)
H NAc, 6X ( 1,3)
Heparyna/siarczan
U 2X (/ 1,4)
heparanu
H NY, 3X, 6X ( 1,4)
H
Modyfikacje
GlcA
glukozoamina
brak
IdoA/ GlcA
galaktozoamina X - siarczan
Gal
glukozoamina
IdoA/ GlcA
glukozoamina
X - siarczan
X - siarczan
Yacetyl/siarczan
GlcA - kwas -D-glukuronowy; IdoA - kwas -L-iduronowy; H - /-D-glukozoamina
(GlcNAc) lub -D-galaktozoamina (GalNAc); Gal - -D-galaktoza;
W warunkach in vivo GAG występują w postaci połączeń z białkami jako proteoglikany.
Łańcuch polisacharydowy połączony jest z polipeptydem wiązaniem kowalencyjnym a region
wiązania posiada specyficzna sekwencję: galaktoza-galaktoza-ksyloza-treonina. Proteoglikany
chrząstek występują jako kompleksy z kwasem hialuronowym (Ryc. 2). Organizacja
molekularna łańcucha GAG wokół rdzenia białkowego spełnia funkcję porównywalną z
działaniem gąbki. Proteoglikany wchłaniają niezwykle duże ilości wody ze środowiska, w
którym są zanurzone. Tzw. współczynnik pęcznienia wynosi 30-50x wartości suchej masy
proteoglikanu. Właściwości te wynikają z budowy przestrzennej proteoglikanu. Ujemnie
naładowane łańcuchy GAG obracają się wokół rdzenia białkowego jak na zawiasach i wystają na
zewnątrz cząsteczki. Pozwala to na penetrację dużych ilości rozpuszczalnika, czyli wody. Jednak
w warunkach in vivo proteoglikany w substancji podstawowej tkanki łącznej nie chłoną
maksymalnej ilości wody, powstrzymywane przez siatkę kolagenową, względnie nierozciągliwą.
Takie
właściwości
hydrodynamiczne
pozwalają
na
połączenie
cech
sztywności
i
odkształcalności. Z upływem wieku, siarczan chondroityny w chrząstce ustępuje miejsca
siarczanowi keratanu, co usztywnia tkankę.
3
Oligosacharydy
połączone przez atom
azotu
Rdzeń białkowy
Siarczan keratanu
Sairczan chondroityny
Kwas hialuronowy
Ryc. 2. Struktura cząsteczki proteoglikanu
Kwas hialuronowy (HA) jako składnik proteoglikanów odgrywa ważną rolę w
utrzymywaniu integralności tkanek, przede wszystkim skóry, chrząstek i innych rodzajów tkanek
łącznych, ułatwia również migrację i proliferację komórek w procesach zapalnych, gojeniu się
ran, rozwoju zarodkowym i angiogenezie. Kwas hialuronowy zapewnia właściwe nawodnienie
tkanek i amortyzuje urazy. Ten polisacharyd odpowiada również za prawidłowe wykształcenie i
funkcjonowanie strun głosowych, zapewniając im odpowiednią elastyczność. W chrząstkach
proteoglikany zawierające HA agregują z białkami tworząc kompleksy – agrekany, nadające
chrząstkom unikalne cechy żelu i właściwości mechaniczne. Skóra, gałka oczna i chrząstka
szklista są tkankami o największej zawartości kwasu hialuronowego w organizmie ludzkim.
Kwas hialuronowy zbudowany jest z naprzemiennie ułożonych czasteczek kwasu
glukuronowego i N-acetyloglukozoaminy, powtórzenia tych podjednostek wystepują ok. 2000x.
Jego synteza następuje na powierzchni błony komórkowej, dzięki reakcjom katalizowanym
przez
syntazę
hialuronianową.
W
porównaniu
z
innymi
cząsteczkami
środowiska
zewnątrzkomórkowego, HA charakteryzuje się szybkim metabolizmem. Jego degradacja
zachodzi w odległych gruczołach limfatycznych a fragmenty zdegradowanego HA krążą z limfą.
W katabolizmie HA biorą udział dwa typy hialuronidaz, enzymy lizosomalne: betaglukuronidaza i beta-N-acetyloglukozoaminidaza oraz receptor dla produktów rozpadu
hialuronianu, znajdujący się na powierzchni komórek wątroby, dzięki któremu te fragmenty
wchodzą do komórek na drodze endocytozy. Katabolizm HA przebiega wieloetapowo,
produktem każdego etapu są krótsze łańcuchy glikozoaminoglikanu, o zróżnicowanych
4
funkcjach biologicznych. Oligomery o masie rzędu 1x104 kDa działają jako wypełniacze
przestrzeni międzykomórkowych, utrzymują ich nawodnienie, zapobiegają angiogenezie
(tworzeniu nowych naczyń krwionośnych) oraz działają immunosupresyjnie. Mniejsze polimery
o masie ok 20 kDa działają stymulująco na układ odpornościowy i angiogenezę oraz
prozapalnie. Obecność kwasu hialuronowego o krótkich łańcuchach w płynie stawowym
pogarsza jego lepkość i odpowiada za dolegliwości bólowe w zapaleniu stawów. Dalsza
degradacja kwasu hialuronowego produkuje jeszcze krótsze łańcuchy, indukujące syntezę białek
szoku cieplnego i hamujących apoptozę (programowaną śmierć komórek). Pojedyncze
cząsteczki sacharydowe, kwas glukuronowy i glukozoamina, uwalniane są z lizosomów
komórek do cytoplazmy, gdzie staja się dostępne do dalszych przemian metabolicznych. W
organizmie człowieka o masie ok. 70 kg znajduje się ok. 15 g kwasu hialuronowego, z czego
dziennie ok. 5 g podlega katabolizmowi i resyntezie. Poziom wolnego kwasu hialuronowego w
osoczu krwi jest niski, gdyż w warunkach prawidłowych HA zatrzymywany jest w tkankach
przez włókna kolagenowe. Zwiększenie stężenia HA w krwi przyspiesza proces krzepnięcia.
Heparyna powstaje i jest magazynowana w komórkach tucznych i jest z nich uwalniana
podobnie jak histamina. Pokrewny GAG, siarczan heparanu, wbudowany w proteoglikan,
znajduje się na powierzchni komórek wielu tkanek i w przestrzeni zewnątrzkomórkowej.
Zlokalizowane na powierzchni komórek proteoglikany zawierające siarczan heparanu, pełnią
istotne funkcje w rozwoju zarodkowym. Heparynie i siarczanowi heparanu przypisuje się
działanie przeciwzapalne, niezależnie od działania przeciwkrzepliwego, charakterystycznego dla
wszystkich siarczanowych GAG i ich proteoglikanów. Handlowa niefrakcjonowana heparyna
jest mieszaniną min. 21 łańcuchów o zawartości od 6 do 30 podjednostek disacharydowych o
różnym stopniu właściwości antykoagulacyjnych. Działania to polega na stymulacji
antytrombiny (dawniej antytrombiny III), enzymu rozkładającego trombinę. Heparyna łącząc się
z antytrombiną powoduje zmianę jej konformacji przestrzennej, stwarzając korzystniejsze
miejsce wiązania enzymu z substratem. Obecność kwasu iduronowego i wielu grup
siarczanowych szczególnie sprzyjają aktywności antykoagulacyjnej. Obecnie leczniczo stosuje
się heparyny o niskiej masie cząsteczkowej i zdefiniowanej liczbie podjednostek, gdyż ta forma
daje przewidywalne skutki terapeutyczne, zależne od dawki i jest przyczyną mniejszej liczby
powikłań krwotocznych. Jako składniki ścian naczyń krwionośnych, heparyna i inne
siarczanowe GAG nadają im właściwości antykoagulacyjne. Heparyna jest również aktywatorem
enzymu lipazy lipoproteinowej, rozkładającej osoczowe triglicerydy. Trójwymiarowa struktura
proteoglikanów w matrix tkanki łącznej ścian naczyń tętniczych stanowi filtr, na którym
zatrzymują się makrocząsteczki, np. lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL) i o bardzo niskiej
gęstości (VLDL), tworząc lipidowe nacieczenia w ścianie naczynia. Te dodatnio naładowane
5
kompleksy białkowo-lipidowe tworzą wiązania jonowe z ujemnie naładowanymi cząsteczkami
GAG a obecność w środowisku kationów dwuwartościowych, zwłaszcza Ca(II), zmniejsza
rozpuszczalność tych złogów, stając się zaczątkiem blaszki miażdżycowej. Niskocząsteczkowe i
niefrakcjonowane heparyny zakłócają procesy wzrostu nowotworów i przerzutowania,
prawdopodobnie na drodze hamowania interakcji pomiędzy komórkami i opóźniania
angiogenezy.
Siarczan keratanu (KS I, łączy się z białkiem za pośrednictwem atomu azotu z
aminokwasu asparaginy) jest głównym składnikiem proteoglikanów występujących w rogówce,
w postaci kompleksów z białkami obfitującymi w leucynę – lumikanu i keratokanu. Kompleksy
te są niezbędne w zarodkowym rozwoju tkanek oka i ich funkcjonowaniu u dorosłego. Ich
działanie polega na regulacji formowania się włókien kolagenu, ponadto lumikan oddziałuje na
migrację komórek i gojenie się ran. W chrząstce występuje KS II, który łączy się z białkiem za
pośrednictwem atomu tlenu z aminokwasów seryny lub treoniny.
Zawartość i skład GAG i proteoglikanów ulega zmianom w procesach patologicznych
przebiegających w obrębie tkanki łącznej. W genetycznie uwarunkowanych schorzeniach –
mukopolisacharydozach, obserwuje się wzrost poziomu GAG w tkankach i ich wzmożone
wydalanie z moczem. Spowodowane to jest brakiem niektórych enzymów lizosomalnych
degradujących GAG, dochodzi zatem do ich akumulacji w tkankach (głównie siarczanów
heparanu, keratanu i dermatanu). Glikozoaminoglikany wydalane z moczem można wyizolować,
wytrącając je czwartorzędowymi solami amoniowym (chlorek cetylopirydyniowy, CPC) i po
oczyszczeniu poddać elektroforezie, co pozwala na stwierdzenie obecności poszczególnych
GAG. Oznaczenie np. ilości kwasów uronowych lub aminocukrów w wyizolowanych GAG
ocenia łączne stężenie tych związków w moczu.
I.
IZOLACJA GAG Z DOBOWEJ ZBIÓRKI MOCZU
1. Mocz z dobowej zbiórki wymieszać, doprowadzić pH do ok. 6, odmierzyć 20 ml do
probówki o poj. 50 ml, dodać 10 ml wody dest. i 1 ml wodnego roztworu 5% chlorku
cetylopirydyniowego, zamieszać bagietką i odstawić do temp. + 4oC, na co najmniej 12
godz.
2. Odwirować 20 min. przy 3000 rpm w temp. + 4oC, odrzucić nadsącz.
3. Do osadu dodać 10 ml 95% etanolu nasyconego chlorkiem sodowym, zamieszać bagietką
i odstawić do temp. + 4oC, na co najmniej 12 godz.
6
4. Odwirować 20 min. przy 3000 rpm w temp. + 4oC, odrzucić nadsącz, dodać ponownie 10
ml 95% etanolu nasyconego chlorkiem sodowym, zamieszać bagietką i odstawić do
temp. + 4oC, na co najmniej 12 godz.
5. Odwirować 20 min. przy 3000 rpm w temp. + 4oC, odrzucić nadsącz, osad wysuszyć w
strumieniu ciepłego powietrza lub w eksykatorze próżniowym. Wysuszony osad
rozpuścić:
a/ w 5 ml 0,075 mol/l NaCl (do oznaczenia kwasów uronowych);
b/ w 0,5 ml 0,075 mol/l NaCl (do elektroforezy)
II.
ELEKTROFOREZA GAG NA PASKACH OCTANU CELULOZY
1. Zanurzyć przycięte paski octanu celulozy w buforze (0,1 mol/l octan cynku) na 20 min.
2. Osuszyć pasek miedzy dwoma arkuszami bibuły i umieścić w komorze do elektroforezy.
Podłączyć prąd (2 mA/cm szerokości paska). Preelektroforezę prowadzić przez 10 min.
3. Nałożyć po 5 l odpowiednich wzorców i roztworu GAG wyizolowanych z moczu.
Elektroforezę prowadzić przez 2 godziny.
4. Po zakończeniu rozdziału elektroforetycznego paski barwić przez 15 min. w 0,25%
roztworze Błękitu Alcjanu, rozpuszczonego w mieszaninie metanolu, kwasu octowego i
wody (50:5:45).
5. Po zakończeniu barwienia paski przepłukać delikatnie pod bieżąca wodą i odbarwić tło
zanurzając w 5% kwasie octowym (3x5 min.).
III.
OZNACZANIE GAG ELUOWANYCH Z OCTANU CELULOZY
1. Wyciąć z paska plamy odpowiadające rozdzielanym GAG (próba badana) i analogiczne
co do wielkości fragmenty z niezabarwionego obszaru paska (próba odniesienia).
2. Wycięte próbki umieścić w probówkach chemicznych i dodać do każdej po 1, 5 ml 5%
roztworu CPC.
3. Probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 15 min., w celu wyekstrahowania
barwnika związanego z GAG.
4. Probówki ochłodzić, odczytać absorbancję prób badanych wobec odpowiadających im
prób odniesienia, przy dł. fali 615 nm. Wyniki odczytać z krzywej wzorcowej.
7
IV.
OZNACZANIE KWASÓW URONOWYCH W GAG WYIZOLOWANYCH Z
MOCZU.
1. Do 3 ml zimnego roztworu 0,025 mol/l czteroboranu sodowego w stężonym kwasie
siarkowym (probówki trzymać w lodzie) dodać 0,5 ml roztworu GAG. Do próby
odniesienia dodać 0,5 ml 0,075 M chlorku sodowego. Ostrożnie zamieszać.
2. Ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 10 min.
3. Probówki ochłodzić do temp. pokojowej, dodać do każdej po 0,1 ml 0,125% karbazolu w
bezwodnym metanolu.
4. Ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 15 min.
5. Probówki oziębić, odczytać absorbancję przy dł. fali 530 nm, wobec próby odniesienia.
Wyniki odczytać z krzywej wzorcowej.
LITERATURA
Obowiązujące podręczniki do nauki biochemii i dołączony artykuł (Postępy Biochemii,
1995, tom 41, str 139-147).
Chemia fizyczna: fizykochemiczne podstawy procesu elektroforezy.