Nr 1 17 BADANIE OPORNOŚCI BAKTERII WYIZOLOWANYCH Z

Nr 1
Opornoœæ bakterii na œrodki dezynfekcyjne
ROCZN. PZH 2006, 57, NR 1, 17-21
17
AGNIESZKA WISZNIEWSKA, JOANNA SZTEYN
BADANIE OPORNOŒCI BAKTERII WYIZOLOWANYCH Z URZ¥DZEÑ
UDOJOWYCH NA ŒRODKI DEZYNFEKCYJNE
RESISTANCE OF BACTERIA ISOLATED FROM MILKING EQUIPEMENT
TO DISINFECTANTS
Katedra Weterynaryjnej Ochrony Zdrowia Publicznego
Wydzia³ Medycyny Weterynaryjnej
Uniwersytet Warmiñsko-Mazurski
10-718 Olsztyn, ul Oczapowskiego 14
Kierownik: prof. dr hab. J. Uradziñski
W pracy przeœledzono wra¿liwoœæ bakterii termo- i psychrofilnych wyizolowanych z urz¹dzeñ udojowych w gospodarstwach produkuj¹cych mleko na œrodki dezynfekcyjne. Badania wykaza³y wystêpowanie szczepów opornych na substancje czynne zawarte w preparatach u¿ytych w doœwiadczeniu.
S³owa kluczowe: œrodki dezynfekcyjne, bakterie termofilne, bakterie psychjrofilne, wra¿liwoœæ bakterii
Key words: disinfectants, thermotrophic bacteria, psychrotrophic bacteria, bacteria sensitivity
WSTÊP
O jakoœci zdrowotnej ¿ywnoœci, w tym tak¿e mleka, decyduje wiele czynników. Jednym
z nich jest jakoœæ mikrobiologiczna. Zachowanie re¿imu sanitarnego w gospodarstwie produkuj¹cym mleko, systematycznie i w³aœciwie przeprowadzany proces mycia i dezynfekcji
urz¹dzeñ udojowych zabezpiecza wymiê krowy przed zaka¿eniem bakteryjnym, przed³u¿a
sprawnoœæ sprzêtu mechanicznego oraz ma zasadniczy wp³yw na jakoœæ pozyskiwanego
surowca. Czynnoœæ ta powinna byæ podstawowym obowi¹zkiem dojarza. Aby uzyskaæ optymalny efekt, zabiegi higieniczne powinny byæ przeprowadzane w odpowiedniej kolejnoœci
i z u¿yciem przeznaczonych do tego celu œrodków myj¹co-dezynfekcyjnych [7, 15]. Wybieraj¹c œrodek odka¿aj¹cy nale¿y zwróciæ uwagê na substancjê czynn¹, która powinna
eliminowaæ z urz¹dzeñ bakterie patogenne, mog¹ce spowodowaæ zagro¿enie dla zdrowia
ludzi, a tak¿e maksymalnie redukowaæ liczbê drobnoustrojów saprofitycznych tak, aby sprzêt
doj¹cy nie stanowi³ Ÿród³a kontaminacji mleka. Nieprawid³owo dobrany lub niew³aœciwie
stosowany œrodek mo¿e powodowaæ dwojakiego rodzaju zagro¿enia: 1) pozosta³oœci substancji chemicznych u¿ywanych w gospodarstwie [9, 16] oraz 2) pojawianie siê opornych
szczepów bakterii, w tym tak¿e drobnoustrojów patogennych [6].
18
A. Wiszniewska, J. Szteyn
Nr 1
Dla przetwórstwa mleka, a zw³aszcza procesów termicznych, które maj¹ gwarantowaæ
wyprodukowanie bezpiecznego pod wzglêdem mikrobiologicznym wyrobu, istotny jest sk³ad
gatunkowy mikroflory mleka. Wymóg ch³odzenia mleka i powszechne stosowanie ch³odziarek spowodowa³o zachwianie równowagi miêdzy drobnoustrojami termofilnymi a psychrofilnymi obecnymi w mleku surowym, które cechuj¹ siê ró¿nym wp³ywem na jakoœæ
uzyskiwanego produktu mlecznego.
Celem przeprowadzonych badañ by³o okreœlenie wra¿liwoœci szczepów bakterii psychrofilnych i termofilnych wyizolowanych z urz¹dzeñ udojowych na powszechnie stosowane œrodki dezynfekcyjne: Chlorinol, Atos i L-Naftol.
MATERIA£ I METODY
Przedmiotem badañ by³y szczepy bakteryjne wyizolowane z urz¹dzeñ udojowych w gospodarstwach indywidualnych. Trzykrotnie w odstêpach 1 miesi¹ca, pobierano wacikami wymazy ze zbiorników na mleko surowe i kubków strzykowych dojarek. Po przewiezieniu do laboratorium waciki
umieszczano w p³ynie do rozcieñczeñ (1% woda peptonowa) i starannie wytrz¹sano. Tak przygotowane próbki posiewano na 2 p³ytki z pod³o¿em do oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów w celu
izolacji bakterii termofilnych i psychrofilnych. Inkubacjê przeprowadzano zgodnie z PN-93 A-86
034/06.
W wyniku przeprowadzonych badañ wyizolowano ogó³em 68 szczepów bakterii: 49 szczepów
psychrofilnych i 19 szczepów termofilnych, które nastêpnie przechowywano na skosach agarowych.
Wyizolowane szczepy bakteryjnie poddane zosta³y nastêpnie badaniu na opornoœæ wobec œrodków dezynfekcyjnych stosowanych w gospodarstwach produkuj¹cych mleko: Chlorinol (Inco-veritas – Polska, substancja czynna – podchloryn sodu, metakrzemian sodu, polifosforan sodu), Atos
(Compex – Polska, substancja czynna – podchloryn sodu) oraz L-Naftol (substancja czynna –
l-naftol). W tym celu, ze skosu agarowego pobierano ez¹ niewielk¹ iloœæ materia³u i posiewano na
bulion od¿ywczy. Probówkê nastêpnie inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 h. Po inkubacji
0,1 ml hodowli przeniesiono do probówek zawieraj¹cych po 5 ml przygotowanego roztworu roboczego œrodka dezynfekcyjnego. Odpowiednie stê¿enie œrodka odka¿aj¹cego uzyskano stosuj¹c siê
do zaleceñ producenta. Nastêpnie roztwór rozlewany by³ z zachowaniem warunków ja³owych do
probówek (po 5 ml). Roztwory przygotowywane by³y bezpoœrednio przed badaniem. Próbkê kontroln¹ stanowi³a zawiesina hodowli bulionowej badanego szczepu bakterii w 5 ml ja³owego roztworu soli fizjologicznej.
Inoculowane próbki z roztworami roboczymi badanych œrodków dezynfekcyjnych oraz próbki
kontrolne inkubowano w ³aŸni wodnej w temperaturze 20°C przez 20 min, a nastêpnie posiewano
1ml zawiesiny na p³ytki Petriego metod¹ zalewow¹ wykorzystuj¹c jako pod³o¿e od¿ywcze agar mleczny. P³ytki inkubowano w cieplarce w temperaturze 37°C przez 24 h. Po inkubacji sprawdzano wzrost
bakterii na p³ytce. Badanie wykonano trzykrotnie. Obecnoœæ kolonii bakteryjnych na p³ytkach we
wszystkich trzech powtórzeniach badania uznawano za wynik dodatni opornoœci danego szczepu na
badany œrodek dezynfekcyjny (przy dodatniej próbie kontrolnej), szczepy wykazuj¹ce brak wzrostu
w jednym b¹dŸ dwóch powtórzeniach badania uwa¿ane by³y za wra¿liwe.
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Wyniki badañ wykaza³y, ¿e wiêkszoœæ wyizolowanych bakterii psychrofilnych cechowa³a wra¿liwoœæ na badane preparaty dezynfekcyjne (tab. I). Najwiêksz¹ skutecznoœci¹ wykaza³ siê L-Naftol, na który wra¿liwych by³o 94% badanych psychrotrofów. Skutecznoœæ preparatu Atos i Chlorinol to odpowiednio 90% i 84%. Bakterie termofilne charakteryzowa³y
Opornoœæ bakterii na œrodki dezynfekcyjne
Nr 1
19
siê wiêksz¹ opornoœci¹ na badane preparaty (tab. II). W przypadku tych drobnoustrojów
najwy¿sz¹ skutecznoœci¹ wykaza³ siê Chlorinol- 47% wra¿liwych szczepów, nastêpnie
L-Naftol – 42% i Atos – 25% wra¿liwych szczepów bakterii termofilnych.
Ta b e l a I .
Wra¿liwoœæ szczepów bakterii psychrofilnych na robocze stê¿enia œrodków odka¿aj¹cych
Sensitivity of the psychotropic bacteria on the concentration of disinfectants
URGNLGH]\QIHNF\MQH
3V\FKURILOQHV]F]HS\
EDNWHU\MQH
&KORULQRO
OLF]ED
V]F]HSyZ
$WRV
/1DIWRO
OLF]ED
V]F]HSyZ
OLF]ED
V]F]HSyZ
:UD OLZH±EUDNZ]URVWX
ZHZV]\VWNLFKSRZWyU]H
QLDFK
'DM FHZ]URVWZOXE
SRZWyU]HQLDFK
2SRUQH±Z]URVWZH
ZV]\VWNLFKSRZWyU]HQLDFK
Ta b e l a I I .
Wra¿liwoœæ szczepów bakterii termofilnych na robocze stê¿enia œrodków odka¿aj¹cych
Sensitivity of the thermotrophic bacteria on the concentration of disinfectants
URGNLGH]\QIHNF\MQH
7HUPRILOQHV]F]HS\
EDNWHU\MQH
&KORULQRO
OLF]ED
V]F]HSyZ
$WRV
OLF]ED
V]F]HSyZ
/1DIWRO
OLF]ED
V]F]HSyZ
:UD OLZH±EUDNZ]URVWX
ZHZV]\VWNLFKSRZWyU]H
QLDFK
'DM FHZ]URVWZOXE
SRZWyU]HQLDFK
2SRUQH±Z]URVWZH
ZV]\VWNLFKSRZWyU]HQLDFK
Badanie szczepów bakterii psychro- i termofilnych wyizolowanych z powierzchni urz¹dzeñ kontaktuj¹cych siê z surowcem mlecznym w gospodarstwach produkcyjnych wykaza³y, ¿e znajduj¹ siê na nich szczepy bakterii oporne na powszechnie u¿ywane œrodki odka¿aj¹ce. Wyniki koresponduj¹ z pracami wykonywanymi przez innych badaczy [1, 3, 8, 12].
Prze¿ywalnoœæ bakterii w procesie mycia i dezynfekcji mo¿e byæ wyt³umaczona w ró¿ny
sposób. Drobnoustroje mog¹ tworzyæ na mytych powierzchniach biofilm, który zabezpiecza czêœæ komórek przed dostêpem substancji chemicznej [4, 5]. Czêœæ drobnoustrojów
wykazuje natomiast dziedziczn¹ b¹dŸ nabyt¹ opornoœæ na stosowane œrodki odka¿aj¹ce.
Dziedziczna (pierwotna) opornoœæ jest cech¹ naturaln¹ i charakterystyczn¹ dla wiêkszoœci
20
A. Wiszniewska, J. Szteyn
Nr 1
szczepów danego gatunku. Jest ona zwi¹zana z genem chromosomalnym. Opornoœæ nabyta
zwykle jest wynikiem mutacji genów na chromosomie lub nabyciem przez wra¿liwy wczeœniej drobnoustrój genów opornoœci [14].
W badaniach w³asnych zauwa¿ono ró¿nicê we wra¿liwoœci bakterii psychrofilnych i termofilnych na te same substancje chemiczne. Zaskakuj¹cy jest fakt, ¿e o ile bakterie psychrofilne wykazywa³y zbli¿on¹ wra¿liwoœæ zarówno na Chlorinol jak i na Atos (preparaty
zawieraj¹ce t¹ sam¹ substancjê czynn¹ – podchloryn sodu), to bakterie termofilne by³y
znacz¹co mniej wra¿liwe na drugi preparat.
Dzia³anie bakteriobójcze preparatu, przed wprowadzeniem na rynek, okreœla siê na organizmach testowych (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococus aureus
i Enteroccocus hirae), których wra¿liwoœæ na substancje czynne najczêœciej jest ró¿na od
wra¿liwoœci szczepów „dzikich”, wystêpuj¹cych w œrodowisku. Dlatego te¿, aby zapewniæ
wysok¹ jakoœæ mikrobiologiczn¹ surowca, powinny byæ wykonywane badania okreœlaj¹ce
skutecznoœæ dzia³ania œrodków dezynfekcyjnych w gospodarstwie. Sk³ad flory bakteryjnej
i jej wra¿liwoœci na stosowane œrodki do dezynfekcji urz¹dzeñ udojowych mo¿e wp³yn¹æ
na jakoœæ skupowanego mleka i uzyskiwanych z niego przetworów, tym bardziej, ¿e obecnoœæ zarówno jednych jak i drugich szczepów drobnoustrojów niesie za sob¹ inne zagro¿enia dla jakoœci produktów mlecznych. G³ównym efektem obecnoœci w mleku psychrotrofów jest rozk³ad bia³ek i je³czenie t³uszczów przez ciep³osta³e enzymy lipo- i proteolityczne
wytwarzane przez te bakterie, co skutkuje obni¿eniem jakoœci produktu i krótsz¹ jego trwa³oœci¹. Bakterie termofilne poprzez swoj¹ opornoœæ na temperaturê, mog¹ przetrwaæ proces
pasteryzacji mleka i tym samym wp³ywaæ na obni¿enie jakoœci mikrobiologicznej uzyskanego produktu spo¿ywczego [2, 10, 11]. Nie bez znaczenia jest równie¿ mo¿liwoœæ uzyskania opornoœci na stosowane substancje dezynfekcyjne przez drobnoustroje patogenne, takie
jak Listeria monocytogenes czy Escherichia coli [6].
Wystêpowanie szczepów opornych na coraz to nowe œrodki myj¹ce i dezynfekuj¹ce jest
wyzwaniem dla producentów i przetwórców ¿ywnoœci na ca³ym œwiecie
WNIOSKI
1. Zdolnoœæ nabywania przez bakterie opornoœci na œrodki dezynfekuj¹ce zmusza nas do
tworzenia coraz to nowych i doskonalszych preparatów, a tak¿e do rozwa¿nego ich stosowania. Nieumiejêtne stosowanie substancji przeciwbakteryjnych przyspiesza ten proces.
2. Badane grupy drobnoustrojów termofilnych i psychrofilnych cechowa³y siê ró¿n¹
wra¿liwoœci¹ na stosowane w praktyce substancje dezynfekcyjne.
3. Procent szczepów termofilnych wykazuj¹cych opornoœæ na stosowane œrodki dezynfekcyjne by³ znacznie wy¿szy ( od 43 do 27) ni¿ bakterii psychrofilnych (od 6 do 16).
Opornoœæ bakterii na œrodki dezynfekcyjne
Nr 1
21
A. Wiszniewska, J. Szteyn
RESISTANCE OF BACTERIA ISOLATED FROM MILKING EQUIPEMENT
TO DISINFECTANTS
Summary
The purpose of the study was a comparison of the sensitivity to three disinfectants of psychotropic and termotropic bacteria isolated from milking equipment. The study shows that psychotropic
bacteria was more resistant on disinfectants used in experiments than termotropic. Bacteria’s capability to acquire a resistant to disinfectants cause to search the new and more advance substances.
Incorrect use of the antibacterial chemicals could accelerate this process.
PISMIENNICTWO
1. Bore E., Iangsrud S.: Characterization of micro-organisms isolated from dairy industry after
cleaning and fogging disinfection with alkyl amine and peracetic acid. J. Appl. Microbiol. 2005,
98, 96-105.
2. Burbianka M, Pliszka A., Murzyñska H.: Mikrobiologia ¿ywnoœci. Pañstwowy Zak³ad Wydawnictw Lekarskich, Warszawa 1983.
3. Costa E.O., Gardna C.R., Pires M.F., Coutinho S.D., Castilho W., Teixeira C.M.: Sourvey of
bovine mycotic mastitis in dairy heros In the state of Sao-Paulo, Brazil. Mycopathologia 1993,
124, 13-17.
4. Evans D.J., Allison D.G., Bron M.R.W. and Gilbert P.: Effect of growth-rate on resistance of
Gram-negative biofilms to cetrimide. J. Antymicrobial Chemotherapy 1990, 26, 473-478.
5. Gilbert P., Allison D.G. and McBain A.J.: Biofilms in vitro and in vivo: dp singular mechanisms
imply cross-resistance? J. Appl. Microbiol. 2002, 92, 98S-110S.
6. Holah J.T., Taylor J.H., Dawson D.J., Hall K.E.: Biocide use In the ford industry and the disinfecant resistance of persistent strains of Listeria monocytogenes and Escherichia coli. J. Appl.
Microbiol. 2002, 92 (111S-120S).
7. Kot M. 1999. Konserwacja urz¹dzeñ udojowych. Ogólnopolski Informator Mleczarski 35, nr 10
(18).
8. Krakowski H., Tietze M., Majewski T., Ró¿añski P.: Survey of yeast mastitis in dairy heroes of
small-type farms in the Lublin Region, Poland. Mycopathologia 2001, 150 (5-7).
9. Miko³ajczyk A., Szteyn J.: Problemy mycia i dezynfekcji urz¹dzeñ udojowych. Przegl. Hod. 1997,
12 (9-11).
10. Molska I.: Zarys mikrobiologii mleczarskiej. Pañstwowe Wydawnictwa Rolnicze i Leœne. Warszawa 1988.
11. Müller G.: Podstawy mikrobiologii ¿ywnoœci. Wydawnictwa Naukowo-Techniczne. Warszawa
1983.
12. Petersen K.M., Westall S., Jespersen L.: Microbial succession of Debaryomyces hansenii strains
during the production of Danish surfaced-ripened cheeses. J. Dairy Science 2002, 85 (478-486).
13. PN – 93 A – 86 034/06.
14. Sêktas M.: Bariery molekularne w wymianie genów pomiêdzy bakteriami. Post. Mikrobiol. 2004,
43, 4 (345-359).
15. Twardoñ J., Dejneka G.J., Dziêcio³ M.: Urz¹dzenia udojowe jako potencjalne Ÿród³o zaka¿eñ
wymienia. ¯ycie Wet. 2001, 76, Nr 9 (480-483).
16. Wieczorek J., Smoczyñski S.: Czêstoœæ wystêpowania substancji hamuj¹cych w mleku z rejonu
Olsztyna oraz czu³oœæ testów mikrobiologicznych na obecnoœæ detergentów. Medycyna Wet. 1992,
48 (129-131).
Otrzymano: 2005.07.04