Mikrobiologia II - Instrukcje do ćwiczeń

Ćwiczenie 1 Wprowadzenie do ćwiczeń w laboratorium mikrobiologicznym.
1. BHP w pracowni mikrobiologicznej
2. Technika pracy
- wyposażenie pracowni mikrobiologicznej
- metody sterylizacji - przypomnienie
- jałowość pracy,
3. Metody hodowli mikroorganizmów
podłoża płynne i stałe, cechy pożywki
rodzaje posiewów
warunki wzrostu drobnoustrojów, hodowle tlenowców i beztlenowców
krzywe wzrostu hodowli bakteryjnej (hodowla stacjonarna, ciągła, zsynchronizowana)
4. Antybiotyki i lekooporność. Określanie wrażliwości bakterii na antybiotyki – antybiogram, MIC
ZADANIA:
1. Przygotowanie podłoży mikrobiologicznych
a) przygotować pożywkę i podłoże wg podanego przepisu. Gotowe podłoża sterylizować w autoklawie
(121ºC, 20 minut)
Skład podłoża
LA
Trypton
Hydrolizat drożdży
NaCl
agar
Końcowe pH w 25°C:
dopełnić wodą
destylowaną
1000 ml
10g
5g
10 g
15 g
7,0 ± 0,2
do 1000 ml
Skład pożywki
LB
Trypton
Hydrolizat drożdży
NaCl
Końcowe pH w 25°C:
dopełnić wodą
destylowaną
1000 ml
10 g
5g
10 g
7,0 ± 0,2
do 1000 ml
b) wylać jałowo płytki z podłożem
2. Wykonać posiewy otrzymanych szczepów bakteryjnych, posiew redukcyjny i na murawę
(samodzielnie)
3. Zaszczepić po 2 probówki otrzymanego szczepu niosącego plazmid z opornością na ampicylinę
(samodzielnie)
Do otrzymanej pożywki dodać ampicyliny do końcowego stężenia 100ug/ml (cała grupa), rozporcjować
jałowo po 4 ml pożywki do probówek. Zaszczepić każdą z probówek otrzymanym szczepem, umieścić w
wytrząsarce w temperaturze 37ºC.
Ćwiczenie 2 Podstawy biologii komórki bakteryjnej.
1. Budowa komórki bakteryjnej. Ściana komórkowa w barwieniu Grama
2. Materiał genetyczny bakterii .Właściwości i struktura plazmidów
3. Sposoby i zasady izolacji DNA genomowego i plazmidowego
ZADANIA:
1. Barwienie złożone-metoda Grama
Przygotować preparat mikroskopowy, rozpoznać bakterie gramujemne i gramdodatnie
(samodzielnie)
Bakterie nanieść na szkiełko podstawowe. W przypadku wykonywania preparatu z hodowli płynnej, nanieść
ezą na szkiełko kroplę hodowli i rozprowadzić zawiesinę na powierzchni szkiełka. W przypadku
LZCh – Mikrobiologia II
wykonywania preparatu z podłoża stałego, pobrać materiał ezą, zawiesić bakterie w kropli soli fizjologicznej
(0,85% NaCl).
Po wyschnięciu, preparat utrwalić poprzez przeciągnięcie szkiełka podstawowego nad płomieniem palnika.
Nie trzymać szkiełka w płomieniu!
a) Na utrwalony preparat nanieść fiolet krystaliczny, aby całkowicie pokrył powierzchnię z bakteriami.
Pozostawić przez 2 minuty.
b) Zmyć fiolet krystaliczny wodą destylowaną.
c) Nanieść płyn Lugola i pozostawić przez 1 minutę. Spłukać wodą destylowaną.
d) Spłukać obficie alkoholem etylowym (odbarwianie), następnie wodą destylowaną.
e) Nanieść roztwór fuksyny zasadowej i pozostawić na 40 sekund. Spłukać wodą i pozostawić preparat
do wyschnięcia. Oglądać pod mikroskopem stosując obiektyw immersyjny.
2. Izolacja DNA plazmidowego bakterii (w parach)
a) metoda lizy alkalicznej
Odczynniki: B1 (50 mM glukoza, 25 mM Tris-HCl ;pH = 8,0 , 10 mM EDTA; 100 µg/ml RNA-za A), B2 (200
mM NaOH; 1% SDS), B3 (3 M octan potasu pH = 4.8), fenol :chloroform 1:1, chloroform, 96% etanol, 70%
etanol, TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA);
1) Odwirować w mikrowirówce dwukrotnie po 1,5 ml hodowli bakteryjnej (w jednej probówce), następnie
osad zawiesić w 100 ul buforu 1, dokładnie rozprowadzić. Umieścić w łaźni lodowej na 10 minut.
2) Dodać 200ul buforu 2 i delikatnie wymieszać, ponownie umieścić probówkę w łaźni lodowej na 10 minut.
3) Dodać 150 ul buforu 3 i ponownie umieścić probówkę w łaźni lodowej na 10 minut.
4) Probówki wirować (12 000 × g przez 10 minut) w miniwirówce a następnie przenieść supernatant do
nowej probówki.
5) Dodać ½ objętości (supernatantu) fenolu i taką samą objętość chloroformu i mieszać przez około 2
minuty.
6) Odwirować (12 000 × g przez 5 minut) w miniwirówce. Górną fazę wodną (zawierającą DNA) przenieść do
nowej probówki.
7) Dodać równą objętość chloroformu i ponownie ekstrahować jak uprzednio. Po wirowaniu zebrać warstwę
wodną. (*aby całkowicie usunąć fenol (może być w śladowych ilościach w fazie wodnej (fenol jest
inhibitorem PCR i reakcji enzymatycznych)) zaleca się czynność tę powtórzyć dwa razy)
8) Dodać 2 objętości 96% etanolu, wymieszać i precypitować w temperaturze pokojowej przez 10 minut
(precypitacja DNA).
9) Odwirować (12 000 × g przez 10 minut) w mikrowirówce, supernatant delikatnie zlać.
10) Do osadu dodać 1 objętość 70% etanolu, wstrząsnąć kilka razy i wirować (12 000 × g) przez kolejne 10
minut
11) Zlać supernatant a osad DNA wysuszyć z etanolu i zawiesić w 50ul roztworu TE.
UWAGA!!! FENOL JEST ŻRĄCY (NIEBEZPIECZEŃSTWO POPAŻENIA)
A CHLOROFORM JEST TOKSYCZNY (I LOTNY, NIE WDYCHAĆ!!!)
b) oczyszczanie na złożu krzemionkowym (minikolumienki) zgodnie z otrzymanym protokołem
LZCh – Mikrobiologia II
Ćwiczenie 3 Elektroforeza DNA w żelu agarozowym. Enzymy restrykcyjne-narzędzia obróbki DNA.
1. Elektroforeza agarozowa kwasów nukleinowych. Zasada, warunki rozdziału, bufory.
2. Enzymy restrykcyjne-charakterystyka, właściwości i zastosowanie.
ZADANIA:
1. Trawienie otrzymanego DNA plazmidowego i genomowego enzymem restrykcyjnym (w parach)
Zaproponować skład mieszaniny reakcyjnej wiedząc, że maksymalne stężenie glicerolu może wynieść 5%, a
enzym restrykcyjny przechowywany jest w buforze zawierającym 50% glicerolu, natomiast bufor reakcyjny
jest 10-krotnie stężony.
Składnik
Ilość
DNA
10 µl
Trawić godzinę w 37 ºC mieszaninę reakcyjną zawierającą: 10 µl otrzymanego DNA, bufor reakcyjny, enzym
restrykcyjny i wodę destylowaną. Objętość reakcji 20ul.
2. Rozdział elektroforetyczny próbek DNA plazmidowego w żelu agarozowym (cała grupa)
SPORZĄDZAJĄC ŻEL AGAROZOWY PAMIĘTAĆ O UŻYCIU RĘKAWICZEK LATEKSOWYCH DLA
OCHRONY PRZED BROMKIEM ETYDYNY!
Odczynniki: agaroza, bufor rozdzielający 1xTAE pH = 8,0 (4,84 g Tris; 1,142 ml 99% kwasu octowego; 2 ml
0,5 M EDTA pH = 8,0; woda destylowana do 1000 ml); bromek etydyny o stężeniu 5 mg/ml; roztwór do
nanoszenia DNA w studzienki żelu 5x stężony (100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 30%
glicerol, 0.02% błękit bromofenolowy, 0.02% xylene cyanol).
1) Przygotować bufor TAE
2) Przygotować 1% żel agarozowy w buforze TAE (do przygotowania żelu używamy tego samego buforu,
który będzie nam służył jako bufor elektrodowy w czasie rozdziału). Odważyć odpowiednią ilość agarozy,
rozpuścić w buforze w kuchence mikrofalowej
3) Ostudzić żel do temperatury około 60 oC, dodać bromku etydyny (1µl/100 ml żelu). Wylać żel na
przygotowaną tackę
4) Po zastygnięciu żelu (minimum 30 minut), wstawić żel do aparatu do elektroforezy
5) Napełnić aparat buforem (ten sam bufor jakiego używaliśmy do przygotowania żelu) do wysokości 5 mm
nad powierzchnię żelu, wyjąć grzebień
6) Przygotować próbki: do próbek DNA przed i po trawieniu enzymem restrykcyjnym (20µl) dodać buforu
obciążającego(5 µl), zmieszać i całość nanieść do studzienek w żelu
Rozdział prowadzić w obecności markera wielkości.
7) Włączyć zasilanie (warunki rozdziału 100V)
LZCh – Mikrobiologia II
8) Gdy barwnik w żelu agarozowym zawędruje do przeciwległego końca żelu wyłączyć zasilanie
9) Podświetlić żel lampą UV i obserwować odmienną ruchliwość elektroforetyczną różnych form DNA
3. Zaszczepić probówkę otrzymanym szczepem (w parach)
Rozporcjować jałowo po 4 ml pożywki do probówek. Zaszczepić probówkę otrzymanym szczepem, umieścić
w wytrząsarce w temperaturze 37ºC.
Ćwiczenie 4 Rozdział elektroforetyczny białek komórki bakteryjnej w warunkach denaturujących-SDSPAGE.
1. Metody lizy komórki bakteryjnej.
2. Analiza elektroforetyczna białek w żelu poliakrylamidowym. Warunki, zasady metody. Odczyt
wyniku.
Metoda rozdziału elektroforetycznego na żelu poliakrylamidowym w obecności SDS w układzie Laemmli (1970)
ZADANIA:
1. Przygotowanie żelu poliakrylamidowego
Przygotować żel składający się z 8% żelu rozdzielającego i 5% żelu zagęszczającego zgodnie z
otrzymanym przepisem
1) Między płytkami szklanymi umieścić przekładki o odpowiedniej grubości. Całość umieścić w worku do
wylewania żeli, a następnie w statywie
2) Między płyty szklane wlać roztwór żelu dolnego (8%) do wysokości 6 cm i nawarstwić wodę destylowaną
w celu odcięcia dostępu powietrza. Żel pozostawić w temperaturze pokojowej do polimeryzacji (około 30
min.)
3) Po spolimeryzowaniu żelu dolnego usunąć wodę, wylać roztwór żelu górnego, włożyć grzebień i ponownie
pozostawić w temperaturze pokojowej do polimeryzacji
2. Liza komórek bakteryjnych (w parach), przygotowanie preparatu
1) Odwirować w mikrowirówce 2 ml hodowli bakteryjnej w wytarowanej wcześniej probówce eppendorfa 5
min. 5000 rpm. Zważyć probówki po wirowaniu, określić masę osadu
2) Dodać buforu 20 mM Tris-HCl, pH 6,8, proporcjonalnie do masy osadu oraz odpowiednią ilość barwnika
denaturującego
3) Umieścić na 5 minut w bloku grzejnym w temperaturze 96ºC
3. Nanoszenie prób
1) Po zakończeniu polimeryzacji płytki umieścić w aparacie do elektroforezy i wlać bufor elektrodowy do
pojemnika wewnętrznego i zewnętrznego. Usunąć grzebienie
2) Pobrać 10 ul preparatu zawierającego zdenaturowane białka i nanosić do studzienek przygotowanego
żelu. Rozdział prowadzić w obecności markera wielkości
LZCh – Mikrobiologia II
4. Warunki rozdziału
Rozdział elektroforetyczny przeprowadzić stosując napięcie 100V przez około 2 godziny. Gdy barwnik
zawędruje do końca żelu wyłączyć zasilanie
5. Wybarwianie białek
1) Po zakończeniu elektroforezy żel inkubować minimum 6 godzin w barwniku do żeli poliakrylamidowych
2) Odbarwiać poprzez kilkakrotną zmianę odbarwiacza do żeli poliakrylamidowych w celu usunięcia
nadmiaru barwnika
Bufory stosowane do elektroforezy białek w warunkach denaturujących oraz do barwienia żelu:
Roztwór akrylamidów: 30%: 29% akrylamid, 1% N, N-metyleno-bisakrylamid
Roztwór 10% SDS
Roztwór 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8)
Roztwór 1 M Tris-HCl (pH 6,8)
Roztwór nadsiarczanu amonu 10%
TEMED - N,N,N’,N’- tetrametyloetylenodiamina
Barwnik do żeli poliakrylamidowych: 0,2 % roztwór Coomassie Brillant Blue R-250 w odbarwiaczu do żeli
poliakrylamidowych
Odbarwiacz do żeli poliakrylamidowych: 8 części wody, 2 części metanolu, 1 część lodowatego kwasu
octowego)
Bufor glicynowy do elektroforezy SDS-PAGE: 25 mM Tris-HCl (pH 8,3), 250 mM glicyna, 0,1% SDS
Barwnik denaturujący (2 x stężony): 20 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2 mM EDTA (pH 8,0), 5% SDS, 10% 2merkaptoetanol, 0,02% błękit bromofenolowy, 1% glicerol
Żel górny (zagęszczający) (5 ml, 1 płytka)
akryl amidy 30%
0,67 ml
bufor 1M Tris-HCl, pH 6.8
1,2 ml
woda
3,0 ml
10% SDS
50 µl
10% nadsiarczan amonu
50 µl
TEMED (100%)
5 µl
LZCh – Mikrobiologia II