Labowe „know-how” — rozdział białek SDS-PAGE

Labowe „know-how” — rozdział
białek SDS-PAGE (Schagger & von
Jagow)
Przedstawiamy sprawdzony przepis na elektroforezę białek w żelu
poliakrylamidowym w warunkach denaturujących w obecności SDS (SDSPAGE) w systemie Schagger & von Jagow.
Używane bufory
Bufor katodowy 5x (na 1 L):
61 g Tris
89,5 g tricyna
5,0 g SDS
0,5 M
0,5 M
0,5%
nie korygować pH
Bufor anodowy 5x (na 1 L):
121,1 g Tris-HCl
1M
pH 8.9
doprowadź do odpowiedniego pH stosując 10 M HCl
Roztwory do polimeryzacji żelu poliakrylamidowego
Bufor do żelu (na 100 ml):
36,35 g Tris base
0,3 g SDS
3M
0,3%
pH 8.45
Akrylamid/bis do białek, 5-100 kDa (na 100 ml):
49,5% T, 3% C
48 g akrylamidu
1,5 g N,N’-metylenobisakrylamidu
Akrylamid/bis do peptydów (na 50 ml):
49,5% T, 6% C
23,25 g akrylamidu
1,5 g N,N’-metylenobisakrylamidu
Uwaga! Roztwory akrylamidu przefiltruj przed użyciem i przechowuj w lodówce w
ciemnej butelce.
Bufor do próbek (1:2):
2,0 ml 0,5 M Tris pH 6.8
1,6 ml glicerolu
3,2 ml 10% SDS
1,2 ml dH2O
na oko CBB G-250 lub bromofenol blue
+ 37,4 ul na 0,5 ml buforu b-merkaptoetanolu
lub + 50 mg/ml DTT
Bufor rozporcjuj i przechowuj w -20 st.
10% APS
1 g nadsiarczanu amonu rozpuść w 9 ml dH2O
Rozporcjuj i przechowuj w -20 st.
Po rozmrożeniu resztę wyrzuć!
Skład żeli poliakrylamidowych (na 2 lub 4 żele)
Składniki
(dodawaj w tej
kolejności!)
Żel rozdzielający
(10%)
Żel zagęszczający
(4%)
dH2O
4,86 ml
9,72 ml
8,325 ml
16,65 ml
Bufor do żelu
5,00 ml
10,0 ml
3,1 ml
6,2 ml
Akrylamid/bis
3,05 ml
6,1 ml
1 ml
2 ml
Glicerol bezw.
2,00 ml
4,00 ml
–
–
TEMED
7,5 µl
15 µl
7,5 µl
15 µl
APS
75 µl
150 µl
75 µl
150 µl
obj. końcowa
15 ml
30 ml
12,5 ml
25 ml
Uwagi:
— przy pracy z akrylamidem zawsze używaj rękawiczek (nitrylowych)!
— roztwór TEMED ma bardzo nieprzyjemny zapach — dodawaj go pod
dygestorium
— jeśli chcesz, by żel szybciej spolimeryzował wstaw go do ciepłego
pomieszczenia (37 st.) lub oświetl go mocno.
— upewnij się, że bufor katodowy nie wypływa – w przeciwnym wypadku rozdział
się zatrzyma
— jeśli chcesz osiągnąć bardzo dokładny rozdział białek, prowadź elektroforezę
przy niskim napięciu (40 V przez żel zagęszczający i 60 V przez żel rozdzielający)
SDS-PAGE — wybarwiony żel
AM
Data publikacji: 13.02.2013r.