Analiza genotypów krętków Borrelia burgdorferi w grupie chorych na

PRACE ORYGINALNE
Gra¿yna BIESIADA1
Jacek CZEPIEL1
Dominika SALAMON1
Aleksander GARLICKI1
Anna DZIUBEK2
Barbara MAZIARZ2
Tomasz MACH1
Klinika Chorób ZakaŸnych
Katedry Gastroenterologii, Hepatologii
i Chorób ZakaŸnych
Collegium Medicum
Uniwersytetu Jagielloñskiego w Krakowie
Kierownik Katedry: Prof. dr hab. Tomasz Mach
Kierownik Kliniki:
Dr hab. med. Aleksander Garlicki
1
Pracownia Neurogenetyki
Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie
Kierownik Pracowni:
Dr n. biol. Barbara Maziarz
2
Dodatkowe s³owa kluczowe:
borelioza
choroba z Lyme
krêtki
genogatunek
Additional key words:
borreliosis
Lyme disease
spirochetes
genostrain
Adres do korespondencji:
Dr n. med. Gra¿yna Biesiada
Klinika Chorób ZakaŸnych
Katedry Gastroenterologii,
Hepatologii i Chorób ZakaŸnych CM UJ
31-501 Kraków, ul. Œniadeckich 5
Tel.: 12-4247349; Fax: 12-4247380
e-mail: [email protected]
Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 9
Analiza genotypów krêtków Borrelia
burgdorferi w grupie chorych na boreliozê
Analysis of Borrelia burgdorferi genostrains among
patients with Lyme disease
Wstêp: Borelioza z Lyme jest chorob¹ odzwierzêc¹ przenoszon¹ na
cz³owieka w czasie wk³ucia zaka¿onego kleszcza z rodzaju Ixodes. Choroba wywo³ywana jest przez krêtki z rodzaju Borrelia, zaliczane do gatunku
Borrelia burgdorferi. W Polsce wystêpuj¹ genogatunki Borrelia garinii, Borrelia afzelii i Borrelia burgdorferi sensu stricto, a w ostatnim okresie rejestruje siê obecnoœæ antygenów Borrelia spielmani. Materia³ i metody: Badanie przeprowadzono w grupie 249 chorych diagnozowanych w Szpitalu Uniwersyteckim w Krakowie z powodu
podejrzenia boreliozy w latach 2005 do
2008. Oceniano wyniki testów serologicznych w kierunku boreliozy analizuj¹c obecnoœæ przeciwcia³ przeciwko antygenom krêtków w teœcie Elisa
w klasie IgG i IgM (test firmy Biomedica), wyniki dodatnie by³y potwierdzane testem Western blot (test firmy Mikrogen). Analizowano obecnoœæ pr¹¿ków przeciwcia³ przeciwko poszczególnym antygenom krêtków. Wyniki:
Zwraca uwagê wysoki odsetek przeciwcia³ w klasie IgM, uczestnicz¹cej
g³ównie w ostrej fazie choroby, typowych dla Borrelia garinii, podczas gdy
dla przeciwcia³ w klasie IgG wystêpuje przewaga bia³ek typowych dla Borrelia afzellii oraz Borrelia burgdorferi
sensu stricto. Zwraca uwagê wysoki
odsetek wystêpowania antygenu VlsE,
zw³aszcza reaguj¹cego z przeciwcia³ami w klasie IgG. Odnotowano wystêpowanie genogatunku krêtków Borrelia spielmani w Polsce.
Background: Lyme borreliosis is a
zoonose which can be transmitted to
the humans during Ixodes tick bite to
the skin. The disease is caused by bacteria - spirochetes of the Borrelia species, classified as Borrelia burgdorferi
strain. In Poland Lyme borreliosis is
caused by Borrelia garinii, Borrelia
afzelii and Borrelia burgdorferi sensu
stricto. The presence of Borrelia
spielmani was recently reported. Material and methods: The study included
249 patients diagnozed in University
Hospital in Krakow due to suspicion
of Lyme borreliosis in 2005-2008. Results of serologic tests against
borreliosis were analized using Elisa
tests (Mikrogen), positive tests were
confirmed using Western blot tests
(Biomedica). Results: It was found the
high percentage of the antibodies in
class IgM, which are important in acute
phase of borreliosis, typical for Borrelia garinii, whereas in class IgG it was
found the prevalence of protein typical for Borrelia afzellii and Borrelia
burgdorferi sensu stricto. It was found
the high prevalence of the presence
VlsE reacting with IgG antibodies. It
was noted the presence of Borrelia
spielmani genostrain in Poland.
Wstêp
Borelioza z Lyme jest chorob¹ odzwierzêc¹ przenoszon¹ na cz³owieka w czasie
wk³ucia zaka¿onego kleszcza z rodzaju Ixodes. Choroba wywo³ywana jest przez krêtki
z rodzaju Borrelia, zaliczane do gatunku
Borrelia burgdorferi (Bb). W Polsce wystêpuj¹ genogatunki Borrelia garinii (B.garinii),
Borrelia afzelii (B.afzelii) i Borrelia burgdorferi sensu stricto, a w ostatnim okresie czasu rejestruje siê obecnoœæ antygenów Borrelia spielmani (B.spielmani) [1-3].
W okresie wczesnym na skórze rozwija
siê rumieñ wêdruj¹cy, który jest objawem
patognomicznym boreliozy. Prawid³owe leczenie antybiotykami w tym okresie doprowadza do wyleczenia choroby. Jeœli pacjent
nie by³ leczony w okresie rumienia wêdruj¹cego, leczenie by³o znacznie opóŸnione, lub
dosz³o do zaka¿enia, a EM nie wyst¹pi³,
mo¿e dojœæ do rozsiewu zaka¿enia i lokalizacji narz¹dowej. W okresie rozsiewu zaka¿enia obraz kliniczny boreliozy jest zró¿nicowany, wystêpuj¹ objawy skórne, dochodzi do zajêcia stawów, systemu nerwowego lub bardzo rzadko serca. W stadium póŸnym zaka¿enia wystêpuje przewlek³e zapalenie zanikowe skóry koñczyn, zmiany na-
511
rz¹dowe neurologiczne i reumatologiczne
utrzymuj¹ce siê powy¿ej 12 miesiêcy [4,5].
W diagnostyce boreliozy istotny jest
wywiad epidemiologiczny, w którym najwa¿niejszym faktem jest nara¿enie na k³ucie
przez kleszcze, nastêpnie wystêpowanie
typowych dla boreliozy objawów chorobowych i stwierdzenie obecnoœci przeciwcia³
przeciwko Bb. Dwustopniowa diagnostyka
serologiczna opiera siê na stwierdzeniu
przeciwcia³ przeciwko antygenom krêtków.
W pierwszym etapie wykonywany jest test
Elisa, który ma wysok¹ czu³oœæ, dodatnie
lub graniczne wyniki powinny byæ potwierdzone testem Western blot, który jest bardziej specyficzny [4,5].
Celem pracy by³a analiza genogatunków krêtków i ich antygenów w grupie chorych diagnozowanych z powodu podejrzenia boreliozy w materiale Kliniki Chorób ZakaŸnych w Krakowie.
Materia³ i metody
Badanie przeprowadzono w grupie 249 chorych
diagnozowanych w Szpitalu Uniwersyteckim z powodu
podejrzenia boreliozy w latach 2005 do 2008. Oceniano wyniki testów serologicznych w kierunku boreliozy
analizuj¹c obecnoœæ przeciwcia³ przeciwko antygenom
krêtków w teœcie Elisa w klasie IgG i IgM (test firmy Biomedica), wyniki dodatnie by³y potwierdzane testem
Western blot (test firmy Mikrogen). Analizowano obecnoœæ pr¹¿ków przeciwcia³ przeciwko poszczególnym
antygenom krêtków.
Wyniki
W ocenianej grupie 239 chorych pacjentów mia³o dodatnie wyniki testów serologicznych w kierunku boreliozy, w co najmniej
jednej z klas, IgM lub IgG, w teœcie Elisa,
które zosta³y potwierdzone testem Westernblot. U 10 chorych z dodatnimi wynikami
testu Elisa, test Western blot by³ ujemny.
Dodatnie przeciwcia³a badane testem Elisa w klasie IgM stwierdzono w 111 (46,4
%) przypadkach, przeciwcia³a w klasie IgG
by³y dodatnie u 147 (61,5 %) chorych, 14
pacjentów (5,9%) mia³o dodatnie przeciwcia³a w obu klasach.
W grupie pacjentów z obecnymi przeciwcia³ami klasy IgM antygen OspC stwierdzono u 95 (85%) chorych, spoœród nich
77,5% mia³o antygen przeciwko B.garinii 1,
u 61% chorych stwierdzano antygen B.garinii 2, u 62,1% antygen B.burgdorferri sensu stricto i B.afzelii, u 11% B.spielmani.
Antygen OspA B.afzelii stwierdzano u 9%
chorych, antygen p100 B.afzelii u 19,8%. U
51,5% by³ obecny antygen p41 przeciwko
flagellinie Bb sensu stricto, u 27% antygen
p41 przeciwko flagellinie B.afzelii, u 26%
p41 przeciwko flagellinie B.garinii. Antygen
VlsE stwierdzano u 18% chorych.
W grupie pacjentów z obecnymi przeciwcia³ami klasy IgG antygen OspC stwierdzono u 44 (29,9 %) chorych, spoœród nich
15,6% mia³o antygen przeciwko B.garinii 1,
512
u 13,6% chorych stwierdzano antygen B.garinii 2, u 18,4% antygen Bb sensu stricto i
B.afzelii, u 8% B.spielmani. Antygen OspA
B.afzelii stwierdzano u 4,8% chorych, antygen p100 B.afzelii u 51%. U 69% by³ obecny antygen p41 przeciwko flagellinie Bb sensu stricto, u 54% antygen p41 przeciwko flagellinie B.afzelii, u 17% p41 przeciwko flagellinie B.garini. Antygen VlsE stwierdzano
u 72% chorych.
powanie przeciwcia³ przeciw B.spielmani.
Tak wiec wykazano na podstawie wyników
badañ w grupie chorych wystêpowanie zaka¿eñ wywo³anych B.spielmani w Polsce.
Stwierdzenie niskiego odsetka (18%) antygenów VlsE reaguj¹cych z przeciwcia³ami
w klasie IgM i wysokiego odsetka (72%)
antygenu VlsE reaguj¹cego z przeciwcia³ami klasy IgG wskazuje na istotn¹ rolê tego
antygenu w diagnozowaniu boreliozy.
Omówienie
Profil bia³kowy poszczególnych gatunków Bb jest bardzo zró¿nicowany. W diagnostyce serologicznej zaka¿enia Bb pocz¹tkowo wykorzystywano detekcjê bia³ek
OspA, OspC, nastêpnie do oceny testów
wprowadzono równie¿ p100, BmpA, a w
ostatnim okresie VlsE. Osp A jest jedn¹ z
wiêkszych lipoprotein b³ony zewnêtrznej Bb.
Masa molekularna OspA waha siê od 31 do
34 kDa poœród ró¿nych gatunków Bb. OspA
jest bia³kiem, wykorzystywanym do prac nad
szczepionk¹ przeciw Bb. W 1993 roku Wilske i wsp. wyró¿nili 7 ró¿nych serotypów
oznaczonych od 1 do 7, w nastêpnych latach wyró¿niono serotyp 8 oraz jedenaœcie
serotypów J (od J1 do J11). Typ 1 odpowiada Bb sensu stricto, typ 2 B. afzelii, natomiast sk³ad B. garinii jest bardziej zró¿nicowany, mo¿emy wyró¿niæ typy od 3 do 8 oraz
od J1 do J9. Masa molekularna bia³ek OspC
waha siê od 20 do 25 kDa poœród ró¿nych
gatunków Bb, s¹ one typowe szczególnie
dla wczesnej fazy infekcji. OspC w porównaniu do OspA jest o wiele bardziej zró¿nicowany, zw³aszcza dla Bb sensu stricto i B.
afzelii [6-9].
VlsE (variable major protein-like sequence, expressed) jest ostatnio zidentyfikowanym i wprowadzonym do diagnostyki
boreliozy bia³kiem. Europejskie wielooœrodkowe badanie wykaza³o, i¿ u pacjentów z
EM czu³oœæ IgG przeciw Bb wzrasta z 47%
do 66,8% kiedy w teœcie serologicznym
uwzglêdniony jest VlsE [11,12].
W przedstawionej pracy analiza pr¹¿ków przeciwcia³ w klasie anty-IgM reaguj¹cych z antygenami krêtków wykaza³a wysoki odsetek (77,5%) przeciwcia³ przeciwko B.garinii. Ten genogatunek krêtków jest
stwierdzany w Polsce, wykazuje wiêksze
powinowactwo do tkanki nerwowej i czêœciej
wywo³uje neuroboreliozê. Wœród pr¹¿ków
przeciwcia³ klasy IgG przeciwcia³a przeciw
B.garinii wystêpowa³y rzadziej (15,6%). W
grupie chorych zaka¿onych B.afzelii stwierdzono odpowiednio 19,8% antygenów reaguj¹cych z przeciwcia³ami w klasie IgM i
51% w klasie przeciwcia³ IgG. Przeciwcia³a
przeciw B. burgdorferi sensu stricto wystêpowa³y u 62% w klasie IgM i u 69% chorych
w klasie IgG. Poza tymi trzema genogatunkami krêtków stwierdzono w 11% przypadków w klasie IgM i 8% w klasie IgG wystê-
Wnioski
1. Zwraca uwagê wysoki odsetek przeciwcia³ w klasie IgM, uczestnicz¹cej g³ównie w ostrej fazie choroby, typowych dla
B.garinii, podczas gdy dla przeciwcia³ w klasie IgG wystêpuje przewaga bia³ek typowych
dla B.afzellii oraz Bb sensu stricto.
2. Zwraca uwagê wysoki odsetek wystêpowania antygenu VlsE, zw³aszcza reaguj¹cego z przeciwcia³ami w klasie IgG.
3. Odnotowano wystêpowanie genogatunku krêtków B.spielmani w Polsce.
Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 9
Piœmiennictwo
1. Stañczak J., Racewicz M., Kubica-Biernat B. et
al.: Prevalence of Borrelia burgdorferi sensu lato in
Ixodes ricinus ticks in different Polish woodlands.
Ann. Agric. Environ. Med. 1999, 6, 127.
2. Flisiak R., Prokopowicz D.: Przeciwcia³a przeciw
borrelia garinii w diagnostyce boreliozy z Lyme.
Przegl. Lek. 2000, 57, 147.
3. Marques A.: Chronic Lyme disease: a review. Clin.
Inf. Dis. 2008, 22, 241.
4. Hermanowska-Szpakowicz T., Œwierzbiñska R.,
Zajkowska J. i wsp.: Aktualne mo¿liwoœci diagnostyki boreliozy z Lyme. Pol. Merk. Lek. 2000, 8, 43,
69.
5. Flisiak R., Pancewicz S.: Diagnostyka i leczenie
Boreliozy z Lyme - rekomendacje Polskiego
Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób
ZakaŸnych. Przegl. Epidemiol. 2008, 62, 193.
6. Wang G., van Dam A.P., Schwartz I. et al.: Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato: taxonomic, epidemiological and clinical implications. Clin.
Microbiol. Rev. 1999, 12, 633-653.
7. Wilske B., Preac-Mursic V., Gobel U.B. et al.: An
OspA serotyping system for Borrelia burgdorferi
based on reactivity with monoclonal antibodies and
OspA sequence analysis. J. Clin. Microbiol. 1993,
31, 340.
8. Hauser U., Lehnert G., Wilske B.: Validity of interpretation criteria for standardized Western Blots
(Immunoblots) for serodiagnosis of Lyme borreliosis
based on sera collected through Europe. J. Clin.
Microbiol. 1999, 37, 2241.
9. Norman G.L., Antig J.M., Bigaignon G. et al.: Serodiagnosis of Lyme borreliosis by Borrelia burgdorferi sensu stricto, B.garinii and B.afzelii Western Blot
(Immunoblot). J. Clin. Microbiol. 1996, 34, 1732.
10. Hauser U., Krahl H., Peters H. et al.: Impact of strain
heterogeneity on Lyme disease serology in Europe:
comparison of Enzyme-Linked Immunosorbent Assays using different species of Borrelia burgdorferi
snesu lato. J. Clin. Microbiol. 1998, 36, 427.
11. Aberer E.: Lyme borreliosis-an update. J. Dtsch.
Dermatol. Ges. 2007, 5, 406.
12. Hunfeld K.P., Fingerle V., Stanek G. et al.: European multicenter study for evaluation of a new enzyme immunoassay for detection of IgG antibodies
against Borrelia burgdorferi sensu lato. 10th Int. conference on Lyme borreliosis and other tick-borne diseases, September 11-15, 2005.
G. Biesiada i wsp.