pobierz

Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 3, str. 325–330
PRACA ORYGINALNA – Original Article
TOMASZ DZIECIĄTKOWSKI1,2, MACIEJ PRZYBYLSKI1,2,
TIGRAN TOROSIAN3, AGATA SULOWSKA2, MIROSŁAW ŁUCZAK1,2
ZakaŜenia cytomegalowirusem (HHV-5, CMV) u biorców
allogenicznych przeszczepów komórek krwiotwórczych
w Klinice Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych
Akademii Medycznej w Warszawie w latach 2004–2006
Cytomegalovirus (HHV-5, CMV) infections in allogeneic hematopoietic stem cells recipients in Department of Hematology, Oncology and Internal Medicine, Medical University of Warsaw in years
2004–2006
1
Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Akademia Medyczna w Warszawie
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Mirosław Łuczak
2
Zakład Mikrobiologii, Samodzielny Publiczny Centralny Szpital Kliniczny
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Mirosław Łuczak
3
Klinika Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych, Akademia Medyczna w Warszawie
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Wiesław Wiktor Jędrzejczak
STRESZCZENIE
ZakaŜenia ludzkim cytomegalowirusem są powszechne wśród osób z zaburzeniami odporności,
zwłaszcza u biorców allogenicznych przeszczepów komórek krwiotwórczych. Wykrywanie wirusowego DNA jest podstawowym narzędziem diagnostycznym w wykrywaniu chorób o etiologii HHV-5. Zbadano grupę 52 pacjentów poddanych allogenicznym przeszczepom komórek
krwiotwórczych, którzy mieli dodatni poziom przeciwciał anty-HHV-5 lub mieli dodatnich dawców. DNA cytomegalowirusa wykryto u 7 z badanych osób (13,5%). Wczesne rozpoznanie zakaŜenia za pomocą metod biologii molekularnej jest podstawą do rozpoczęcia skutecznego leczenia przeciwwirusowego.
SŁOWA KLUCZOWE: Ludzki herpeswirus typu 5 – Immunosupresja – Allogeniczny przeszczep
komórek krwiotwórczych
SUMMARY
Human herpesvirus type 5 (HHV-5, CMV) has been a major cause of morbidity and mortality after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Detection of its DNA in clinical
specimens is considered a cornerstone in the diagnosis of cytomegalovirus disease. We studied
52 patients after allogeneic HSCT, who were HHV-5 seropositive or had HHV-5 seropositive
donors. Viral DNA was detected in 7 of the 52 patients (13,5%). Early detection of cytomegalovirus infection with molecular biology methods is favorable for the efficacy of antiviral chemotherapy.
KEY WORDS: Human herpesvirus 5 – Immunosuppression – Allogeneic hematopoietic stem cells
transplantation
326 T. DZIECIĄTKOWSKI
WSTĘP
Ludzki herpeswirus typu 5 (Human Herpesvirus 5; HHV-5 – znany powszechnie
jako CMV) jest przedstawicielem podrodziny β-herpesvirinae o niezwykle szerokim
rozpowszechnieniu w populacji (1). Stwierdzono, Ŝe ponad 60% osób w państwach
rozwiniętych ma dodatni wynik przeciwciał anty-HHV-5 w klasie IgG, zaś w krajach
Trzeciego Świata poziom ten wzrasta do prawie 95% (2). Po często bezobjawowym
zakaŜeniu pierwotnym wirus ustala stan latencji w makrofagach oraz prawdopodobnie
w subpopulacji CD8+ limfocytów T i w komórkach gruczołów wydzielania wewnętrznego (1). Nasilenie objawów klinicznych wynikających z reaktywacji ludzkiego cytomegalowirusa uzaleŜnione jest od wieku i stanu ogólnego pacjenta, wydolności układu
odpornościowego oraz wieku, w którym pacjent przebył zakaŜenie pierwotne. Do najczęściej obserwowanych objawów zaliczane jest wirusowe zapalenie płuc, zespół mielosupresyjny, powikłania ze strony układu pokarmowego (3), nasilenie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD) (2). ZakaŜenie HHV-5 jest takŜe czynnikiem
ryzyka wtórnych zakaŜeń bakteryjnych i grzybiczych (4). Z tego teŜ powodu zakaŜenia
HHV-5 stanowią istotny problem wśród pacjentów z niedoborami immunologicznymi
(2).
Przeszczep allogenicznych komórek krwiotwórczych jest postępowaniem z wyboru
w leczeniu wielu chorób rozrostowych układu krwiotwórczego, chorób limfoproliferacyjnych, zespołów niewydolności szpiku i wrodzonych zespołów niedoboru odporności (5, 6) w przypadkach braku zgodnego dawcy spokrewnionego. NajpowaŜniejszym
powikłaniem zabiegów przeszczepiania komórek krwiotwórczych pochodzących ze
szpiku, zwłaszcza od dawców niespokrewnionych, są zakaŜenia wirusowe i grzybicze
(7). UwaŜa się natomiast, Ŝe transplantacja komórek krwiotwórczych pochodzących
z krwi pępowinowej związana jest z mniejszym ryzykiem zakaŜenia związanego
z przeniesieniem wirusa drogą wszczepienną (zwłaszcza cytomegalowirusa i wirusa
Epsteina-Barr) (8).
CEL PRACY
Celem pracy było określenie częstości występowania DNA ludzkiego cytomegalowirusa u pacjentów poddanych w latach 2004-2006 allogenicznym przeszczepom
komórek krwiotwórczych wykonanych w Klinice Hematologii, Onkologii i Chorób
Wewnętrznych Akademii Medycznej w Warszawie.
MATERIAŁY I METODY
Przed przeprowadzeniem transplantacji w surowicy 52 pacjentów (33 męŜczyzn
i 19 kobiet) i dawców oznaczano metodami serologicznymi poziom przeciwciał antyHHV-5 w klasach IgM i IgG. 34 osoby były biorcami przeszczepu od dawcy spokrewnionego, 14 otrzymało przeszczep od dawcy niespokrewnionego, zaś 4 poddano transplantacji komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej.
ZakaŜenia cytomegalowirusem (HHV-5, CMV)
327
W okresie poprzeszczepowym do badań metodami biologii molekularnej w kierunku DNA cytomegalowirusa uŜyto 770 próbek krwi pełnej. Krew pełną do badań
pobierano z uŜyciem wersenianiu potasu jako antykoagulantu, przez okres 1–18 miesięcy od przeszczepu w odstępach 7–10 dni, poczynając od drugiego dnia po transplantacji.
Izolacji całkowitego DNA dokonywano z 200 µl krwi pełnej przy uŜyciu zestawu
kolumienkowego DNA Mini Kit (Qiagen®), zgodnie z procedurą dostarczoną przez
producenta.
Do amplifikacji sekwencji cytomegalowirusa zastosowano reakcję PCR z uŜyciem
starterów swoistych dla regionu MIE HHV-5 (9) w końcowej objętości 50 µl. Mieszanina reakcyjna w buforze PCR (20 mM Tris-HCl, pH 8,4, 50 mM KCl) zawierała 0,3
µM obu starterów, 3 mM MgCl2, po 0,2 mM kaŜdego dNTP, 1,25 U polimerazy Taq
(Invitrogen®) oraz 10 µl wyizolowanego DNA. PCR obejmował 40 cykli składających
się z: denaturacji - 2 min, przyłączania starterów w temp. 65oC - 1,5 min i wydłuŜania
łańcuchów - 1 min. Amplifikacja kończyła się elongacją nici DNA trwającą 10 min
(9). Kontrolą dodatnią było DNA szczepu wzorcowego HHV-5 AD169, zaś ujemną
stanowiło całkowite DNA niezakaŜonej ustalonej linii komórkowej HFFF-2. Wizualizacji dokonywano poprzez rozdział elektroforetyczny w 1% Ŝelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny w świetle UV.
W próbkach dodatnich bądź wątpliwych oznaczano dodatkowo ilość kopii wirusa
techniką real-time PCR na aparacie LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics®), uŜywając
komercyjnego zestawu CMV LC PCR Kit firmy Artus® jako testu potwierdzenia.
Oznaczenia prowadzono w dwukrotnych powtórzeniach według zaleceń producenta.
OMÓWIENIE WYNIKÓW
W okresie przedprzeszczepowym nie stwierdzono przeciwciał w klasie IgM skierowanych przeciwko HHV-5 u Ŝadnego badanego dawcy ani pacjenta. Swoiste przeciwciała klasy IgG wykryto natomiast u 40 biorców (77%) i 39 dawców (75%). Podczas badań technikami biologii molekularnej obecność specyficznych sekwencji cytomegalowirusa stwierdzono ogółem u 7 pacjentów (13,5%), którzy poddani byli transplantacji komórek krwiotwórczych w latach 2004–2006 (Tabela 1). Dwóch spośród
nich było biorcami komórek krwiotwórczych pochodzących z krwi pępowinowej,
u dwóch innych przeszczep pochodził od dawcy spokrewnionego, a u trzech pozostałych od dawcy niespokrewnionego. Po porównaniu markerów serologicznych zakaŜenia HHV-5 dawcy i biorcy stwierdzono, iŜ w 6 przypadkach (86%) zakaŜenie miało
charakter reaktywacji endogennego wirusa ze stanu latencji pod wpływem zastosowanej terapii immunosupresyjnej. Etiologia pozostałego jednego przypadku, gdzie wykryto przeciwciała anty-HHV-5 zarówno u pacjenta i dawcy, nie była jasna i wymagałaby szczegółowej analizy sekwencji badanego wirusa.
Badany za pomocą metody real-time PCR poziom wiremii u większości osób wynosił zazwyczaj ok. 1200–1700 kopii/ml krwi, choć sporadycznie osiągał wartości
powyŜej 6500 (u 3 badanych) – Tabela 2. DNA HHV-5 stwierdzano najczęściej
328 T. DZIECIĄTKOWSKI
w pierwszym półroczu po transplantacji (od 45 do 130 dnia), rzadziej w okresie późniejszym. Wiremia na poziomie wykrywalnym technikami biologii molekularnej utrzymywała się przez okres 3–5 tygodni.
Tabela 1. Częstość występowania zakaŜeń HHV-5 u pacjentów po allogenicznych przeszczepach
komórek krwiotwórczych
Table 1. Incidence of HHV-5 infections in allogeneic hematopoietic stem cells recipients
Rok
2004
2005
2006
Razem
Ilość pacjentów
12
20
20
52
Liczba pacjentów dodatnich
1
3
3
7
Procent pacjentów dodatnich
8,3%
15%
15%
13,5%
Tabela 2. Poziom cytomegalowirusowego DNA stwierdzany u pacjentów po alogenicznych
przeszczepach komórek krwiotwórczych
Table 2. HHV-5 viral loads in patients after allogeneic HSCT
Rok
2004
2005
2006
Minimalna stwierdzona
ilość kopii HHV-5
(kopie/ml krwi)
400
400
600
Maksymalna stwierdzona
ilość kopii HHV-5
(kopie/ml krwi)
1300
15800
6700
Średnia ilość kopii
(kopie/ml krwi)
1300
1750
1450
Aktywne zakaŜenie wirusem cytomegalii u większości pacjentów przebiegało zazwyczaj bez wyraźnie zaznaczonych objawów klinicznych – tylko u dwóch osób
stwierdzono pełnoobjawową chorobę cytomegalowirusową rozpoznawaną według
kryteriów opisanych przez Ljungmana et al. (10), przebiegającą z zapaleniem płuc
o prawdopodobnej etiologii HHV-5, zaś u jednej z nich nastąpiło dodatkowo zaostrzenie choroby przeszczep przeciw gospodarzowi (GvHD). U jednego z pacjentów wykryto jednocześnie w badaniu PCR sekwencje charakterystyczne dla wirusa EpsteinaBarr, a w badaniu retrospektywnym u innej osoby współistniejące krótkotrwałe zakaŜenie ludzkim herpeswirusem typu 6 (HHV-6).
DYSKUSJA
ZakaŜenia herpeswirusem typu 5 pozostają jedną z głównych przyczyn zgonów
u pacjentów z immunosupresją (11). Ryzyko wystąpienia pełnoobjawowej choroby
cytomegalowirusowej zaleŜne jest wówczas od statusu immunologicznego dawcy
i biorcy, rodzaju przeszczepu oraz typu zastosowanej immunosupresji. U biorców allogenicznych przeszczepów komórek krwiotwórczych wynosi ono od 15 do 80% (12).
Zobserwowana wśród pacjentów Kliniki Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych Akademii Medycznej w Warszawie częstotliwość wykrywania wirusowego DNA
naleŜy więc do wyjątkowo niskich (Tabela 1).
ZakaŜenia cytomegalowirusem (HHV-5, CMV)
329
Częstotliwość ta ma prawdopodobny związek z rutynowym uŜyciem w diagnostyce poprzeszczepowej czułych metod biologii molekularnej, a zwłaszcza real-time PCR.
Czułość testów real-time PCR gwarantuje wykrycie wirusa przy niskiej liczbie kopii
(13), co umoŜliwia wczesne zastosowanie odpowiedniego leczenia przeciwwirusowego. Skuteczność chemioterapii zaleŜy w duŜej mierze od poziomu replikacji wirusa we
krwi (14) i spada wraz z upływem czasu od początku zakaŜenia. Stosowana rutynowo
terapia gancyklowirem, prócz swego działania mielotoksycznego, coraz częściej nie
przynosi poŜądanych rezultatów ze względu na rosnący odsetek szczepów HHV-5
opornych na ten lek (15), jednak nadal jest terapią z wyboru w tzw. leczeniu wyprzedzającym (pre-emptive strategy). Wstępne leczenie powinno trwać minimum 2 tygodnie, dopiero po tym czasie moŜna rozwaŜać oporność wirusa na stosowany preparat.
Lekiem równowaŜnym w leczeniu wyprzedzającym u pacjentów z reaktywacją zakaŜenia HHV-5 po przeszczepieniu komórek krwiotwórczych jest foskarnet, który choć
powoduje wolniejsze narastanie oporności i ma mniejszą mielotoksyczność, niesie za
sobą zwiększone ryzyko nefrotoksyczności (15). Istotne jest więc jak najszybsze ograniczenie podawanych dawek w miarę spadku liczby wykrywanych kopii wirusa.
Uwzględniając jednak częstość reaktywacji HHV-5 u pacjentów po przeszczepieniach
oraz potencjalne koszty leczenia, wskazane jest opracowanie skutecznej metody biologii molekularnej do wykrywania mutacji cytomegalowirusa warunkujących oporność
na stosowane obecnie analogi nukleozydów.
WNIOSKI
1. Testy biologii molekularnej są uŜytecznym narzędziem do wykrywania zakaŜeń o etiologii cytomegalowirusowej u osób z upośledzoną odpornością. Metody ilościowego PCR umoŜliwiają wczesne wykrycie zakaŜenia i odpowiednie zastosowanie
leczenia wyprzedzającego (pre-emptive therapy).
2. Ze względu na rozpowszechnienie HHV-5 w populacji i potencjalne ryzyko
dla pacjentów poddanych immunosupresji wskazane jest ciągłe monitorowanie cytomegalowirusa w tej grupie chorych.
3. Obserwowane równoczesne zakaŜenia pozostałymi herpeswirusami mogą
wskazywać na istniejące pomiędzy nimi oddziaływania synergistyczne.
PIŚMIENNICTWO
1. Minson A C, Davison A, Eberle R et al: Rozdział: Herpesviruses; w Virus taxonomy – clasification and nomenclature of viruses. Seventh report of ICTV. Red. Van Regenmortel MHV, Faquet CM,
Bishop DHL. Wyd: Academic Press, San Diego 2000; 203-225.
2. Griffiths PD, Clark DA, Emery VC: Betaherpesviruses in transplant recipients. J Microb Chem
2000; 45: 29-34
3. Torok-Storb B, Boeckh M, Hoy C, Leisenring W, Myerson D, Gooley T: Association of specific
cytomegalovirus genotypes with death from myelosuppression after marrow transplantation. Blood 1997;
90: 2097-2102.
330 T. DZIECIĄTKOWSKI
4. George MJ, Snydman DR, Werner BG, Griffith J, Falagas ME, Dougherty NN: The independent
role of cytomegalovirus as a risk factor for invasive fungal disease in orthotopic liver transplant recipients.
Am J Med 1997; 103: 106-113.
5. Niederwieser D: Rozdział: Chronic disorders; w Haemopoetic stem cell transplantation. The
EBMT Handbook 2004. Red. Apperley J, Carreras E, Gluckman E, Gratwohl A, Masszi T. Wyd: Forum
Service Editore, Genoa 2004; 257-268.
6. Ljungman P, Urbano-Ispizua A, Cavazzana-Calvo M at al: Allogeneic and autologous transplantation for haematological disaeses, solid tumours and immune disorders: definitions and current practice in
Europe. Bone Marrow Transplant 2006; 37: 439-449.
7. Parody R, Martino R, Rovira M et al: Severe infections after unrelated donor allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in adults: comparison of cord blood transplantation with peripheral blood
and bone marrow transplantation. Biol Blood Marrow Transplant 2006; 12: 734-748.
8. Tse W, Laughlin MJ: Umbilical cord blood transplantation: a new alternative option. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2005, 377-383.
9. Demmler GJ, Buffone GJ, Schimbor CM, May RA: Detection of cytomegalovirus in urine from
newborns by using polymerase chain reaction DNA amplification. J Infect Dis 1988; 185: 1177-1184.
10. Ljungman P, Griffiths P, Paya C: Definitions of cytomegalovirus infection and disease in transplant recipients. Clin Infect Dis 2002; 34: 1094-1097.
11. Hebart H, Jahn G, Sinzger Ch, Kanz L, Hermann Einsele H: CMV Infection in Bone Marrow
and Solid Organ Transplant Patients in the Era of Antiviral Prophylaxis. Herpes 2000; 7: 13-17.
12. Ng AP, Worth L, Chen L et al: Cytomegalovirus DNAemia and disease: incidence, natural history and management in settings other than allogeneic stem cell transplantation. Haematologica 2005; 90,
1672-1679.
13. Schaade L, Knockelkorn P, Ritter K, Kleines M: Detection of Cytomegalovirus DNA in Human
Specimens by LightCycler PCR. J Clin Microb 2000; 38: 4006-4009.
14. Emery VC: Investigation of CMV disease in immunocompromised patients. J Clin Pathol 2001;
54: 84-88.
15. Reusser P, Einsele H, Lee J et al: Randomized multicenter trial of foscarnet versus ganciclovir
for preemptive therapy of cytomegalovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. Blood
2002; 99: 1159-1164.
Praca wpłynęła do Redakcji 1.06.2007 r. i została zakwalifikowana do druku 18.09.2007 r.
Adres do korespondencji:
dr n. wet. Tomasz Dzieciątkowski
Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Akademia Medyczna w Warszawie
ul. Chałubińskiego 5, 02-004 Warszawa
fax: 022 599 17 78
e-mail: [email protected]