pobierz plik - Wydział Biologii UW

mgr Katarzyna Bocian-Ostrzycka
Zakład Genetyki Bakterii
Instytut Mikrobiologii
Wydział Biologii
Uniwersytet Warszawski
AUTOREFERAT ROZPRAWY DOKTORSKIEJ
Structural and functional characteristics of Helicobacter pylori HP0231 oxidoreductase
Promotor:
prof. dr hab. Elżbieta Katarzyna Jagusztyn-Krynicka
Promotor pomocniczy:
dr Anna Łasica
Recenzenci:
prof. dr hab. Iwona Fijałkowska
Pracownia Mutagenezy i Reperacji DNA
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN
prof. dr hab. Jolanta Zakrzewska-Czerwińska
Zakład Mikrobiologii Molekularnej,
Wydział Biotechnologii, Uniwersytet Wrocławski
Obiektem badań prezentowanej rozprawy doktorskiej był system Dsb (disulfide
bond) odpowiedzialny za zmiany potranslacyjne białek (wprowadzanie mostków
disiarczkowych) mikroorganizmu Helicobacter pylori. Helicobacter pylori to gramujemna,
spiralnie
skręcona,
mikroaerofilna,
ruchliwa
pałeczka
należąca
do
klasy
Epsilonproteobacteria, powszechny ludzki patogen kolonizujący głównie powierzchnię
nabłonka żołądka. Skutkiem zakażenia Helicobacter są choroby górnego odcinka przewodu
pokarmowego: od ostrego zapalenia błony śluzowej żołądka, poprzez zapalenia przewlekłe,
które
następnie
mogą
doprowadzić
do
rozwoju
choroby
wrzodowej.
Następstwem chronicznych infekcji może być rozwój choroby nowotworowej żołądka
(adenocarcinoma), dlatego też, WHO zaliczyła H. pylori do I klasy karcinogenów.
Wiele
czynników
wirulencji
licznych
bakterii
patogennych
to
białka
pozacytoplazmatyczne zawierające więcej niż jedną resztę cysteinową. Dla osiągnięcia
właściwej struktury wymagają wprowadzania mostków disiarczkowych pomiędzy grupami
-SH reszt cysteinowych.
W komórkach Escherichia coli białka Dsb działają na terenie peryplazmy, w dwóch
szlakach metabolicznych: utleniania (EcDsbA, EcDsbB) i izomeryzacji/redukcji (głównie
EcDsbC i EcDsbD). Dodatkowym elementem systemu Dsb E. coli jest białko DsbG. Główna
oksydoreduktaza wprowadzająca mostki disiarczkowe do białek w komórkach wielu
gatunków bakterii to monomeryczne białko DsbA.
Obiektem badań opisanych
w prezentowanej rozprawie jest białko HP0231 Helicobacter pylori, unikatowa dimeryczna
tiolowa oksydoreduktaza, funkcjonalny odpowiednik monomerycznego DsbA. Jednak
w literaturze, początkowo zostało ono opisane jako białko DsbG.
Aby lepiej zrozumieć proces oksydacyjnego zwijania białek H. pylori w prezentowanej
rozprawie przeprowadzono eksperymenty mające na celu: (1) poznanie filogenezy białka
HP0231, (2) określenie właściwości biochemicznych białka, (3) ustalenie roli kluczowych
aminokwasów budujących centrum katalityczne oraz (4) określenie roli domeny
dimeryzacyjnej HP0231.
Przeprowadzone
analizy
filogenetyczne
wykazały,
iż
ewolucyjnie
domena
katalityczna HP0231 jest najbliżej spokrewniona z domeną katalityczną EcDsbG choć posiada
motywy typowe dla klasycznych DsbA klasy I (np. EcDsbA). Na poziomie strukturalnym
domeny katalityczne zarówno białka HP0231 jak i DsbG są najbardziej zbliżone do domen
katalitycznych białek DsbA klasy II (np. MtbDsbA – DsbA Mycobacterium tuberculosis).
Przeprowadzone badania właściwości biochemicznych HP0231 wykazały, że HP0231
jest tiolową oksydoreduktazą o aktywności oksydacyjnej posiadającą dodatkowo
właściwości białka opiekuńczego (podobnie jak EcDsbC/G), ale bez właściwości
izomeryzacyjnych, które są charakterystyczne dla EcDsbC.
Poznanie roli domeny dimeryzacyjnej oraz kluczowych aminokwasów motywu
katalitycznego wymagało skonstruowania hybrydowych białek, skróconego białka HP0231
(HP0231m) pozbawionego domeny dimeryzacyjnej oraz szczepów kodujących punktowo
zmienione HP0231. Wiadomo, że kluczowe znaczenie dla funkcji oksydoreduktaz mają dwie
aminokwasowe reszty cysteiny tworzące charakterystyczny motyw aktywny CXXC oraz
aminokwasowa
reszta
cis-proliny.
Skonstruowane
mutanty
punktowe
dotyczyły
aminokwasów zarówno motywu CXXC (zamiana motywu charakterystycznego dla HP0231
na motyw EcDsbG/C) jak i aminokwasu poprzedzającego prolinę w pętli cis-Pro (zamiana VcP
na TcP). Przeprowadzone badania potwierdziły aktywność oksydacyjną HP0231 oraz
funkcjonowanie badanej proteiny jako białka opiekuńczego. Aktywność „chaperonowa” jest
niezależna od aktywności oksydacyjnej oraz struktury trzeciorzędowej. Wykazano,
że kluczową rolę w funkcjonowaniu HP0231 pełni motyw cis-Pro oraz udokumentowano,
że niewielkie zmiany motywów centrum aktywnego przekształcają HP0231 o aktywności
oksydazy w białko dwufunkcyjne. W badaniu funkcji hybrydowych białek w komórkach
natywnego gospodarza funkcjonalne były wyłącznie warianty HP0231 zawierające natywną
domenę dimeryzacyjną, co wskazuje, że struktura trzeciorzędowa HP0231 warunkuje
rozpoznanie substratów.
Otrzymane wyniki wskazują, że domena dimeryzacyjna białka HP0231 jest kluczowa
dla zachowania jego aktywności w komórkach natywnego gospodarza. Ta nietypowa
oksydoreduktaza pełni zarówno funkcje oksydazy wprowadzającej mostki disiarczkowe, jak
i białka opiekuńczego. Struktura dimeru nie jest niezbędna dla aktywności HP0231 jako
białka
opiekuńczego,
natomiast
proces
wprowadzania
mostków
disiarczkowych
w komórkach H. pylori jest warunkowany zarówno przez obecność odpowiedniego motywu
katalitycznego jak i przez trzeciorzędową strukturę białka HP0231.
W skład prezentowanej rozprawy doktorskiej wchodzą następujące publikacje:
1. Katarzyna M. Bocian-Ostrzycka, Anna M. Łasica, Stanisław Dunin-Horkawicz, Magdalena
J. Grzeszczuk, Karolina Drabik, Aneta M. Dobosz, Renata Godlewska, Elżbieta Nowak,
Jean-François Collet, Elżbieta K. Jagusztyn-Krynicka (2015) Functional and evolutionary
analyses of Helicobacter pylori HP0231 (DsbK) protein with strong oxidative and
chaperone activity characterized by a highly diverged dimerization domain. Frontiers in
Microbiology, 6:1065.
2. Katarzyna M. Bocian-Ostrzycka, Magdalena J. Grzeszczuk, Anna M. Banaś, Katarzyna
Jastrząb, Karolina Pisarczyk, Anna M. Kolarzyk, Anna M. Łasica, Jean-François Collet,
Elżbieta K. Jagusztyn-Krynicka (2016) Engineering of Helicobacter pylori dimeric
oxidoreductase DsbK (HP0231) – the role of catalytic motifs and the N-terminal
dimerization domain. Frontiers in Microbiology, 7:1158.