Synteza koniugatów auksyn

SYNTEZA I IDENTYFIKACJA METODĄ CHROMATOGRAFII
CIENKOWARSTWOWEJ 1-O-IA-GLUKOZY I IA-MYO-INOZYTOLU
WSTĘP
Synteza estrowych koniugatów auksyn
Wszystkie znane naturalne auksyny występują w roślinach w formie fizjologicznie aktywnego
wolnego kwasu oraz w połączeniach z innymi związkami jako tzw. koniugaty. Reakcje syntezy
koniugatów polegają na utworzeniu wiązania kowalencyjnego między grupą karboksylową
auksyny, a grupą hydroksylową cukrów i inozytolu (koniugaty estrowe) lub wolnych
aminokwasów, peptydów i białek (koniugaty amidowe). Koniugaty pełnią funkcję zapasowego
źródła fitohormonu, z którego stopniowo w miarę potrzeby uwalniana jest hydrolitycznie aktywna
auksyna.
Synteza koniugatów estrowych została poznana juŜ stosunkowo dobrze w dojrzewających
nasionach kukurydzy i grochu. Szczególnie bogatym źródłem połączeń estrowych jest bielmo
niedojrzałych nasion kukurydzy. Ponad 50% całkowitej ilości koniugatów występuje tu w postaci
nierozpuszczalnych w wodzie celulozowych β-1,4-glukanów, około 15% stanowią połączenia
estrowe z myo-inozytolem, a ponad 30% całkowitej ilości koniugatów to związki, które oprócz
inozytolu zawierają dodatkowo galaktozę lub arabinozę. W śladowych ilościach występują tu
takŜe estrowe połączenia kwasu indolilo-3-octowego z glukozą.
Pierwszym etapem biosyntezy połączeń estrowych jest odwracalna reakcja prowadząca do
powstania 1-O-(indolilo-3-acetylo)-β-D-glukozy (uŜywany skrót: 1-O-IA-glukoza). Reakcja ta jest
katalizowana przez glukozylotransferazę UDP-glukoza: kwas indolilo-3-octowy (IAA), nazywaną
równieŜ syntazą 1-O-IA-glukozy, zgodnie z równaniem:
UDP-glukoza
IAA
1-O-IA-glukoza
1
UDP
Powstająca w reakcji 1-O-IA-glukoza zawiera wiązanie alkiloacylowe, które jest wiązaniem
bardzo nietrwałym. W pH alkalicznym 1-O-IA-glukoza łatwo ulega nieenzymatycznej
izomeryzacji dając połączenia estrowe, w których reszta IAA jest związana z węglem 2, 4 i 6
glukozy.
1-O-IA-glukoza jest związkiem pośrednim w syntezie IA-myo-inozytolu, który powstaje w
reakcji przeniesienia reszty IAA z 1-O-IA-glukozy na myo-inozytol. Reakcja syntezy IA-myoinozytolu jest katalizowana przez acylotransferazę zgodnie z równaniem:
1-O-IA-glukoza
myo-inozytol
IA-myo-inozytol
glukoza
Chromatografia cienkowarstwowa
Adsorbenty uŜywane do chromatografii cienkowarstwowej charakteryzują się bardzo małymi
cząsteczkami, a cienką warstwę adsorbentu na powierzchni płytki (0,2 mm) powinna cechować
trwałość. Warstwa nośnika nie moŜe nadmiernie pęcznieć w czasie rozdziału, czy pękać w trakcie
suszenia, a takŜe nie moŜe pochłaniać promieniowania UV, które jest często uŜywane do
lokalizacji rozdzielanych związków. Powszechnie uŜywanym adsorbentem nieorganicznym jest
Ŝel krzemionkowy (Silica Gel) o przeciętnej średnicy ziaren od 5 do 25 µm. Niektóre adsorbenty
zawierają domieszkę substancji fluoryzujących, które umoŜliwiają lokalizację związków (np.
związków z pierścieniami aromatycznymi) bez uŜywania wywoływaczy, a jedynie przez
wystawienie chromatogramu na działanie promieniowania UV o zakresie 254 nm.
W chromatografii cienkowarstwowej na ogół operuje się bardzo niewielkimi ilościami
rozdzielanych prób, rzędu kilku µl. Przed rozpoczęciem nanoszenia prób, na płytce zaznacza się
linie startu oraz punkty, na które zostaną naniesione próby. Średnica prób (plamek) po naniesieniu
powinna być moŜliwie mała (2-3 mm), dlatego próbki nanosi się zwykle małymi porcjami susząc
plamki strumieniem ciepłego powietrza. Układy rozwijające dobiera się eksperymentalnie
uwzględniając skład i rodzaj rozdzielanych substancji. Powtarzalność rozdziałów moŜliwa jest
tylko przy uŜyciu bardzo czystych rozpuszczalników, a takŜe pod warunkiem, Ŝe skład mieszaniny
rozwijającej nie ulegnie zmianie np. w wyniku odparowania jednego ze składników. Po
2
skończonym rozdziale i zaznaczeniu ołówkiem czoła układu rozwijającego, płytki suszy się
delikatnie w strumieniu ciepłego powietrza. Do lokalizacji bezbarwnych substancji uŜywa się
odczynników, które tworzą z rozdzielanymi związkami barwne połączenia. Oprócz tego szereg
związków absorbuje UV, co uwidacznia się w postaci ciemnych plam na świecącym tle (o ile
adsorbent zawiera dodatek substancji fluoryzującej np. fluoresceiny). Po wybarwieniu
rozdzielanych związków mierzy się odległość środka plamki od linii startu oraz odległość czoła
rozpuszczalnika od linii startu, a następnie oblicza się wartość Rf. Wartości Rf powinny być
powtarzalne przy zachowaniu stałych warunków rozdziału. Wskazane jest jednak rozwinięcie (na
tej samej płytce) czystych związków (wzorców), które ułatwią identyfikację rozdzielanych
substancji.
MATERIAŁY
Materiały:
•
zamroŜone bielmo z niedojrzałych nasion kukurydzy
•
płytki do chromatografii cienkowarstwowej Silica gel 60 F254 firmy MERCK
•
kolumna Sephadex G-15 (15 x 1 cm)
Odczynniki:
•
25 mM bufor Tris-HCl, pH 7.4
•
50 mM bufor HEPES-NaOH, pH 7.4
•
roztwór zawierający 24 mM UDP-glukozę, 8 mM MgCl2 w 50 mM buforze
HEPES-
NaOH, pH 7.4
•
64 mM IAA w 50% izopropanolu
•
30 mM myo-inozytol w 50 mM buforze HEPES-NaOH, pH 7.4
•
układ rozwijający: octan etylu, butanon (etylmetylketon), etanol 99.6 %, woda w
stosunku 5:3:1:1
•
odczynnik Van Urk-Salkowskiego:
A. 2 g p-dwumetyloaminobenzaldehydu rozpuścić w 100 ml HCl, a następnie dodać 100 ml
99 % etanolu
B. 2.03 g FeCl3 x 6 H2O rozpuścić w 500 ml H2O, a następnie dodać 300 ml stęŜonego kwasu
siarkowego
Odczynnik Van Urk-Salkowskiego zawiera 1 część roztworu A i 3 części roztworu B.
3
WYKONANIE
Przygotowanie ekstraktu z bielma nasion kukurydzy:
Aktywność syntazy 1-O-IA-glukozy i syntazy IA-inozytolu moŜna analizować jakościowo i
ilościowo
w
bielmie
wyciśniętym
z
niedojrzałych
nasion
kukurydzy
(koński
ząb),
przechowywanym w stanie zamroŜonym w temp. –200 C. Metalową szpatułą zdrapać 2 g
zamroŜonego materiału, po czym rozetrzeć w małym moździerzu. Dobrze roztarty materiał przelać
do dwóch probówek wirówkowej Eppendorfa i odwirować przy 15 000 obr/min 10 min. W celu
usunięcia endogennych koniugatów zebrany z obu probówek nadsącz uzyskany po wirowaniu
naleŜy poddać sączeniu Ŝelowemu (odsalaniu) na kolumnie Sephadex G-15. W tym celu całą
objętość nadsączu nanieść na powierzchnie kolumny, po uprzednim usunięciu nadmiaru buforu
znad powierzchni Ŝelu Sephadex G-15, przy zamkniętym wypływie kolumny. Po wniknięciu całej
próbki do Ŝelu (UWAGA! nie dopuścić do zapowietrzenia kolumny!) pipetą Pasteura nanieść
ostroŜnie na powierzchnię Ŝelu ok. 3-5 ml roztworu do elucji – 25 mM Tris-HCl pH 7,4, a
następnie podłączyć butlę z roztworem elucyjnym. Po otwarciu wypływu z kolumny, śledzić
przesuwanie się wzdłuŜ kolumny Ŝółto zabarwionej frakcji białek. Kiedy białka będą na wysokości
ok. 2-3 cm od wylotu z kolumny rozpocząć zbieranie około 1 ml frakcji. Frakcję zawierającą
największe stęŜenie białek (najbardziej intensywne Ŝółte zabarwienie), zachować do oznaczeń,
natomiast pozostałe zebrane próbki wylać.
Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej
Mieszanina reakcyjna I – do oznaczania aktywności syntazy 1-O-IA-glukozy
Pobrać do małej probówki Eppendorfa 31.2 µl roztworu zawierającego 24 mM UDP-glukozę, 8
mM MgCl2 w 50 mM buforze HEPES-NaOH, pH 7.4, 25.1 µl 50 mM buforu HEPES-NaOH, pH
7.4 i 6.2 µl 64 mM IAA w 50 % izopropanolu (końcowa objętość
62.5 µl; wystarczy dla dwóch par)
Mieszanina reakcyjna II – do oznaczania aktywności syntazy 1-O-IA-glukozy i syntazy IAinozytolu
Pobrać do małej probówki Eppendorfa 31.2 µl roztworu zawierającego 24 mM UDP-glukozę, 8
mM MgCl2 w 50 mM buforze HEPES-NaOH, pH 7.4, 25.1 µl 30 mM myo-inozytolu w 50 mM
buforze HEPES-NaOH, pH 7.4, i 6.2 µl 64 mM IAA w 50% izopropanolu (końcowa objętość 62.5
µl; wystarczy dla dwóch par)
4
Wykonanie oznaczeń:
Do małej probówki Eppendorfa napipetować 20 µl środowiska I, a do drugiej probówki 20 µl
środowiska II. Obie probówki umieścić w łaźni wodnej (300 C), a po 1-2 min do obu probówek
dodać po 12 µl ekstraktu białkowego uzyskanego po przesączeniu na kolumnie Sephadex.
Natychmiast po zmieszaniu roztworów pobrać 4 µl próbki, które naleŜy nanieść na wcześniej
przygotowane płytki (zerówki; próbki 1). Naniesione plamki wysuszyć w strumieniu ciepłego
powietrza w celu zdenaturowania naniesionych białek. Reakcję prowadzić dalej w łaźni pobierając
4 µl próbki po 10, 20 i 30 min. inkubacji (próbki 2, 3 i 4). Po zakończeniu reakcji nanieść jeszcze
2 próbki zawierające 1 µl 1-O-IA-glukozy (wzorzec; próbka 5) i 1 µl IA-inozytolu (wzorzec;
próbka 6).. Po wysuszeniu wszystkich próbek, płytki włoŜyć do eksykatora i rozwijać do czasu, aŜ
czoło roztworu rozwijającego znajdzie się w odległości 3-4 mm od górnego brzegu płytki. Po
wyjęciu płytek z eksykatora, zaznaczyć czoło roztworu rozwijającego, a następnie płytki dokładnie
wysuszyć i zanurzyć na moment do odczynnika Salkowskiego (Uwaga: proszę to robić bardzo
ostroŜnie ze względu na wysokie stęŜenie kwasu siarkowego w odczynniku Salkowskiego !).
Nadmiar roztworu odsączyć między dwiema warstwami papierowego ręcznika, a następnie
ostroŜnie suszyć w gorącym strumieniu powietrza (uŜywając suszarki do włosów), aŜ do
całkowitego wybarwienia plamek zawierających pierścień indolowy.
OPRACOWANIE WYNIKÓW
Zmierzyć odległości plamek zawierających 1-O-IA-glukozę i IA-myo-inozytol od linii startu i
policzyć wartości Rf.. Przeanalizować przebieg reakcji w czasie i porównać ilości powstających
produktów reakcji.
5