cwiczenia nr 3

Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
Ćwiczenie 3
Część teoretyczna:
I. METODA BARWIENIA ZŁOŻONEGO – BARWIENIE BAKTERII METODĄ GRAMA.
Jest to jedna z wielu metod różnicowania bakterii, ma podstawowe znaczenie taksonomiczne i
diagnostyczne. Obecnie jest powszechnie stosowana na całym świecie i pozwala wykryć naturalny podział
bakterii na dwie zasadnicze grupy: gram-dodatnie i -ujemne, które powstały w toku przemian ewolucyjnych,
jakim podlegały pierwotne grupy bakterii. Metodę wprowadził Gram w 1884 roku, jako metodę
różnicującego barwienia bakterii w tkankach.
W metodzie tej używamy następujących odczynników:
- fiolet krystaliczny (barwnik podstawowy),
- płyn Lugola (zaprawa Beitsa, utrwalacz),
- 95% alkohol etylowy (odbarwiasz),
- safranina lub fuksyna (barwnik kontrastowy).
Bakterie gram-dodatnie zatrzymują barwnik podstawowy po utrwaleniu go płynem Lugola i nie odbarwiają
się pod wpływem alkoholu. Barwią się w metodzie Grama na kolor fioletowo-niebieski (laseczki, ziarniaki
bez Neisseriaceae i Veiloneillaceae).
Bakterie gram-ujemne nie zatrzymują kompleksu fiolet krystaliczny i płyn Lugola, odbarwiają się alkoholem
i przyjmują barwnik kontrastowy (safraninę lub fuksynę). Barwią się na kolor czerwono-różowy (pałeczki,
ziarniaki – Neisseriaceae i Veiloneillaceae).
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
Najbardziej prawdopodobna hipoteza tłumacząca barwienie się bakterii metodą Grama, głosi, że etanol
powoduje w komórkach bakterii gram+ uszczelnienie ściany komórkowej, co przejawia się spadkiem
wypływu z komórki, różnych związków. Ściana bakterii gram+ jest grubsza, zawiera więcej peptydoglikanu
(mureiny), a mniej substancji lipidowych. U bakterii gram- jest odwrotnie. Etanol rozpuszcza w komórkach
bakterii gram- lipidy, co powoduje dezorganizację struktury ściany komórkowej i uniemożliwia
zatrzymywanie barwnego kompleksu przez komórkę.
TECHNIKA BARWIENIA METODĄ GRAMA
1. Na wysuszony i utrwalony preparat działamy:
2. Fioletem krystalicznym przez 1 minutę.
3. Spłukujemy wodą.
4. Płynem Lugola przez 1 minutę.
5. Spłukujemy wodą.
6. Preparat odbarwiamy alkoholem do momentu spływania bezbarwnych kropli alkoholu przez 15-20 sek.
7. Przerywamy działanie etanolu wodą.
8. Preparat dobarwiamy safraniną przez 45 sek.
9. Spłukujemy wodą.
10. Suszymy i oglądamy pod immersją.
II. PODZIAŁ MIKROORGANIZMÓW ZE WZGLĘDU NA OPTYMALNĄ TEMPERATURĘ
WZROSTU
- psychrofile – minimum: -23 do 0 0C, optimum – ok. 15 0C, maksimum – ok. 200C,
- mezofile – min. 10-25 C, opt. 20-37 C, max. 35-50 C,
- termofile – min. 25-45 C, opt. 45-65 C, max. 60-90 C.
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
Część praktyczna:
Wszystkie doświadczenia wykonywać w warunkach jałowych!
1. Technika wykonywania preparatu bakteriologicznego (rozmaz) i barwienie proste pozytywowe
a) preparaty wykonać z materiału mikrobiologicznego, który wyrósł na skosach agarowych
b) w oparciu o instrukcję wcześniej wykonać rozmaz bakteriologiczny
c) po utrwaleniu, preparat barwić fioletem krystalicznym przez 1 minutę, barwnik zlać, przepłukać wodą,
wysuszyć i oglądać pod immersją (instrukcja wyżej)
d) wykonać rysunek spod mikroskopu i opisać go (sprawozdanie 1)
2. Barwienie drobnoustrojów metodą Grama (barwienie złożone pozytywowe)
a) preparaty wykonać z materiału mikrobiologicznego, który wyrósł na skosach agarowych
b) w oparciu o instrukcję z ubiegło tygodniowych ćwiczeń wykonać rozmaz bakteriologiczny
c) po utrwaleniu, na podstawie protokołu do barwienia metodą Grama barwić preparat
d) oglądać pod immersją
e) wykonać rysunek spod mikroskopu i opisać go (sprawozdanie 1)
3. Posiew redukcyjny (i wyprowadzenie czystej kultury drobnoustrojów)
a) z hodowli Bacillus z gleby (hodowla płynna) wykonać na szalce Petriego z agarem odżywczym posiew
redukcyjny zgodnie z prezentacją prowadzącego.