M. Czyżniejewski - Recenzja 1

Dr hab. Paweł Bednarek, prof. IChB PAN
Instytut Chemii Bioorganicznej PAN
ul. Noskowskiego 12/14
61-704 Poznań
Ocena rozprawy doktorskiej mgr Mariusza Czyżniejewskiego
„Zmiany profili metabolitów wybranych traw z kompleksu Lolium-Festuca w
odpowiedzi na stresy abiotyczne.”
Oddziaływania roślin uprawnych ze środowiskiem, w tym również odpowiedź na stres
abiotyczny mają duży wpływ na produktywność w rolnictwie. Czynniki środowiskowe, takie
jak temperatura, wilgotność, czy też stężenie jonów w glebie, mają bezpośrednie przełożenie
na wysokość uzyskiwanych plonów. Stres spowodowany suszą, wysokim zasoleniem gleby
czy też przymrozkami może prowadzić do znacznych strat w rolnictwie. Ma to szczególne
znaczenie w obliczu obecnych, niekorzystnych zmian klimatycznych obserwowanych na
świecie. Z tych względów tolerancja roślin na niesprzyjające czynniki środowiskowe posiada
duże znaczenie ekonomiczne. W odróżnieniu od zwierząt rośliny nie są w stanie uciec od
niekorzystnych dla ich wzrostu warunków, dlatego ich mechanizmy odporności opierają się
głównie na tworzeniu zewnętrznych barier częściowo chroniących ich przed wpływem
środowiska zewnętrznego oraz modulacji zachodzących procesów biochemicznych.
Publikowane do tej pory wyniki wskazują na istotną, jednakże nie do końca poznaną, rolę
zmian w akumulacji metabolitów, które indukowane są w odpowiedzi na zaistniały stres
abiotyczny. Właśnie tej odpowiedzi na stres abiotyczny wybranych traw z kompleksu LoliumFestuca dotyczy omawiana praca doktorska mgr Mariusza Czyżniejewskiego.
Ocena merytoryczna rozprawy
Doktorant wybrał jako obiekt swoich badań trzy gatunki traw pastewnych z kompleksu
Lolium-Festuca. Były to kostrzewa trzcinowa Festuca arundinacea (odmiana Kord), życica
1
trwała Lolium perenne (odmiana Solen) oraz mieszaniec międzyrodzajowy (Festuca
pratensis x Lolium multiflorum) Festulolium (odmiana Felopa). W ramach omawianej pracy
zbadano zmiany w metabolizmie wybranych linii wywołane stresem chłodu, zasolenia i
suszy. Jednakże mieszaniec międzyrodzajowy badany był jedynie w doświadczeniu
dotyczącym wpływu chłodu na metabolizm. Trawy pastewne zajmują w Polsce około 20%
gruntów ornych, co powoduje, że prowadzone na nich badania mogą mieć znaczenie
ekonomiczne. Wybór gatunków podyktowany był danymi literaturowymi, które wskazywały na
wyraźnie większą odporność kostrzewy trzcinowej na chłód i suszę w porównaniu do życicy
trwałej. Ta różnica w odporności na stres umożliwia potencjalne wyselekcjonowanie zmian
metabolicznych, które mogą być istotne dla odporności na poszczególne czynniki stresowe.
Opisane w pierwszym paragrafie wyniki analiz fenotypowych wykazały, iż zgodnie z
wcześniejszymi doniesieniami literaturowymi kostrzewa trzcinowa wykazała większą
odporność na stres chłodu i suszy niż życica trwała. Przetestowana w doświadczeniu
dotyczącym wpływu chłodu na wzrost roślin mieszaniec międzygatunkowy wykazał
pośrednią odporność. Dodatkowa kostrzewa trzcinowa wykazała większą tolerancję na
zasolenie gleby niż życica trwała. Wyniki uzyskane przez autora podczas analiz
fenotypowych wykazały, że ze względu na kontrastującą tolerancję na użyte w
doświadczeniach czynniki stresowe wybrane gatunki stanowią dobry zestaw do badania
zmian metabolicznych wywołanych stresem abiotycznym.
W
kolejnych
rozdziałach
pracy
autor
opisuje
wyniki
wykonanych
analiz
metabolomicznych. W pierwszej kolejności są to analizy GC/MS metabolitów pierwotnych.
Autor skupia się na związkach, które według odpowiednich analiz statystycznych wykazały
istotny efekt dla traktowania i/lub odmiany. Wśród omawianych związków znalazły się
metabolity reprezentujące różne klasy metabolitów pierwotnych: cukry, aminokwasy, kwasy
organiczne czy też poliaminy. Biorąc pod uwagę fakt, że kostrzewa trzcinowa wykazała
większą tolerancję na badane stresy szczególna uwaga została poświęcona metabolitom,
których akumulacja zmieniała się w odpowiedzi na stres w tym gatunku, ale nie w życicy. Te
zmiany metaboliczne zdaniem autora mogły przyczynić się do zwiększonej tolerancji
kostrzewy na badane czynniki stresowe.
W dalszej części pracy autor skupił się na identyfikacji metabolitów wtórnych
obecnych w badanych gatunkach traw. W analizach struktur metabolitów autor wykorzystał
metody sprzężenia chromatografi cieczowej ze spektrometrią mas w tym HPLC-ESI-IT oraz
UPLC-HESI-Q-ORBITRAP. Druga z wymienionych metod pozwoliła na bardzo dokładny
pomiar masy analizowanych związków, co z kolei ułatwiło identyfikację struktur badanych
związków. Ta część pracy wyraźnie pokazuje, że autor ma dobrze opanowany warsztat
2
spektrometrii mas i jest w stanie samodzielnie interpretować widma masowe. Łącznie w
badanych gatunkach traw autor zidentyfikował 60 metabolitów wtórnych (Załącznik –Tabela).
Wśród zidentyfikowanych związków znajdują się pochodna kwasu benzoesowego oraz
pochodne kwasów hydroksycynamonowych i flawonoidów. W tej ostatniej grupie związków
autor zidentyfikował pochodne cukrowe, w tym mono-, di-, tri-, a nawet jeden tetra-glikozyd.
Scharakteryzowanie takiej liczby metabolitów wtórnych stanowi na pewno jeden z
istotniejszych aspektów poznawczych omawianej rozprawy doktorskiej. Niektóre z
zidentyfikowanych glikozydów były dodatkowo modyfikowane kwasem malonowym lub
kawowym. Pewien niedosyt może budzić fakt, że autor skupił się wyłącznie na związkach
fenolowych (pochodnych fenyloalaniny). Uczucie niedosytu może być zrekompensowane
przez ilość zidentyfikowanych związków. Jednakże biorąc uwagę różnorodność strukturalną
metabolitów wtórnych należy zwrócić też uwagę na fakt, że autor nie podaje jednoznacznie
przyczyn, dla których skupił się wyłącznie na tej klasie związków. Stwierdza on jedynie
(strona 146), „Wśród metabolitów wtórnych szczególną uwagę zwrócono na związki
fenolowe”, bez obiektywnego uzasadnienia tego wyboru (np. czy zadecydowały tu względy
analityczne, czy dane literaturowe na temat funkcji poszczególnych klas metabolitów
wtórnych w odpowiedzi na stres abiotyczny).
W kolejnych rozdziałach autor opisuje zmiany w akumulacji zidentyfikowanych
metabolitów wtórnych w odpowiedzi na badane czynniki stresowe. Podobnie jak w
przypadku analiz metabolitów pierwotnych autor skupia się na związkach, które według
odpowiednich analiz statystycznych wykazały istotny efekt dla traktowania i/lub odmiany.
Ponownie biorąc pod uwagę fakt, że kostrzewa trzcinowa wykazała większą odporność na
badane stresy szczególna uwaga została poświęcona metabolitom, których akumulacja
zmieniała się w odpowiedzi na stres w tym gatunku. Autor stawia hipotezę, że te związki
związane są z odpornością na stres abiotyczny.
Podsumowując część eksperymentalną, zakres zaprojektowanych doświadczeń i
dobór badanych obiektów jest poprawny do tego, aby zbadać zmiany metabolizmu traw
podczas odpowiedzi na różne rodzaje strasu abiotycznego. W moim odczuciu opisane
eksperymenty
zostały
przeprowadzone
z
zachowaniem
odpowiedniej
staranności
badawczej. Należy jednak zwrócić uwagę na brak niezależnych powtórzeń biologicznych w
przypadku doświadczeń dotyczących suszy i zasolenia gleby. Z jednej strony może być to
zrozumiałe biorąc pod uwagę ilość analiz wykonanych dla pojedynczych eksperymentów. Z
drugiej strony, brak powtórzeń biologicznych może znacznie utrudniać opublikowanie
3
uzyskanych wyników. Większość dobrych czasopism wymaga, aby uzyskane wyniki były
weryfikowane w niezależnych eksperymentach.
Wybór gatunków o zróżnicowanej tolerancji na badane czynniki stresowe umożliwił
na wytypowanie metabolitów, które mogą być istotne dla mechanizmów odporności.
Należałoby jednak w dyskusji zwrócić też uwagę na fakt, że odporność na przetestowane
przez autora pracy czynniki stresowe może być zależna od wielu mechanizmów, nie tylko od
obserwowanej zwiększonej biosyntezy metabolitów pierwotnych i wtórnych. Dlatego też nie
można wykluczyć, że w przypadku kostrzewy odporność na suszę zależy od innych
mechanizmów, a obserwowane zmiany w metabolizmie mają charakter wtórny. Taki
scenariusz powinien zostać uwzględniony w dyskusji.
Omawiając aspekty związane z prezentacją wyników oraz dyskusją należy zwrócić
uwagę, że wsparcie tekstu rozprawy rycinami wydaje się niepełne. Na rycinach autor
zamieszcza jedynie podsumowanie analiz fenotypowych dotyczących wpływu badanych
stresów abiotycznych na rozwój roślin (Ryc. 6-10), wykresy przedstawiające zmiany
akumulacji metabolitów pierwotnych (Ryc. 11-29) i wtórnych (Ryc. 52-75), oraz wykres prądu
jonowego i widma masowe zidentyfikowanych związków (Ryc. 30-51). Brakuje rycin lub
tabeli, które porównywałyby zmiany poszczególnych klas metabolitów lub indywidulanych
związków pomiędzy stosowanymi rodzajami stresu i/lub testowanymi gatunkami traw. Takie
zestawienia wsparłyby dyskusję dotyczącą zmian w profilach metabolicznych, które mogą
być istotne w odpowiedzi na stres. Dodatkowo ułatwiłyby one czytelnikowi lepszą ocenę
wniosków autora. Brak jest też schematu, który podsumowywałby zmiany metaboliczne
istotne zdaniem autora dla odporności na suszę. Pewien niedosyt budzi również fakt, że
autor nie umieścił w swojej pracy ryciny przedstawiającej podstawowe struktury
zidentyfikowanych kwasów hydroksycynamonowych oraz aglikonów flawonoidów (apigenina,
izoramnetyna, kempferol, kwercetyna etc.). Praca jest chyba dedykowana osobom
zainteresowanym odpowiedzią roślin na stres abiotyczny, a nie jedynie wąskiej grupie
specjalistów metabolizmu wtórnego roślin, którzy dobrze znają wzory strukturalne
dyskutowanych związków. Dodatkowo w pracy brakuje tabeli lub ryciny (np. diagramy
Venna), która podsumowywałaby ilość konstytutywnie obecnych pochodnych kwasów
hydroksycynamonowych, oraz flawonoidów wspólnych i unikalnych dla badanych gatunków.
Ocena formalna rozprawy
Pod względem formalnym rozprawa doktorska mgr Mariusza Czyżniejewskiego nie
budzi poważnych zastrzeżeń. Obejmuje ona łącznie 177 tekstu (dodatkowo 30 stron
4
załączników) i zawiera 75 rycin (dodatkowo 7 zestawów rycin w załączniku) oraz 11 tabel
(dodatkowo 1 w załączniku). Lista cytowanej literatury zawiera około 140 pozycji. Odnośniki
literaturowe dobrze odzwierciedlają obecny stan wiedzy na temat odpowiedzi na stresy
abiotyczne, funkcji metabolitów pierwotnych i wtórnych w tolerancji na dany stres oraz
zastosowania technik spektrometrii mass w analizie metabolitów fenolowych.
W pracy pojawiły się jednak pewne niedociągnięcia:

Z tekstu pracy (włączając opisy rycin) dosyć trudno jest wywnioskować liczbę
niezależnych prób/pomiarów, które użyte były do obliczenia średnich wyników
prezentowanych na poszczególnych rycinach. Opisując doświadczenia autor podaje
ilość roślin/klonów, które hodowane były do poszczególnych doświadczeń. Nie jest
jednak jasne jak te ilości korespondują do ilości próbek użytych do pomiaru RWC,
bądź też do ilościowych analiz metabolomicznych. Z reguły liczba analizowanych
prób (n) powinna być jasno podana w materiałach i metodach lub w opisach
poszczególnych rycin.

Na wykresach nie zaznaczono, które różnice są istotne statystycznie.

W przypadku wszystkich wykresów opisujących akumulację metabolitów skala osi y
opisana jest jako „Skala lograytmiczna (log2)”. Niestety autor nie podaje jaka wielkość
jest wyrażona w tej skali. Można się domyśleć, że chodzi tu o wyniki integracji
chromatogramów prądów jonowych odniesione prawdopodobnie do standardu
wewnętrznego. Jednakże powinno to zostać wyraźnie sprecyzowane.

Autor stosuje w swojej pracy trzy rodzaje wykresów do pokazania obserwowanych
zmian metabolitów podczas odpowiedzi na stres solny i suszy: liniowy (np. Ryc. 17),
słupkowy (np. Ryc. 18) lub słupkowy 3D (Ryc. 63). Trudno znaleźć uzasadnienie
dlaczego dla przedstawienia tego samego rodzaju danych dla różnych związków
wybrano w sposób raczej losowy różne rodzaje wykresów.

Dla wyników prezentowanych, jako wykresy liniowe i słupkowe 3D nie podano
odchyleń standardowych.

Autor używa wielokrotnie zwrotu „traktowane stresem”, co jest raczej niepoprawne.

Nazwa trycyna, którą autor używa w stosunku do flawonoidu (ang. tricin) jest
używana w języku polskim również dla N-tris(hydroksymetylo)metylo glicyny (ang.
tricine). Dlatego użycie tej nazwy nie jest do końca jednoznaczne, szczególnie
uwzględniając brak ryciny przedstawiającej wzór strukturalny tego związku.
5
Podsumowanie
Zat6wno zawartosd meMoryczna,
jak
i
forma omawianej rozpnv,ry doktorskiej
Swiadczq o tym, 2e mgr Mariusz Czy2niejewski posiadl duzy zas6b wiedzy i opanowal
odpowiedni warsztat eksperymentalny, co umozliwilo zrealizowanie interesuiqcego projektu
badawczego. oceniana rozprawa zawiera wiele ciekawych wynik6w, kt6re stanowiq
podstawQ do dalszych bada6 nad funkcia metabolit6w pierwotnych iM6rnych w odpornosci
roslin na stresy abiotyczne. Dodatkowo uzyskane wyniki stanowiE istotny wklad w poznanie
metabolizmu wt6rnego traw. wymienione przeze mnie powyzej uchylenia nie wplywaiq na
pozytywnq oceng pracy, kt6ra moim zdaniem spelnia wszystkie wymagania stawiane
rozprawom doktorskim. Na tej podstawie wnioskujg do Rady Naukowej Instytutu Genetyki
Roslin Polskiej Akademii Nauk w poznaniu o dopuszczenie mgr Mariusz czyzniejewskiego
do dalszych etap6w pzewodu doktorskiego.
Pawel Bednarek
i?u{wJ'-'*^--
6