Ilościowe oznaczanie aminokwasów metodą ninhydrynową

ĆWICZENIE nr 3
Metody rozdziału i ilościowego oznaczania aminokwasów i białek
Elektroforeza białek w żelu agarozowym
Elektroforeza jest metodą rozdziału w polu elektryczny cząsteczek obdarzonych ładunkiem.
Prędkość poruszania się w polu elektrycznym zależy od różnicy potencjałów oraz ładunku, masy
i kształtu cząsteczki.
Odczynniki
1. Bufor do elektroforezy: 1 bufor TGS (Tris-Glicyna-SDS).
2. 5 roztwór do nanoszenia białek.
2. Utrwalacz: 10% kwas sulfosalicylowy w 40% etanolu.
3. 20% etanol.
4. Wybarwiacz: roztwór koloidowy błękitu Coomasie, przygotowany bezpośrednio przed użyciem:
(A) 2% kwas fosforowy, 6% siarczan amonowy, (B) 5% roztwór wodny błękitu Coomasie, (C)
96% etanol.
Wykonanie:
Przygotowanie żelu:
Naważkę 2 g agarozy przenieść do kolby stożkowej o objętości 100 ml, dodać 50 ml 1 buforu
i rozpuścić agarozę ogrzewając do wrzenia w kuchence mikrofalowej, a następnie ochłodzić do
temperatury 50C. Do komory z umocowanym grzebieniem wlać agarozę. Gdy agarowa przejdzie
z zolu w żel (po ok. 10-15 min.) umieścić komorę w aparacie do elektroforezy i napełnić go
1 buforem do poziomu wyższego o ok. 5 mm niż poziom żelu, a następnie ostrożnie wyjąć
grzebień. Powstałe otwory (studzienki) służą do nakładania próbek.
Przygotowanie próbek:
Zmieszać 15 l próbki z 3 l roztworu do nanoszenia białek.
Nakładanie próbek na żel:
Nałożyć po 18 l próbki do poszczególnych studzienek. Podłączyć aparat do zasilacza.
Uwaga! Kabel czerwony należy podłączyć do bieguna dodatniego (+), kabel czarny do bieguna
ujemnego (-).
Elektroforezę prowadzić przy napięciu 5-10V na cm długości żelu (120V). Gdy barwnik przemieści
się na odległość ok. 2/3 żelu od miejsca startu elektroforezy, wyłączyć zasilacz i wyjąć żel
z aparatu.
1
Barwienie żelu:
1. Utrwalanie żelu w roztworze utrwalacza przez 10 min.
2. Płukanie żelu w 20% etanolu przez 5 min. (2-krotnie).
3. Do kolbki stożkowej o objętości 200 ml dodać 49 ml roztworu A, 1 ml roztworu B i 12,5 ml 96%
etanolu (roztwór C). Zamknąć korkiem gumowym i energicznie wytrząsać w celu wytworzenia
roztworu koloidowego. Przygotowany roztwór wylać na żel agarozowy i delikatnie mieszać
przez ok. 30 min.
4. Nadmiar barwnika wymyć przepłukując 3-krotnie żel wodą destylowaną.
Ilościowe oznaczanie białek metodą Lowry’ego
Zasada metody
Metoda ilościowego oznaczania białka wg Lowry’ego i wsp. wykorzystuje czułą reakcję, jaką dają
wiązania peptydowe i aminokwasy aromatyczne z odczynnikiem Folina-Ciocalteu’a. Jest
kombinacją reakcji biuretowej oraz reakcji między resztami aminokwasów aromatycznych a tym
odczynnikiem, w wyniku której powstają barwne (niebieskie) produkty. Reakcja przebiega
w 2 etapach. Pierwszy polega na przyłączeniu jonów miedzi do wiązań peptydowych w łańcuchu
peptydowych, co w konsekwencji prowadzi do reakcji biuretowej. W drugim etapie następuje
reakcja redukcji kwasu fosforowolframowego i fosforomolibdenowego do odpowiednich tlenków
przez miedź związaną z białkiem oraz zachodzi reakcja między odczynnikiem fenolowym
a tyrozyną i tryptofanem. Obie reakcje zachodzą w środowisku zasadowym. Absorbancję
powstałego zabarwienia odczytuje się przy  = 750 nm.
Metoda Lowry’ego pozwala na oznaczenie białka już w stężeniu 1 g/ml i należy do
najpowszechniej stosowanych metod w analizie białek. Swoistość metody jest ograniczona. Wolna
tyrozyna i tryptofan, fenole i nitrofenole oraz Tris (trihydroksymetyloaminometan), kwas moczowy
i p-aminosalicylowy, pochodne puryn i pirymidyn dają pozytywną reakcję z odczynnikiem FolinaCiocalteu, zwiększając natężenie barwy roztworu. Z kolei na obniżenie wyników wpływają
znajdujące się w roztworze siarczany ZnSO4 i (NH4)SO4 oraz kwasy CH3COOH, a także takie
związki jak aceton, etanol i sacharoza.
Odczynniki
1. odczynnik A (2% r-r Na2CO3 w 0,1 M NaOH)
2. odczynnik B1 (1% r-r CuSO4)
odczynnik B2 (2% r-r winianu sodowo-potasowego)
3. odczynnik C (zmieszać r-r B1 i B2 w ilościach po 0,5 ml oraz 50 ml r-ru A)
4. odczynnik Folina-Ciocalteu’a
5. wzorcowy r-r białka o stężeniu 100 g/ml
2
Wykonanie
Do 1 ml roztworu badanego białka, roztworu wzorcowego białka (roztwór albuminy o stężeniu
100 g/ml w 0,9% NaCl) oraz NaCl dodać po 5 ml odczynnika C i wymieszać Pozostawić
w temperaturze pokojowej na 10 minut. Następnie dodać 0,5 ml odczynnika Folina-Ciocalteu
i energicznie wymieszać. Po upływie 30 minut odczytać wartość absorbancji próby badanej
i wzorcowej wobec próby odczynnikowej przy długości fali  = 750nm.
Próba odczynnikowa
Próba wzorcowa
Próba badana
0,9% NaCl
1 ml
wzorcowy r-r białka
1 ml
badany r-r białka
1 ml
odczynnik C
5 ml
5 ml
5 ml
dokładnie wymieszać zawartość probówek, pozostawić w temp. pokojowej na 10 minut
odczynnik F-C
0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml
dokładnie wymieszać zawartość probówek, pozostawić w temp. pokojowej na 30 minut
Stężenie białka obliczyć korzystając z zależności:
Zalecana literatura:
1. Ćwiczenia z biochemii pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz, str: 232-259
2. Wybrane zagadnienia z biochemii ogólnej z ćwiczeniami. Kędryna T., Gałka-Walczak M., Ostrowska B.,
str. 47-61.
Zagadnienia wymagane do zaliczenia części teoretycznej ćwiczenia:
1. Budowa białka
a) Wiązanie peptydowe – struktura, powstawanie i właściwości.
b) Poziomy organizacji łańcucha polipeptydowego w białkach.
2. Właściwości fizykochemiczne białka
3. Denaturacja i renaturacja.
4. Metody ilościowego oznaczania białek
a) Ilościowe oznaczanie białek metodą Lowry’ego
b) Metody spektrofotometryczne i immunometryczne
5. Metody rozdziału białek
a) Wysalanie
b) Chromatografia
c) Sączenie molekularne
d) Elektroforeza
3